体外骨髄由来マクロファージによって髄鞘の残骸の貪食

骨髄由来マクロファージ (BMDMs) は、自然免疫と適応免疫システム間の重要なリンクです。抗原提示細胞 (APCs)、彼らは両方の抗原提示によるリンパ球と通信できるし、サイトカインのリリース^1,2,3。しかし、プロの食、主な機能は病原体、高齢者の細胞および細胞残骸^1,4をクリアします。脊髄損傷 (SCI)、次は、中枢神経系の軸索の髄鞘化⁵担当細胞型死ぬオリゴデンドロ サイトから髄鞘の残骸の相当な量が生成されますように。私たちと他の人は髄鞘の残骸のクリアランスが主に浸潤 BMDMs^5,6、7の責任であることを示しています。しかし、脊髄損傷で炎症状態^5,8,9に向けてこれらの通常抗炎症のセルをシフトさせるサイト髄鞘の残骸の貪食を示唆されています。脊髄損傷における神経炎症の主要メディエーターとして BMDMs、重要な臨床目標です。

脊髄損傷の BMDMs の影響を調査するため、直接 BMDMs と髄鞘の残骸の対応を研究する生体外モデルを開発しました。生物学的関連性を高めるためには、プライマリ マウス BMDMs と新鮮単離髄鞘の残骸の両方はこれらの調査で使用されます。プライマリ マウス BMDMs の分離文化紹介方法についても詳しく説明し、マウス中枢神経系を分離するために使用変更されたショ糖勾配法は髄鞘の残骸^10、11,12派生します。髄鞘の残骸は、蛍光染料、carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE)、BMDMs。 CFSE によってその内面は非細胞傷害性だからこのアプリケーションに適してトラックとその狭い蛍光スペクトル許可で容易にラベル付けできます。その他の蛍光多重^13,14をプローブします。次の貪食、髄鞘の残骸の脂質は、リソソームを経由、細胞内脂質液滴⁵に中性脂質としてパッケージします。この細胞内の脂質の蓄積を定量化するには、オイル赤い O (オロ) 染色法の定量的画像解析の最適化を提案する.この単純な染色法は、堅牢な再現性のある結果と定量化¹⁵を生成します。これらのメソッドは、限られた特殊な設備とミエリンの破片貧食能および脂質保持の研究を促進します。

メソッドここで説明のセクション 2 では、フロリダ州立大学機関動物のケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されているし、ケアと 8^th版実験動物の使用のためのガイドに定めるガイドラインに従います.このプロトコルでは、これのすべての動物は、使用まで専用の実験室の動物実験施設で家をしています。生体内で実験を犠牲にする前に実行がありませんでした。動物の数字は、使用量を最小限に抑えるためにガイドとして平均セルとミエリンのコレクションを使用して実験の必要性に基づいていた。

注:このプロトコルを記述する骨髄由来マクロファージ (BMDMs) (セクション 1) 蛍光に分類された脳由来の髄鞘の残骸 (セクション 2)、髄鞘の残骸貪食 (セクション 3) を分析するための一般的な手順の準備の世代と髄鞘の残骸の脂肪蓄積 (セクション 4) の分析のための一般的な手順です。試薬調製、セルを収穫し操作、ミエリン コレクション、ラベル付け、およびアッセイ パフォーマンスは層流気流バイオ セーフティ キャビネットで完了する必要があります。

