方法論記事

大ボリューム、非ひと霊長類におけるオプトジェネティクスの行動に関連した照明

DOI：

10.3791/56330

⸱

2017年10月3日

 ,  ,  , 
1McGovern Institute, Massachusetts Institute of Technology, 2Harvard-MIT Division of Heath Sciences and Technology, 3Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center, 4Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 5Division of Pharmacoengineering and Molecular Pharmaceutics, UNC Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina at Chapel Hill, 6Media Lab and Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 7Department of Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology

この記事について

サマリー

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最小直径と大量の光を提供するための組織貫通照明を構築するためのプロトコルが表示されます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、ヒト以外の霊長類の脳の光遺伝学的操作用に開発された大容量の照明について説明します。照明器具はエッチングされたヒントを変更したプラスチック光ファイバー発光面積は > 100 倍、従来の繊維。大量の照明器具の構造を記述する、に加えてこのプロトコルも光の分布を確認するために使用する品質管理校正を詳細します。さらに、このプロトコルでは、挿入し、大量の照明器具を削除するためのテクニックについて説明します。浅と深い構造を点灯可能性があります。この大量の照明が、電極に物理的に結合する必要はありません、照明器具、ガラスではなくプラスチックで作られているのでそれが単に曲がる状況で伝統的な光ファイバーを破るととき。この照明は、行動関連組織ボリューム (≈ 10 mm3) 従来の光ファイバーより大きい浸透損傷なしに光を提供するため、非ひと霊長類におけるオプトジェネティクスを用いた行動の研究を容易にします。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生理機能や齧歯動物および無脊椎動物の行動を研究するミリ秒精度、光駆動型神経制御を可能にする光遺伝学的ツールが活躍しています。ただし、技術的な課題には、いる齧歯動物の脳1を超える x 数量 100 ~ 非ひと霊長類脳研究の使用が限られています。

2 つの競合する目標に対処するため設計された蛍光灯器具非ひと霊長類における光遺伝学の研究を促進する: 大量の照明と最小限の貫通ダメージ。これらの懸念の 1 つのアドレスに以前の試みは、他の高価で来ています。バンドル ファイバー照らす大きなボリュームが増加の直径と、したがって、ダメージ2,3。テーパー ガラス繊維を減らす狭くフォーカス ライトを発光表面積しますが、侵入被害 < 100 μ m2 4,5。外部脳硬膜にある窓の照明が侵入被害の課題を回避大量照明を許可する可能性があります、いくつかの表面的な脳エリア6のみ使用できます。

大ボリューム ・小径照明 (図 1 a) を作成するには、プラスチック光学繊維は熱のテーパーし、コアとクラッドの先端エッチング (図 1 b, c)。狭いポイントにライトを集中する他のテーパ繊維とは異なり、エッチングは均等に大面積 (図 1 d, e) で光を広く配布するためが、先端側から脱出して光をことができます。侵入被害は浸透径に比例して、この照明は従来繊維よりもないより多くの浸透ダメージをまだそれはので > 1 とより広く表面エリアと提供光発光 x 100/100 光パワー脳ファントム (1.75% の agarose) の密度 (図 1e)。彼らは彼らの発光面として等しい光パワー密度を持っているとき、モンテカルロ モデル (図 1 階) は従来ファイバーと大量の照明器具の光の広がりで違いを示しています。各照明を個別に (図 2 ab) ヒント (図 2 c) も光分布を確保するための積分球を使用して校正します。

この大量の照明器具は、動作と非ひと霊長類におけるニューロンの両方の光遺伝学的操作と検証されています。脳の任意の領域に、それぞれの動物の個々 の受容野マップに、繊維の先端の長さをカスタマイズできます。照明は、照明の長さにわたる神経録音用貫通電極と組み合わせられるかもしれない。さらに、繊維は、可視光の任意の色を運ぶことができます、ために、利用できる利用可能な光分子のいずれかと組み合わせることが。

