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方法論記事

高密度リポタンパク質の脂質過酸化反応の高スループット測定用無細胞生化学的蛍光酵素試金

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DOI:

10.3791/56325

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2017年10月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

この記事について

サマリー

HDL 脂質過酸化反応の定量の蛍光細胞生化学アッセイをご紹介します。この迅速かつ再現可能な測定は大規模な研究で HDL 機能を決定するため使用することができ、ヒトの疾患における HDL の機能の私達の理解に貢献することができます。

要約

低高比重リポ蛋白コレステロール (HDL-C) は、動脈硬化性心血管疾患 (CVD) の最も強力な独立した否定的な予測因子の 1 つです。HDL-C よりもむしろ HDL の機能と構造は、アテローム性動脈硬化をより正確に予測可能性があります。いくつか HDL タンパク質と脂質組成変化 HDL の機能を損なうことは、動脈硬化症などの炎症性の状態で発生します。HDL 関数通常標準化の多数の欠点不足しているコレステロール排出分析がこれらのアッセイなどの試金に基づくセルによって決定されます。細胞アッセイは、HDL の機能細胞に基づく試金と比較してより強固な対策を与える可能性があります。HDL の酸化は、HDL の機能を損ないます。HDL は、脂質過酸化物の輸送の主要な役割と過酸化脂質の高い金額は HDL の機能異常に関係。脂質プローブの相互作用は、脂質の酸化状態を測定するため試金非酵素的蛍光の結果を解釈するときに考慮されなければなりません。これは内容を査定する HDL 脂質過酸化物 (HDLox) HDL の機能不全に貢献する細胞生化学的酵素法を開発する動機。この手法は酵素西洋わさびの過酸化酵素 (HRP) と螢光色素 (コレステロールオキシダーゼ) なし HDL-C の mg 当たり脂質過酸化物含有量を定量化できます Amplex 赤ここでプロトコルは螢光色素試薬を用いた HDL 脂質過酸化反応の describedfor 決定です。実験条件の厳格な標準化によって試金の変動を削減できます。高い HDLox 値は HDL の抗酸化機能の減少と関連付けられています。このアッセイの読み出しは、心血管疾患、全身性炎症、免疫機能障害、リスク心血管疾患や代謝表現型のサロゲート対策検証セルベースのアッセイのリードアウトに関連付けられます。この技術的なアプローチは、人間の病気、全身性炎症、酸化ストレスおよび酸化脂質 (動脈硬化) などの重要な役割がある HDL 機能を評価する手法です。

概要

動脈硬化性心血管疾患 (CVD) は、死の世界1,2の主要な原因です。疫学的研究は、反比例動脈硬化1,2の開発のリスクに関連付けられている一般的に高密度リポタンパク質 (HDL) コレステロールの低レベルを示しています。いくつかの研究は、HDL1,2のため抗動脈硬化の役割をサポートする HDL 減衰開始とアテローム性動脈硬化の進行メカニズムは複雑な3,4です。このように、複雑な構造と絶対レベルではなく、HDL の機能にはアテローム性動脈硬化5,6,7,8より正確に予測可能性が示唆されています。いくつか HDL タンパク質と脂質組成変化 HDL の機能を損なうことは、動脈硬化症などの炎症性の状態で発生します。これらは i) 減らす、コレステロール排出潜在的な9ii) 抗炎症作用と増加 HDL プロ炎症性蛋白6、7iii) 減少抗酸化因子レベルと活動と Hdl を減少させます。低密度リポタンパク質 (LDLox)10および iv の酸化を抑制する能力) 脂質ヒドロペルオキシド コンテンツおよび酸化還元活性 (HDLox)9,11を増やします。HDL の pleotropic 機能 (コレステロールの排出、抗酸化機能) などを評価する堅牢な試金が HDL-HDL-C クリニックでの定量を補完します。

HDL の機能通常、セルベースの方法コレステロール排出アッセイ8,12,13,14等により評価されます。これらのメソッドには、使用される電池の種類、報告の読み出しの種類、標準化の欠如とトリグリセリド7,15の交絡影響に関して重要な不均一性を含む主要な限界があります。これらの欠点は、大規模臨床研究16の困難をもたらします。細胞アッセイは、HDL の機能細胞に基づく試金と比較してより強固な対策を与える可能性があります。コレステロールの排出は HDL の最も重要な機能の 1 つが、細胞に基づく試金によってのみ決定できます。プロテオミクス17,18,19,20,21,22,など23、HDL の機能を確認する他の方法 24と HDL 機能17,22,25のセルベースの単球走化性アッセイの標準化されていない大規模な人間の研究では使用できません。