1. プライマリ骨髄由来マクロファージの生成

1. 完全なマクロファージ培養培地 (CMCM) の準備
   注:から骨髄マクロファージ世代大食細胞のコロニー刺激因子 (M-CSF) の使用が必要です。この準備は、M-CSF のソースとして L929 マウス線維芽細胞エアコン メディアを利用しています。
   1. 50 mL の高グルコース (4500 mg/L L ブドウ糖) ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 5% 新しい生まれた子牛血清 (NCS) とペニシリン/ストレプトマイシンを 7 日間で 145 mm 皿で培養細胞による L929 マウス線維芽細胞エアコン メディアを生成します。
   2. 3500 × g、4 ° C で 30 分間、50 mL コニカル遠沈管および遠心分離機に文化からメディアを収集します。
   3. 0.2 μ m のシリンジ フィルターを通して培養上清を新しい 50 mL の円錐形遠心管にフィルターします。エアコン メディアは、最大 6 ヶ月間-80 ° C で保存できます。
   4. 高グルコース DMEM、5% 巻/巻 NCS を追加、15% 巻/巻 L929 マウス線維芽細胞エアコン DMEM、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン。メディアは、2-3 か月の 4 ° C で保存できます。使用する前に 37 ° C に暖かい。
2. 主な骨髄細胞とマクロファージ誘導のコレクション
   注:このプロトコルの 1 つのマウスを使用して、約 2000 万骨髄由来マクロファージ (BMDMs) が生成されます。
   1. 8-10 週間の標準的な CO₂窒息ガイドラインを使用して古いマウスは続いて頚部転位の桁数を安楽死させます。
   2. 70% (巻/巻) エタノール: H₂O を使用し、毛皮を飽和動物をサニタイズします。
   3. 腹部に小さな開口部をカットし、基になる組織を明らかにするため皮膚を慎重に引いてください。腹腔穿刺に注意してください。
   4. 両方の後ろ足の股関節から始まると足首で終わるを削除します。場所 5-10 mL 滅菌リン酸を含む 100 mm のペトリ皿に収集した組織緩衝生理食塩水 (PBS) 1% を添加したペニシリン/ストレプトマイシン。
      注:組織の劣化を制限する氷の上の皿を維持するとき確認いくつかの動物を処理します。
   5. メスを使用して骨から筋肉や結合組織を削除します。大腿骨と脛骨のみ使用されますセルのコレクションの腓骨を破棄できます。
   6. メスの各端からの小さなセクションをトリミングすることによって収集された骨の髄腔を公開します。
   7. 25 g の針を使用して、50 mL の円錐形遠心チューブに CMCM と骨髄腔をフラッシュします。骨は、一度十分にフラッシュされている白表示されます。
   8. コレクションが完了すると、単一細胞懸濁液を生成する 30-90 s のための 18 g 針で吸引を振りま します。
      注:この時点で、オプションの赤い血球 (RBC) 換散のステップが行われます。最近、細胞内の鉄分がマクロファージ偏波¹⁶髄鞘の残骸の影響に影響を及ぼすことが示唆されています。赤血球の包含について散のステップは、Trouplinらを参照してください。¹⁷。
   9. 新しい 50 mL の円錐形遠心管に 70 μ m 無菌細胞ストレーナー懸濁液をフィルタ リングします。
   10. 種子は、15 〜 20 mL CMCM を含む 145 mm 細胞培養皿に均等に細胞を収集しました。マウスを犠牲にしたあたりの約 3 つの培養皿を使用します。37 ° c、5% CO₂文化を孵化させなさい。
   11. 72 時間は、非付着性のセルを削除する滅菌 PBS で 1 回プレートを洗って後、15 ~ 20 mL を追加新鮮な CMCM。37 ° C、5% CO₂でさらに 4 日間文化を孵化させなさい。総文化の日の 7 日後、最初に分離した造血骨髄細胞は成熟した BMDMs (図 1) になります。

2. 脳由来の蛍光に分類された髄鞘の残骸の世代

注:すべての試薬は、1 ヶ月の 4 ° C で保存できます。

1. 髄鞘の残骸のコレクション試薬の調製
   1. Tris· を準備します。Cl 緩衝液。
      1. 800 mL 蒸留脱イオン H₂O (ddiH₂O) 追加 1 M Tris· 20 mLCl、ナ₂EDTA (最終濃度が 2 mM) 100 mM の pH 7.45 (最終濃度が 20 の mM) および 20 mL。
      2. 7.45 に pH を調整します。DdiH₂0.2 μ m ろ過ユニットを介して o. フィルター ソリューションと 1000 の mL にボリュームを調整します。
   2. 1 M ショ糖液を準備します。
      1. Tris· 100 mlCl バッファー溶液、ショ糖の 68.46 g を追加。Tris· と 200 mL にボリュームを調整します。Cl 緩衝液。0.2 μ m のろ過装置を通してソリューションをフィルター処理します。
   3. Tris· で 1 M 溶液を希釈することによって 0.32 M ショ糖溶液 200 mL を準備します。Cl バッファー ソリューション 0.83:0.16 (巻/巻)。
   4. Tris· で 1 M 溶液を希釈することによって 0.83 M ショ糖溶液 150 mL を準備します。Cl バッファー ソリューション 0.83:0.16 (巻/巻)。
2. 脳由来の原油髄鞘の残骸のコレクション
   注:ここで説明するコレクション メソッドは、原油髄鞘の残骸の隔離のためです。
   1. 10-12 マウス頚部転位続いて CO₂窒息の標準のガイドラインを使用して年齢の 8-10 週を安楽死させます。
   2. 脳を解剖し、0.32 M ショ糖溶液の 10 mL を含む 100 mm ディッシュに配置します。