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プロトコル

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注: 動物のすべてのプロシージャは NIH のガイドラインに従ってされ、マサチューセッツ研究所の技術委員会によって動物のケアに関する承認された

。

1 照明作製

  1. 250 μ m 径プラスチック光ファイバー 10 cm 以上必要な総照明の長さよりも長いであるのセクションをカットする鋭いはさみのペアを使用します。
    2. 。
  2. 22 ゲージのワイヤーストリッパーを使用してプラスチック光ファイバーの一方の端から 15-20 cm のポリエチレン ジャケットを削除します
    3. 。
  3. テーブル万力クランプの繊維のストリップの端のほとんどの 3-5 cm 遠位固定します
    4. 。
  4. は、一定の力で引き続けますとピンと張ったファイバーのジャケットの端を保持します。光ファイバーは、床、副に垂直に平行でなければなりません。加熱と冷却 (手順 1.5 および 1.6 以下)、繊維はそのまま直進し、ピンと張った薄めて全体繊維にこの一定のテンションを維持します
    5. 。
  5. のデュアル温度熱銃 (570/1,000 ° F)、最も低い設定を使用して熱または人間の毛髪の直径約 60-100 μ m の直径に薄めてまで、繊維のストリップのセクション
    6. 。
  6. は、クールな光ファイバーを許可しながら、繊維に一定のテンションを維持します。緊張感を維持するために失敗の原因をカールする繊維です
    7. 。
  7. は、解剖顕微鏡の下で間伐の先端の直径を確認します。代わりに、1 つは代わりにノギスを使用可能性があります。
    1. 場合繊維は十分に薄く、必要な先端の直径を達成するために必要に応じて 1.6 から 1.4 の手順を繰り返します
      2. 。
    2. オプション引いて再場合マークを入れて小さな繊維の最も狭い部分で熱銃の中心ターゲット繊維の最も狭い部分は、再び熱される、場合
      3. 。
    3. 繊維があまりにも薄い場合やり直す
      4. 。
  8. 繊維は完全に冷却し、希望の直径を達成されている、いずれかの側の繊維の最も狭いポイントから 3 cm をピンチします。迅速で鋭い繊維の軸に沿ってプル、テーパーの先端を作成する側面を分離します
    9. 。
  9. は、解剖顕微鏡の低消費電力 (例えば 4 X) の下でテーパーの先端を確認します。先端がフォークまたはカール ( 図 1 階)、繊維を破棄します
    10. 。
  10. 準備公開最後の 5 mm を残して、先端の終わり近くのラボ テープの部分を配置することによってテーパーの先端をエッチングします。テープは、発光の所望の長さ上のエッチングからファイバーを保護します。この先端の長さは、対象地域の霊長類の皮質の厚さに基づいて選ばれました。照明の希望の長さによって長いか短い長さを公開可能性があります。テーパーの先端に近づけたり、遠ざけたりするに、ラボのテープの端を近い移動ことができます異なるエッチング先端の長さが必要な場合です
    11. 。
  11. は、親指と人差し指の間を 5 μ m シリコン カーバイド研磨シートの小さな (~ 1 インチ x 2 インチ) 広場を隠します。ラッピング シートの 2 つの側の間のファイバーの先端を置き、BB を親指と人差し指の間圧延まるで優しく小さな円運動を使用してファイバーをエッチングします。よく繊維を均等にすべての側面をエッチングに回転します。繊維のヒントが表示されます “ 荒く ” 非エッチング エリアは通常滑らかに表示中にエッチングされているエリアの肉眼に目にします
    12. 。
  12. シートをラッピング 3 μ m アルミ酸化物を繰り返しステップ 1.11
    13. 。
  13. は、エッチングの先端の反対側に照明器具の端のコネクタを貼ります。これにより、光ケーブルやレーザーに接続する照明
    。 注:このメソッドは、ガラスを固定するため、推奨される方法異なります/フェルールでシリカ光ファイバー。金属フェルールは研磨の過程で生成される金属の小さな破片としてプラスチック光ファイバー損傷することができます接着後の単位としてファイバーとフェルールを研磨、プラスチック光ファイバーより困難ですのでフラット切断繊維で自分自身を埋め込むことができます。
    1. ポリエチレン ジャケット 22 ゲージのワイヤーストリッパーを使用して照明器具の反対側の端から約 5 mm を削除します
      2. 。
    2. フラット表面を滑らかにする熱いナイフで反対側の端をカットします
      3. 。
    3. フラットひき続いてより良いラップと反対側の端をポーランド語シート: 5 μ m、3 μ、1 μ m、0.3 μ m.
    4. フラットを挿入反対側フェルールの端と同じ高さまで 260 μ m 内径ステンレス製フェルールにします
      5. 。
    5. 視覚的に反対側の端、ファイバー顕微鏡で研磨円滑かつ均等にことを確認します
      6. 。
    6. フェルールから繊維を削除し、テーブルの端に垂直にフェルールを下向き繊維テープします
      7. 。
    7. プラスチック エポキシ 1 mL 注射器で満たし、鈍 18 ゲージ針を注射器に接続します
      8. 。
    8. は、フェルールにダウン エポキシを適用するのに針を使用します。エポキシとフェルールを完全に入力します
      9. 。
    9. ファイバーをフェルールに挿入します
      10. 。
    10. は、必要な場合を乾燥する前に湿った糸くずワイプで繊維の表面から任意の余分なエポキシを拭いてください。12-24 h. 後余分なエポキシを削除ことができますそれ以外の場合、
    11. 校正まで優しく繊維を格納し、フェルールにダスト キャップを配置します
      12. 。

