HDL 脂質過酸化反応の定量の蛍光細胞生化学アッセイをご紹介します。この迅速かつ再現可能な測定は大規模な研究で HDL 機能を決定するため使用することができ、ヒトの疾患における HDL の機能の私達の理解に貢献することができます。
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この記事について
サマリー
要約
低高比重リポ蛋白コレステロール (HDL-C) は、動脈硬化性心血管疾患 (CVD) の最も強力な独立した否定的な予測因子の 1 つです。HDL-C よりもむしろ HDL の機能と構造は、アテローム性動脈硬化をより正確に予測可能性があります。いくつか HDL タンパク質と脂質組成変化 HDL の機能を損なうことは、動脈硬化症などの炎症性の状態で発生します。HDL 関数通常標準化の多数の欠点不足しているコレステロール排出分析がこれらのアッセイなどの試金に基づくセルによって決定されます。細胞アッセイは、HDL の機能細胞に基づく試金と比較してより強固な対策を与える可能性があります。HDL の酸化は、HDL の機能を損ないます。HDL は、脂質過酸化物の輸送の主要な役割と過酸化脂質の高い金額は HDL の機能異常に関係。脂質プローブの相互作用は、脂質の酸化状態を測定するため試金非酵素的蛍光の結果を解釈するときに考慮されなければなりません。これは内容を査定する HDL 脂質過酸化物 (HDLox) HDL の機能不全に貢献する細胞生化学的酵素法を開発する動機。この手法は酵素西洋わさびの過酸化酵素 (HRP) と螢光色素 (コレステロールオキシダーゼ) なし HDL-C の mg 当たり脂質過酸化物含有量を定量化できます Amplex 赤ここでプロトコルは螢光色素試薬を用いた HDL 脂質過酸化反応の describedfor 決定です。実験条件の厳格な標準化によって試金の変動を削減できます。高い HDLox 値は HDL の抗酸化機能の減少と関連付けられています。このアッセイの読み出しは、心血管疾患、全身性炎症、免疫機能障害、リスク心血管疾患や代謝表現型のサロゲート対策検証セルベースのアッセイのリードアウトに関連付けられます。この技術的なアプローチは、人間の病気、全身性炎症、酸化ストレスおよび酸化脂質 (動脈硬化) などの重要な役割がある HDL 機能を評価する手法です。
概要
動脈硬化性心血管疾患 (CVD) は、死の世界1,2の主要な原因です。疫学的研究は、反比例動脈硬化1,2の開発のリスクに関連付けられている一般的に高密度リポタンパク質 (HDL) コレステロールの低レベルを示しています。いくつかの研究は、HDL1,2のため抗動脈硬化の役割をサポートする HDL 減衰開始とアテローム性動脈硬化の進行メカニズムは複雑な3,4です。このように、複雑な構造と絶対レベルではなく、HDL の機能にはアテローム性動脈硬化5,6,7,8より正確に予測可能性が示唆されています。いくつか HDL タンパク質と脂質組成変化 HDL の機能を損なうことは、動脈硬化症などの炎症性の状態で発生します。これらは....
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プロトコル
大学からカリフォルニア州ロサンゼルス、ロサンゼルス、メルボルン、アルフレッド病院倫理委員会の承諾を倫理、ひと生体試料を用いたすべての実験を行なった
。注: 螢光色素 HDL 機能アッセイ (見なさい議論) 32 の多くのバリエーションがあります。以下最も一貫性と再現性のある結果を与えるプロトコルについて述べる。アッセイの概要は、 図 2 に示すです
。1。 標本処理
(血清セパレーター チューブで収集できる)- 使用、非溶血されました新鮮な血清またはクエン酸血漿 12-14 時間の絶食後に得られます。凍結保存したサンプルを使用している場合に、このプロトコルで説明するよう適切なコントロールが含まれます。 。
2。試金のための日 0 準備
適切なコントロールと実験の- 準備作業レイアウト サンプルし、レプリケートします。少なくともトリプリケートで各サンプルを実行します。代表 96 よくレイアウトを 図 3 に示します 。
- 数のサンプルと複製に基づくアッセイに使用する試薬のすべてのボリュームを計算します
。 注: 特定の....