HDL が重要な抗酸化抗動脈硬化効果5,6,7,8。HDL の抗酸化機能は、以前携帯無料蛍光アッセイ26で LDL の存在下で決定されています。HDL の抗酸化能をこれらの生化学蛍光メソッドその同僚26とアラン Fogelman モハマド Navab によって開発されました。HDL 機能17,18,19,20,21,22,23 を決定するのにこれらのメソッドを使用している多くの人間研究 ,24脂質 (HDL) ・脂質 (LDL) と脂質螢光相互作用はこれら携帯無料非酵素的生化学的アッセイ HDL 関数27,28の再現性を制限可能性があります。

最近の関心は、脂質および HDL 27,29,30内の蛋白質の酸化の結果である HDL 酸化の機能的な結果を重視しています。先行研究が示されている HDL の酸化 HDL 関数27,29,30を損ないます。HDL は、脂質過酸化物の輸送の主要な役割と過酸化脂質の高い金額は HDL の機能異常に関係。このように HDL 脂質過酸化物含有量を HDL 機能9,17,20,31を決定するために使用、HDL 関数7の前のアッセイの既知の制限を付与できます。 15,27,32, HDL 脂質過酸化物含有量 (HDLox) 32を定量化する代替蛍光法を開発しました。このメソッドは、酵素西洋わさびの過酸化酵素 (HRP) と螢光色素 (コレステロールオキシダーゼ) なしの HDL-C 32mg 当たり脂質過酸化物含有量を定量化できます Amplex 赤に基づいています。アッセイの生化学的原理を図 1に示します。私たちは、この蛍光ベースのアプローチに事前 HDL 機能試金27,28の制限がないことを示しています。この試金をさらに洗練され、凍結プラズマ32,33,34,とも大規模な人間の研究で確実に使えるように、当研究室で標準化35,36,37,38,39,40,41,42このアッセイの読み出しは心血管疾患、全身性炎症、免疫機能障害、心血管疾患や代謝リスク表現型のサロゲート対策検証セルベースのアッセイのリードアウトに関連付けられて。32,33,34,35,36,37,38,39します。 ここでは、HDL の脂質過酸化物含有量 (HDLox) を測定するこの単純な、まだ強力なメソッドについて述べる。この試金することができます、使用することツールとして人間の病気で HDL 機能の役割について重要な研究の質問に答えるため全身性炎症、酸化ストレスおよび酸化脂質32(動脈硬化) など重要な役割。

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プロトコル

大学からカリフォルニア州ロサンゼルス、ロサンゼルス、メルボルン、アルフレッド病院倫理委員会の承諾を倫理、ひと生体試料を用いたすべての実験を行なった

。

注: 螢光色素 HDL 機能アッセイ (見なさい議論) 32 の多くのバリエーションがあります。以下最も一貫性と再現性のある結果を与えるプロトコルについて述べる。アッセイの概要は、 図 2 に示すです

。

1。 標本処理

(血清セパレーター チューブで収集できる)
  1. 使用、非溶血されました新鮮な血清またはクエン酸血漿 12-14 時間の絶食後に得られます。凍結保存したサンプルを使用している場合に、このプロトコルで説明するよう適切なコントロールが含まれます。
    2. 。

2。試金のための日 0 準備

適切なコントロールと実験の
  1. 準備作業レイアウト サンプルし、レプリケートします。少なくともトリプリケートで各サンプルを実行します。代表 96 よくレイアウトを 図 3 に示します
    2. 。
  2. 数のサンプルと複製に基づくアッセイに使用する試薬のすべてのボリュームを計算します
    。 注: 特定の実験の各試薬の十分なボリュームがあるかどうかを確認する各作業入荷追加 10% ボリュームが含まれます
    3. 。
  3. 例えば HDL、HDL-C (オプション) の測定と、fluorochromeassay の分離のためのアッセイのすべての異なるステップに必要なすべてのチューブのラベルします
    4. 。