2。照明器具の校正および品質管理

注: のキャリブレーションのためのこれらのメソッドを評価光出力が光ファイバーの先端から異なる距離に非直線性のため。通常に起因する光の偏在、“ でこぼこ ” または “ 波状 ” テーパ

。 光吸収箔 ( 図 2) を使用して、積分球の上部に
  1. 光シールドを作成するダイヤフラム
    。 注:光の反射の汚れを作成するから油の処理光肌を防ぐために箔を吸収するたびに手袋を着用します。
    1. 倍 2 ” 4 ” 自体、2 を形成する上に箔を吸収する光の作品 ” x 2 ” 広場別の方法は、2 カット、” x 2 ” 吸収側 1 つの光と反射面 (すなわち 1 つの光の広場。、標準的なアルミ箔の側);しかし、折り畳み式のメソッドは、次のステップで横隔膜の取り扱いの鈍いエッジを提供するため、安全です
    2. ラボまたは折り畳まれて非エッジをバインドする正方形のエッジに沿って電気テープを折る。これが両側を一緒に保持し、シャープなエッジからの削減に対する保護します
      3. 。
    3. 26 ゲージの針を使用して正方形の中心に穴をあける
      4. 。
    4. 積分球からキャップの大きいネジを外し、ダイヤフラムに開口部をカバーします。中心に穴を配置します。横隔膜が光吸収 1 つと 1 つの光の側面を反映して作成された場合を吸収側光と光の反射を積分球の内側に直面している側を配置します
      。 注:積分球に入るからほこりや破片を防ぐために、穴の中心を保つために、ラボのテープで積分球の外側にダイヤフラムをセキュリティで保護します
      5. 。
  2. 測定光マイクロマニピュレーターまたは固定アームと積分球を使用して 500 μ m 刻みの先端に沿って出力します
    。 注:レーザーが存在するときに、適切な波長の安全ゴーグルを着用ください。
    1. レーザーや光ファイバーの反対側の端に接続ソース、しかし、まだ出力光をトリガーされません
      2. 。
    2. 脳定位固定ホルダー (原石に照明を確保します。ラボ テープ rably) ホルダーの下 7-10 mm の先端と
      3. 。
    3. ネジ固定の腕に固定ホルダー
    4. は、ダイヤフラムの中心の穴に照明器具の先端を合わせます。先端がダイヤフラムと同じレベルにあるとき、マイクロマニピュレーターをゼロします
      5. 。
    5. に部屋のライトをオフ、積分球は 0.
    6. レーザー (または他の光源) をトリガーし、積分球を用いた出力合計の光パワーを測定します
      。 注:キャリブレーション テスト可能な最低の光出力を使用します
      7. 。
    7. 積分球と繰り返しステップ 2.2.6 繊維 500 μ m を下げる
      8. 。
    8. 続ける積分球に繊維を下げると電力光レベル オフまで 500 μ m 刻みで全光束を測定
      注意:総光全体の先端が球に一度レベル。繊維を下げるため続行しないでください、エッチングを超えて 1-2 mm 以上長さのヒントします。積分球の底を先端に接触する場合、溶融/または積分球を台無しにする可能性があります
      9. 。
  3. 総光の直線性を確認するために積分球までどのくらいの繊維の機能が下がった出力電力をプロットすることによって均等にエッチングの繊維を確認します
。