3. 髄鞘の残骸貪食アッセイ

注:以下は、蛍光に分類された髄鞘の残骸の貪食能を観察する基本的な方法です。他のトリートメントや実験条件の付加は調査官によって最適化する必要があります。

1. 治療プレートの準備
   1. 各 145 mm プレート 10 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 5-6 mL を使用して 15 mL コニカル遠心管にダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (dPBS) (pH 7.4) の成熟した BMDMs を収集します。
      注:¹⁸細胞のアクティブ化の状態を変えるかもしれないので、トリプシンを使用しないでください。
   2. 集められたセルの各チューブに予め温めておいた CMCM の等しい量を追加します。
   3. 180 x g で 20 ° C で 8 分間遠心上清を捨てます。
   4. 再細胞 CMCM とカウントを中断します。
   5. 24 ウェル細胞培養プレートのウェルに CMCM の 1 mL で 1 x 10 の⁵セルを追加します。
   6. 37 ° c、5% CO₂ 24 時間孵化させなさい。
2. 髄鞘の残骸処理と解析
   1. 100 mg/mL CFSE の 10 μ L (最終濃度が 1 mg/mL) 各ウェルに髄鞘の残骸のラベルを追加します。
   2. 37 ° C、5% CO₂1 3 時間孵化させなさい。
   3. 包まれている非髄鞘の残骸を削除する滅菌 PBS で 3 回プレートを洗います。
   4. 4% のパラホルムアルデヒドの 400 μ L を各ウェルに追加します。室温 30 分間インキュベートします。
   5. 滅菌 PBS で 2 回プレートを洗います。
   6. ヘキスト 33258 ソリューションの 400 μ L を各ウェルに追加します。光から保護された RT で 5 分間インキュベートします。
   7. 滅菌 PBS で 2 回プレートを洗います。
   8. 退色を抑える各ウェルに Tris バッファー フッ素ゲルの 200 μ L を追加します。
   9. 倒立のエピ蛍光ことができる顕微鏡を用いたイメージ セルです。
      注:CFSE の励起・発光波長が 494 nm と 521 nm、それぞれ。
   10. 相対的な髄鞘の残骸取り込みを決定する核の数によって CFSE 陽性細胞の数で割ります。
   11. 画像、前に光から保護 4 ° C で 7 日前までのプレートを維持します。

4. オイル赤 O 染色による細胞内脂質の定量化

注:髄由来の破片の細胞内の脂質を観察する基本的な方法は以下です。CFSE 髄鞘の残骸のラベルの使用はスペクトルの重なりによる染色オロの蛍光定量化のため推奨されません。他のトリートメントや実験条件の付加は調査官によって最適化する必要があります。

1. 汚損の解決の準備
   1. 0.5% オイル赤い O (オロ) の染色液を準備します。
      1. ゆっくりとオロ (攪拌しながら 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) 0.5 g に 100 mL 100% プロピレング リコール (1, 2-プロパンジ オール) を追加します。
      2. 95 ° c 15 分またはすべての大きな粒子が溶解するまでソリューションを加熱します。
         注: 100 ° C 以上に加熱しないでください
      3. 新しいコンテナーにまだ暖かい間、フィルター紙を通じてソリューションをフィルターします。
      4. 室温は、1 年間し、RT。 ソリューションで一晩冷却ソリューションを格納できる許可します。
   2. 85% プロピレング リコール溶液を準備します。
      1. DdiH₂o ・攪拌混合されるまでの 15 mL に 100% プロピレング リコールの 85 mL を追加します。室温は、1 年間にソリューションを保存できます。
2. 治療プレートの準備
   1. 次のセクション 3 で説明する方法 24 ウェル プレートを準備します。
   2. 37 ° c、5% CO₂ 24 時間孵化させなさい。
3. 髄鞘の残骸の治療
   1. (最終濃度が 1 mg/mL) 各ウェルに 100 mg/mL の髄鞘の残骸の 10 μ L を追加します。
   2. 37 ° C、5% CO₂1-3 時間孵化させなさい。
   3. 非消化髄鞘の残骸を削除する滅菌 PBS で 3 回プレートを洗います。
      この時点で、プレートは、即時固定を受けることができるかまたは新鮮な CMCM を追加でき、メモ: 追加の時間ポイントのインキュベーションに返されるセル。
   4. 4% のパラホルムアルデヒドの 400 μ L を各ウェルに追加します。室温 30 分間インキュベートします。
   5. 2 回で滅菌 PBS、染色からプレートを洗います。
4. オロの染色と分析
   1. DdiH₂o. で 3 回固定プレートを洗う
   2. 各ウェルに 100% プロピレング リコールの 400 μ L を追加し、室温 5 分間インキュベート
      注: これは ddiH₂o. のキャリー オーバーを削減
   3. プロピレング リコールを吸引し、オロ ソリューションの 400 μ L を各ウェルに追加します。
   4. 60 ° C で 8 分間インキュベートします。
   5. オロ ソリューションを吸い出しなさい。各ウェルに 85% プロピレング リコールの 400 μ L を追加し、室温 5 minumintes インキュベート
   6. DdiH₂o. で 3 回洗浄プレート
   7. ヘキスト 33258 ソリューションの 400 μ L を各ウェルに追加します。光から保護、常温 5 分間インキュベートします。
   8. 滅菌 PBS で 2 回プレートを洗います。
   9. 各ウェルに Tris バッファー フッ素ゲルの 200 μ L を追加します。
   10. 倒立のエピ蛍光ことができる顕微鏡を用いたイメージ セルです。オロは、標準テキサス赤や下流のフィルター セットを使ってイメージ化されることができます。
   11. 各イメージ フィールドにオロ肯定的な領域を決定する核の数で割って算出して相対的な脂質保持を定量化します。
   12. 4 ° C で 7 日間のプレートは、光から保護を維持します。