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結果
各 HDL サンプルの 50 μ L は、各ステップ 7.3 同様に追加されます。5 U/mL (0.25 U) は、各ステップ 7.5 同様に追加される HRP 溶液 50 μ L。サンプルはステップ 7.6 のように 37 ° C で 30 分間培養しました。螢光色素試薬 50 μ L、各ステップ 7.7 (300 μ M の最終的な集中) 同様に追加されます。(暗い) の蛍光の読み出しを毎分 120 分以上蛍光プレート リーダー (530/590 nm フィルター) と 37 ° C で評価します。代表的な蛍光データ空白、プールされた制御のため、知られている機能不全 HDL とサンプルと標準 HDL でのサンプルは、図 4に示すが。生の代表的なデータやプロトコルのセクション 8 で説明した方程式を用いた結果のステップで分析が表示されます表 1.この例では、新鮮な HDL サンプルが使用され、HDLox 値が大きいほど、一般的に新鮮な HDL が得られます。たとえば、機能不全.......
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ディスカッション
ここで説明したプロトコルでは、アテローム性動脈硬化およびひと疾患における HDL 機能の役割について重要な研究の質問に答えるための強力なツールを提供しています。アッセイは、酵素増幅 (HRP) を用いた HDL-C の mg 当たり HDL 脂質過酸化物含有量を定量化します。この方法は使用される電池の種類、報告の読み出しの種類、標準化の欠如と交絡効果に関して重要な不均一性を含む事前 HDL 機能試金 (例えばコレステロールの排出法) の既知の制限事項を回避できます。トリグリセリド7,15,32。HDL の生物学的特性 (例えばコレステロール排出) ではなく生化学的の定量より再現性のある可能性があります。実験的測定間変動 < interassay 実験的変動が多くの場合は HDL 関数の細胞に基づく試金と遜色ない 10% > 15% (または報告されていない)。さらに、このアプローチは、脂質の生化学的な相互作用を制限可能性があります、蛍光.......
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開示事項
このプロトコルとアッセイ特許 PCT/US2015/018147 に関連しています。
謝辞
作者は感謝してこのモデルの以前のイテレーションの開発の重要な役割の Dr モハマド Navab、アラン Fogelman、シュリニヴァーサ ・ レディの仕事を認めます。T.A.A. は、RMIT 大学副-一等書記官のポスドク研究員プログラムによってサポートされます。AJ と AH は、NHMRC プロジェクト助成金 1108792 でサポートされます。TK に支えられて NIH 助成金 NIH K08AI08272、NIH/NCATS グラント # µL1TR000124。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (ポリエチレングリコール) 沈殿試薬 | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red 試薬。 | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. >–20°CC&ブル;乾燥 & 雄牛;DMSOの光から保護します |
| 。 | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. >–20°CC&ブル;乾燥 & 雄牛;軽い |
| セイヨウダイザルペルオキシダーゼ(HRP) | Life Technologies、グランドアイランド、ニューヨーク | A12216 | アンプレックスレッドコレステロールアッセイキット. • ≤–20°CC&ブル;乾燥 & 雄牛;軽い |
| コレステロールエステラーゼから保護します。 | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. >–20°CC&ブル;乾燥 & 雄牛;軽い |
| コレステロールから保護する 参照標準 | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. >–20°CC&ブル;乾燥 & 雄牛;光から保護する |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°CC&ブル;乾燥 & 雄牛;光から |
| 保護します 5x 反応バッファー。 | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. >–20°CC&ブル;乾燥 & 雄牛;光から保護する |
| HDL コレステロール自動試薬 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| 名前 | strong会社 | カタログ番号 | コメント |
| strongプラスチック製品 | |||
| 96ウェルプレート(ポリプロピレン、平底、透明)。 | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96ウェルプレート(ポリプロピレン、平底、黒)。 | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, 滅菌済み | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific マルチチャンネルピペット、8チャンネル、125 | ThermoFisher Scientific Co.、米国カリフォルニア州サンノゼ。 | 14-387--955 | |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| ソフトウェア | |||
| Gen5 2.01ソフトウェア | Biotek、バーモント | 米国 NA | |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| Equipment | |||
| Gen5プレート | リーダーBiotek、バーモント州、 | 米国NA |
参考文献
- Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
- Rubins, H. B., et al.
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再版と許可