3。日 1 - コントロールの準備

  1. すべての研究の 研究特定プールされる制御の準備
    1. プールされた血しょうか血清からコントロールのサンプルを作成するサンプルです。3 通の各プレートで 20 個のサンプルを実行する場合は、プール 200 μ L コントロールに各サンプルから 10 μ L を組み合わせます。このコントロールの HDL-C 値を決定する検査にこのプールされる制御の別の因数を与える
      。 注: このプールされる制御を使用して、試金を標準化し、すべての可能な既知のアカウント (例えば凍結, 凍結融解サイクル プラズマ対マトリックス血清型) と実験的変動に影響を与えるかもしれない未知の交絡因子 27 , 28
      2. 。
  2. 研究所固有の品質コントロール (QCs) の準備
    1. 各研究室 (たとえば 5 mL 10 健康なドナーからの血漿から分離された HDL) に HDL の大規模な在庫を準備し、このいくつかの因数を凍結凍結融解サイクルを最小化する株式
      2. 。
    2. 使用、少なくとも 10 の異なる HDLox の平均値を決定するこの在庫からレプリケートします。測定された HDLox の許容範囲の値はそれぞれの試金に含まれている各 QC サンプル アプリケーション内では < のこの平均値の変動係数の 15% です
      3. 。
    3. はこのコントロール (例えば 40 mg/dL) の HDL-C 値を決定する検査にこのプールされる制御の別の因数を与える
      。 注: 詳細なアプローチ血液銀行からの血を使用してこれらのコントロールを作成する方法、以前されて説明 27 , 28 , 32。必要に応じて追加の QCs を使用 (例えば 1 つが HDL 正常と異常主 HDL 機能を持っている知られているドナーから知られている健康なドナーから
      4. 。
  3. バック グラウンド信号と空白値 (オプション) の最適化
    1. 急速に形成された H 2 O を削除する培養液でカタラーゼ (1-4 U/mL) の適切な量を追加、背景を最小限に抑える 2 バッファーの自発的な空気酸化による
      。 注: 空白の井戸 (ない HDL) から値が HDL サンプルの値から引かれるので結果がされている (同じ 96 well プレートに含む) プールされる制御を基準にして報告を見出したこのステップは affec ではなく実質的にt 結果。必要な場合は、カタラーゼを持つバック グラウンド信号の最適化が省略できますしたがって、.

4。HDL コレステロール HDL の沈殿物を使用しての日 1 分離

注: 市販標準化された HDL コレステロールの沈殿試薬を使用して製造元によると枯渇 apoB 血清を分離 ' s指示に従います。これらの試薬は、HDL コレステロールのレベルを決定する比色試金で広きます

。
  1. 血しょうか血清サンプルを新鮮なを使用して (または解凍).
  2. プラズマと HDL コレステロール降下剤 (20 %w/v ポリエチレング リコール グリシン pH 10.0 buffer 内 (25 ° C)) の等しいボリューム (例えば 80 μ L) をミックスします
    3. 。
  3. 上下ピペッティングで混ぜるします
    4. 。
  4. の遠心分離機 x g で 10 分間 1000-2000
  5. (Hdl) 上清を吸引します
    6. 。
  6. は、理想的にすぐに HDL 脂質過酸化反応の fluorochromeassay のための分離の HDL を使用します。ただし、いくつかのサンプルは、同じ日に実行される、HDL コレステロール濃度の測定も行われるなどの手順し 4 ° C で分離された HDL を格納、fluorochromeHDL 機能の試金のため翌日使用します
    7. 。

5。孤立した HDL で HDL-C の日 1 定量

注: これは HDL-C 量で HDLox を正規化する臨床検査から HDL-C の値を使用する場合は省略可能

。
  1. プラズマから HDL コレステロール定量化するため、標準色を使用して 27 の試金します。各ウェル内のコレステロール試薬 50 μ L を追加し、比色板リーダーと各キットで提供されるコレステロールの標準を使用してコレステロール濃度を決定する
    2. 。

6。試薬調製日 2

  1. HRP 5 U/mL の溶液 (範囲 1-10 U/mL) の準備の HRP とコレステロール ソリューションです
    2. 。
  2. 準備 20 mM 螢光色素 (例えば、Amplex 赤) ソリューション: 部屋の温度に螢光色素試薬と DMSO のバイアルを解凍します。使用前に DMSO を 200 μ l 添加の螢光色素試薬 (1 mg) を解散します。保管時に凍結ストック ソリューション ≤-20 ° C、光から保護します
    3. 。
  3. 正と負のコントロールの準備: 1 X ' 反応バッファー ' 正と負のコントロールとして動作してソリューションをそれぞれコレステロールと 20 mM H 2 O 2 なし
    4. 。