CFSE は髄鞘の残骸のラベルと BMDMs の治療は、明確な内部 (図 2) を得られるはず。3 時間作用時間は下流の検出が確実に十分な追加された髄鞘の残骸の貪食に BMDMs のための十分なが、相互作用の 1 時間ほどの細胞内蓄積を観察できます。ただし、いくつかの髄鞘の残骸まだあるかもしれない細胞表面に洗浄後。これは不十分な洗浄またはない貪食の初期の段階で完全に内面化粒子が原因かもしれません。

BMDMs することができます急速に髄鞘の残骸を内面化、ライソゾーム処理オロ染色脂質液滴を形成する前に必要です。BMDMs は示すために、髄鞘の残骸で 90 分間インキュベートし、洗浄し、固定および汚損 (図 3) 前に時間の追加量の培養されました。図 4は、および中性脂質外観と治療開始の遅れがあるを示します。また、文化の中には脂質の保持が不安定をする必要があります。BMDMs は、液滴形成後すぐに蓄積された脂質を代謝する開始されます。など、もはや洗濯離れて非包まれて髄鞘の残骸と固定の間 24 時間以上待機をお勧めします。

オロすすけるエリアの定量化は、BMDMs (図 5) のミエリン脂質代謝の割合を示しています。90 分間相互作用期間に続いて細胞が新鮮な CMCM のインキュベーションに戻されました。新鮮な培地で初期の追跡期間中に、BMDMs は中性オロ染色脂質に貪食髄鞘の残骸脂質を代謝します。オロ肯定的な領域での着実な増加は次の相互作用時間で一般的です。24 時間後ただし、BMDMs effluxed を持っている、または代謝細胞内脂質の重要な部分。

図 1: 代表 BMDM 文化。いくつかの付着性のセルは最初観察します。3 日目、任意の非付着性のセルが削除されます。7 日で成熟した骨髄由来マクロファージが観察されます。スケール = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: BMDM 髄鞘の残骸の貪食の代表画像アッセイします。セルが 1 mg/ml の髄鞘の残骸の洗濯および 4% で固定の前に 1 時間ラベル CFSE 扱われた PFA。内面化された髄鞘の残骸は、エピ蛍光ことができる顕微鏡の標準 GFP フィルタ セットを使用して視覚化できます。スケール = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: オイル赤い O (オロ) 実験的なデザインの図。BMDM は、続いて洗濯と固定する前に新鮮な培地で培養、90 分間、1 mg/mL の髄鞘の残骸 (1: 100 希釈) と扱われます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: オロ染色 BMDM 次の髄鞘の残骸の貪食します。指定した時間点、BMDMs で PFA オロとヘキスト 33258 染色 4% 以下固定。各時点の代表的な画像が表示されます。スケール = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: オロ染色の定量的画像解析します。染色オロの定量化, 3 井戸は 5 枚もの 20 X でイメージしました。すべてのイメージの取得設定は同一であった。誤差 = SEM. (n = 3)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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