3. 体内 照明

注: これらのメソッドが表示されますここでは、ヒト以外の霊長類ではなく、プラスチック モデルを使用します

。
  1. 25 mm 径記録室は、実験前に利益の脳領域に移植されたインプラント
    2. 。
  2. は、実験前に解剖学的の磁気共鳴画像 (MRI) を実行します。商工会議所内カスタム記録グリッドを置き、グリッドの可視化と硬膜とターゲットの脳構造のレベルの決定を許可する生殖不能外科潤滑油を入力します
    3. 。
  3. は、各テスト セッションの前にタワーのマイクロ ドライブを準備します。
    1. 接辞ドライブの真ん中に上下斜めのヒントと 25 ゲージ ガイド チューブにクランプします。2 つのクランプを使用ガイド チューブがストレートであることを確認します。必要な場合、手動でこれらのクランプの両方移動できます
      。 注:ガイド チューブを epoxied またはクランプにはんだ付けがあります
      2. 。
    2. は、同じドライブ上に上型クランプで大量の照明器具を固定します。このクランプは駆動モータに接続されています
      3. 。
    3. ガイド チューブを介して大容量の照明を完全にスレッドし、過去のガイド チューブの先端照明器具の先端を拡張することを確認します
      。 注:経由で MRI ガイド チューブの先端として硬膜からターゲットの脳の領域の下端までの距離に等しい過去を拡張する照明の長さは決まります
      4. 。
    4. ガイド チューブと照明 (例えば クロルヘキシジン) を消毒する消毒液に漬します
      5. 。
  4. クリーン室の内部カスタム滅菌グリッドを置き、部屋の側面のネジであらかじめ指定された向きで固定します。ここで表示されるグリッドが 1 mm 間隔;必要に応じて、ただし、間隔をカスタマイズできます
    。 注:これはグリッドおよび解剖学的 MRI で使用される方向と同一にする必要があります
    5. 。
  5. 事前に決められた方向に録音室に定位のマイクロ ドライブ ホルダーをセキュリティで保護します
    6. 。
  6. は、滅菌、鈍い鉗子を使用して照明器具を引いてガイド チューブから滅菌照明を撤回します。照明器具の先端は、ガイド チューブの先端の上の 5-10 の mm をする必要があります
    。 注:照明器具は、ガイド チューブとクランプの間外側弓でしょう。柔軟な照明破壊はしません
    7. 。
  7. ホルダーにマイクロ ドライブを添付し、ターゲット グリッドの穴にガイド チューブを配置します
    8. 。
  8. マイクロ ドライブ ステージを下げるは、ガイド チューブが硬膜のレベルを通してちょうどまで
    。 注:に応じて、電極を 2 番目のマイクロ ドライブをステージに配置、低下に別のグリッド穴することができます。この電極に潜在的なローカル フィールド照明配置を確認するための距離依存性の光アーティファクトが表示されます
    9. 。
  9. と下照明器具手動で滅菌ピンセットで。
    1. 、任意の抵抗がある場合は撤回照明 5 - 10 mm、待機を解決し、もう一度やり直してくださいする組織を許可する 10 分
      2. 。
    2. まだ 2 番目の試みに抵抗がある、照明のヒントをガイド チューブに、低いガイド チューブ 0.25 ミリメートル、やり直してリトラクトします
      3. 。
    3. 何の抵抗もなくガイド管を通して照明器具スライドまで繰り返します
      4. 。
    4. は、ピンと張ったまで照明を下げる
      。 注意:抵抗に対して強制的に照明を押し込まないでください。これらのケースでガイド チューブ通常浸透しているない硬膜完全に。繊維を力強く押すことそれ自体の繊維から脳に入るとおそらくヒント ( 図 1 g) を破壊することを防ぐことを曲げるになります
      5. 。
  10. 拡大光学系を設定またはレーザーにフェルール照明器具のもう一方の端を接続します
    11. 。
  11. 光が非ひと霊長類に表示されていないことを確認してください。
    1. ブラック アウトのシールドを使用または記録塔を完全に包含する箔を吸収光します
      2. 。
    2. の光箔を吸収できたシールドの封筒ですべての光ファイバー接続を配置します
      3. 。
    3. どちらかの光箔や黒の絶縁テープを吸収にすべてのパッチ ケーブルをシールドします
      4. 。
    4. 追加の予防措置としておとりの発光ダイオード (LED) 銀行非ひと霊長類の後ろに実験で使用される同じ光の色を配置し、2.5 Hz で Led に点滅し続ける。これは、目が闇に完全に適応するを防ぎます。このライトが点滅が行動のトリガーとしてからのリークを防ぐために役立つだろう、不注意な光漏れがあった場合
      5. 。