7。日 2 蛍光アッセイ

  1. 追加 50 μ L 反応バッファーを空白 (マイナス コントロール) として x 1 の.
  2. オプション: 各板の肯定的な制御として H 2 O 2 の 20 mM 作業ソリューションを追加します
    3. 。 実験的変動を最小限に抑え、試薬とサンプルを加えている
  3. は、一貫して行われていて、タイムリーに別 96 も丸底クリア、ポリスチレンやポリプロピレン プレート (プレート 1) のサンプルのすべての追加を実行します。マルチ チャンネル ピペットを使用して、特定のボリュームを 3 の 96 ウェル プレートに変換 (2-4 のプレート: ポリプロピレン、フラットのボットトム、黒) (同一のレイアウトがある) ( 図 2、 図 3)。
    1. たとえば、最初プレート 1 の各井戸/サンプルに孤立した HDL の 160 μ L を追加しマルチ チャンネル ピペットの使用と HDL コレステロールの 50 μ L から転送ごとの井戸/サンプル黒 96 ウェルのプレートに。ヒント各の行/列の間を変更し、すべての転送のための非フィルターのヒントを使用します
      2. 。
  4. 井戸にサンプルを残します。捨てないでください。試薬の添加の間洗浄ステップがありません
    5. 。
  5. HRP 溶液 5 の追加の 50 μ L を各ウェル U/mL (0.25 U).
    注: 使用螢光色素試薬の付加の前に HRP
    6. 。
  6. 37 ° C で 30 分間インキュベートします。インキュベーション (試薬の付加の間洗浄ステップがないため) 後サンプルを破棄しません
    7. 。 300 の最終的な集中のための fluorochromereagent の追加 50 μ
  7. μ M。この時点で、全反応量は 150 μ L よく混合し、光から保護します。
    8. 。
  8. 評価 (冷暗所) 蛍光読み出し蛍光プレート リーダー (530/590 nm フィルター) と 37 ° C で 120 分以上毎分
    。 注: は、新鮮なサンプルと短い 60 分間隔を使用します。我々 はその 120 分のアッセイ、凍結サンプルを使用して再現性のあるデータを発見した
    9. 。
  9. 適切なソフトウェアを使用してデータを記録します
    10. 。

8。日 3 データ解析

  1. 空井戸を含むすべての試料の螢光色素試薬の付加の後 120 分で蛍光ユニット (任意の単位) を記録し、すべてのコントロール
    2. 。
  2. 蛍光ユニットの平均値を計算する (に基づいて少なくともトリプリケート) (HDL ox_sample)。外れ値を服用しないでください (> 2 平均値から SDs) を考慮します
    3. 。
  3. は、次の式を使用して、バック グラウンド蛍光を減算:
    figure-protocol-1
  4. HDL コレステロール量 (HDL-C) の正規化: HDL - c (プールされたコントロールを含む) の各サンプルに対して HDLox 脂質過酸化値を正規化) (mg/dl)。結果セクションで HDL 牛 は n HDL-C のため調整を反映する (HDL-C) HDLox メジャーとして表示します。次の式を使用します:
    figure-protocol-2
  5. HDLox 脂質過酸化値プールされる制御の値に対する各サンプルの発現を標準化します。プールされる制御の (HDL-C) HDLox 脂質過酸化値 n で n (HDL-C) HDLox 脂質過酸化 (HDL-C の調整) 各サンプルの値を正規化します。結果セクションで HDL ox は実験的変動と HDL-C のための調整を反映して nHDL ox 対策として提示します。次の式を使用します:
    figure-protocol-3
    注: このなど測定の実験的変動を減らすために他の確立された実験アプローチに似ていますが国際標準化比 (INR) 44 , 45 です。このアプローチが検証された臨床研究 32 , 33 , 34 , 35 , 36, 37, 38, 39.
  6. 標準の品質管理試料を用いた実験結果の品質管理を行います。各研究室では、独自の品質管理 (QCs) を確立しなければなりません。理想的には知られている機能不全 HDL とサンプルから nHDLox の QC および健常者 [例えば使用プールからサンプル確立された血液バンクのドナーは、知られている併存疾患とリスクファクターがある若者からのサンプルから nHDLox の QC心血管疾患喫煙を含む]。後者のコントロールは、異なる研究室の中で結果を標準化します。これらの QCs の平均値は、確立されたに基づいて少なくとも 5 複製 (通常我々 はこの重要なステップの 10 の複製を使用して) をされます。
    1. チェック値の予想の範囲内の値を各試金の測定の QCs が持っているかどうか。15% の許容最大実験的変動を仮定すると、すべての測定された実験値は確立された QC の既知の平均値の 15% 以内で落ちる必要があります。次の数式を使用して、:
      figure-protocol-4
      figure-protocol-5
      注: 含まれている品質管理のいずれかのサンプル (場合機能不全 HDL 対通常) (各研究室に設立) 予想の範囲外の値が HDLox を与えます、それから、実験を繰り返します
      2. 。
  7. 実験可変性を定量化するための変動 (CV) 係数を用いた実験結果の品質管理: CV % 値のすべてのサンプルを繰り返し > 15%。次の式を使用します:
    figure-protocol-6
    注: (別の版) の間で測定間実験的変動と測定 (同じ板) 内の典型的な内は < 15% 2) 典型的な。測定内 CV は 1-7% と CV は 3-10% の間の典型的な interassay 間
    8. 。