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結果

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ヒト以外の霊長類の大脳ボリュームの照明は行動に関連した光遺伝学的操作のためことができます。Acker さんら(2016) ハロロドプシンの赤いシフト、2 アカゲザルにおける記憶誘導性サッカード発生する前頭眼野 (FEF) の一時的な貢献を研究する顎7でこの大量の照明器具を使用します。具体的には、FEF ニューロンを顎を含むウイルスのベクトルを注入され、適用先のプレゼンテーション、遅延期間の記憶誘導性眼球運動準備期間のいずれかの中に大量の照明器具を使用して赤い光で照らされています。8します。図 3に実験条件を示します。エラー率 (例えば、適切なターゲットの場所に記憶誘導性サッカードを実行する失敗) 注入受容野のターゲットではなく、不活化のサイトに反対ターゲットの照明で大幅増加/照明(図 4 a)。

光遺伝学による行動の変化に加えて大量照...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

病気および齧歯動物の生理学を研究する光遺伝学的ツールが広く使用されますが、照明の大脳ボリュームの技術的な課題は非ひと霊長類におけるオプトジェネティクスの使用を制限されています。おそらく小さなボリュームを照らす大きな光パワー密度 (20 W/mm2~ 100 mW/mm2 ) を使用サルの研究の先駆的な < 1 mm3、および皮質4、興奮のオプシンと報告されたささやかな行動への影響 9,10,11と12の丘で抑制オプシン。

したがって、大量の照明器具は、大規模な組織ボリュームへ光の配信を許可する開発されました。この照明と赤いシフト ハロロドプシン、顎、堅牢な生じるドライブ動作で認められた非ひと霊長類