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結果

各 HDL サンプルの 50 μ L は、各ステップ 7.3 同様に追加されます。5 U/mL (0.25 U) は、各ステップ 7.5 同様に追加される HRP 溶液 50 μ L。サンプルはステップ 7.6 のように 37 ° C で 30 分間培養しました。螢光色素試薬 50 μ L、各ステップ 7.7 (300 μ M の最終的な集中) 同様に追加されます。(暗い) の蛍光の読み出しを毎分 120 分以上蛍光プレート リーダー (530/590 nm フィルター) と 37 ° C で評価します。代表的な蛍光データ空白、プールされた制御のため、知られている機能不全 HDL とサンプルと標準 HDL でのサンプルは、図 4に示すが。生の代表的なデータやプロトコルのセクション 8 で説明した方程式を用いた結果のステップで分析が表示されます表 1.この例では、新鮮な HDL サンプルが使用され、HDLox 値が大きいほど、一般的に新鮮な HDL が得られます。たとえば、機能不全...

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ディスカッション

ここで説明したプロトコルでは、アテローム性動脈硬化およびひと疾患における HDL 機能の役割について重要な研究の質問に答えるための強力なツールを提供しています。アッセイは、酵素増幅 (HRP) を用いた HDL-C の mg 当たり HDL 脂質過酸化物含有量を定量化します。この方法は使用される電池の種類、報告の読み出しの種類、標準化の欠如と交絡効果に関して重要な不均一性を含む事前 HDL 機能試金 (例えばコレステロールの排出法) の既知の制限事項を回避できます。トリグリセリド7,15,32。HDL の生物学的特性 (例えばコレステロール排出) ではなく生化学的の定量より再現性のある可能性があります。実験的測定間変動 < interassay 実験的変動が多くの場合は HDL 関数の細胞に基づく試金と遜色ない 10% > 15% (または報告されていない)。さらに、このアプローチは、脂質の生化学的な相互作用を制限可能性があります、蛍光...

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開示事項

このプロトコルとアッセイ特許 PCT/US2015/018147 に関連しています。

謝辞

作者は感謝してこのモデルの以前のイテレーションの開発の重要な役割の Dr モハマド Navab、アラン Fogelman、シュリニヴァーサ ・ レディの仕事を認めます。T.A.A. は、RMIT 大学副-一等書記官のポスドク研究員プログラムによってサポートされます。AJ と AH は、NHMRC プロジェクト助成金 1108792 でサポートされます。TK に支えられて NIH 助成金 NIH K08AI08272、NIH/NCATS グラント # µL1TR000124。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Experimental Reagents
HDL PEG (ポリエチレングリコール) 沈殿試薬Pointe ScientificH7511
Amplex Red 試薬。Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
>–20°CC&ブル;乾燥
& 雄牛;DMSOの光から保護します
。Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
>–20°CC&ブル;乾燥
& 雄牛;軽い
セイヨウダイザルペルオキシダーゼ(HRP)Life Technologies、グランドアイランド、ニューヨークA12216アンプレックスレッドコレステロールアッセイキット.
• ≤–20°CC&ブル;乾燥
& 雄牛;軽い
コレステロールエステラーゼから保護します。Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
>–20°CC&ブル;乾燥
& 雄牛;軽い
コレステロールから保護する 参照標準Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
>–20°CC&ブル;乾燥
& 雄牛;光から保護する
Resorufin fluorescense Reference standardLife Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°CC&ブル;乾燥
& 雄牛;光から
保護します 5x 反応バッファー。Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
>–20°CC&ブル;乾燥
& 雄牛;光から保護する
HDL コレステロール自動試薬ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.TR39601
名前strong会社カタログ番号コメント
strongプラスチック製品
96ウェルプレート(ポリプロピレン、平底、透明)。Sigma AldrichM0687
96ウェルプレート(ポリプロピレン、平底、黒)。Sigma AldrichM9936
1.5 mL Eppendorf tubesEppendorf0030 125.150
ClipTip 200, 滅菌済みThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.14-488-058
Thermo Scientific マルチチャンネルピペット、8チャンネル、125 ThermoFisher Scientific Co.、米国カリフォルニア州サンノゼ。 14-387--955
名前会社カタログ番号コメント
ソフトウェア
Gen5 2.01ソフトウェアBiotek、バーモント米国 NA
名前会社カタログ番号コメント
Equipment
Gen5プレートリーダーBiotek、バーモント州、米国NA
州、

参考文献

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