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謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LCA は、NDSEG ・ フェローシップ、NSF GRFP とマクガバン研究所の友人からの資金を認めています。EP は、ハリーとユーニス野原支給基金、1995 支給基金の MIT クラスと MIT 支給基金の資金を認めています。ESB は、NIH 2R44NS070453 03A1、IET ハーヴェイ賞とニューヨーク幹細胞財団・ ロバートソン賞からの資金を認めています。RD は、NIH の EY017292 からの資金提供を認めています。マイケル ・ ウィリアムズ整理、撮影前に消耗品を収集してチームに貢献しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
プラスチック光ファイバー光ファイバーSK-10250ミクロンの直径、スーパーエスカラインワイヤー
ストリッパークラインツール1104722ゲージ
バイスクランプウィルトン11104一般的なテーブルマウントバイスクランプ
温度ヒートガンミルウォーキー8975-6570 / 1,000 °F
ラボマーカーVWR52877
解剖顕微鏡VistaVision82027-156実体顕微鏡 w/デュアル白熱灯、2倍/4倍倍、VWR
ラボテープVWR89097-972バイオレットカラーの4パックから入手可能、ただし、テープの色は関係ありません
化ケイ素ラッピングシートThorLabsLF5P5ミクロングリット、10パック
酸化アルミニウムラッピングシートThorLabsLF3P3ミクロングリット、10パック
酸化アルミニウムラッピング シートThorLabsLF1P1ミクロングリット、10パック
焼成アルミナラッピングシートThorLabsLF03P0.3ミクロングリット、10パック
ホットナイフ工業用光ファイバーIF37001260ワット、ヘビーデューティ
ファイバー検査スコープThorLabsFS201オプション
ステンレス鋼フェルール精密光ファイバーMM-FER2003SS-265265 ミクロン 内径
1 mL シリンジBD14-823-30ルアーロックチップは、漏れのリスクを減らすために好ましいですが、厳密には必要ありません
プラスチックエポキシ工業用光ファイバー40 0005
18 ゲージ 鈍い針BD3051801.5インチの長さ
糸くずの出ないワイプ (KimWipe)ベンダーから入手可能なThorLabsKW32
光吸収箔ThorLabsBKF12
電気テープ3MTemflex 1700オプション、他のブランド/モデルの代わりになる場合があります
26ゲージの鋭い針 BD3051110.5インチ長さ
マイクロマニピュレーターSiskiyou70750000E他のブランド/モデルを置き換えることができます
Sterettactic アームKopf1460ブランド/モデルを置き換えることができます
レーザー安全ゴーグルKenTeKKCM-6012は、ここに示す例、レーザー
または他の光源vortranを使用して、レーザーの色に基づいて選択する必要がありますStradus 473-50青色レーザーの例
積分球ThorLabsS142C付属のパワーメーター、ThorLabsからも入手可能、アイテム #PM100D
Ultem レコーディングチャンバークリスト機器会社6-ICO-J0アライメントノッチでカスタマイズ
クランプ付きタワーマイクロドライブNANDRTBL-CMS
ガイドチューブカスタムN/A25ゲージの脊髄針(BD)または鈍器チューブで作られています
NANドライバーシステムNANNANDrive
カスタムグリッドデザインカスタムプランご要望に応じて利用可能
鈍い鉗子FischerScientific08-875-8A一般的なステンレス鋼鈍い鉗子
デジタルノギスNeiko01407Aamazon.com でご利用いただけます。より正確な測定のために、より細かい解像度のキャリパーを選択することができます。
パッチケーブルThorLabsFG200LCC-customこれは、多くの可能なパッチケーブルの一例です。ファイバー径が大容量イルミネーターのファイバー径以下であり、コネクタインターフェースが点灯している限り、このアプリケーションには任意のパッチケーブル(ガラスまたはプラスチック、ベンダーが購入またはラボで製造)で問題ありません。
透明なプラスチックダストキャップThorLabsCAPF25
セラミックスプリット嵌合スリーブFiber Products、Inc.SM CS1140S
工業用デュアル炭多くのの 他のカスタムのパッケージPrecision

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Tamura, K., et al. A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures. J Neurosci Meth. 211 (1), 49-57 (2012).
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