肺転移アッセイを用いた骨肉腫の肺転移を植民地化の勉強に実用的な考慮事項

Summary

この記事の目的は、肺転移アッセイ (プーマ) のプロトコルの詳細な説明を提供するためにです。このモデルは、広視野蛍光または共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して肺の転移性骨肉腫 (OS) 細胞の成長の研究に研究を許可します。

Abstract

肺転移アッセイ (プーマ) は、肺植前のヴィヴォと閉じた細胞培養系蛍光顕微鏡による骨肉腫 (OS) で肺を植民地化の生物学を研究する研究者を許可します。この資料では、プロトコルの詳細な説明を提供し、広視野または共焦点蛍光顕微鏡のプラットフォームを使用して転移の成長上の画像データを得るの例について説明します。プーマ モデルの柔軟性により、肺微小環境の OS 細胞の成長だけでなく研究にも時間をかけて抗転移治療の効果を評価する研究者です。共焦点顕微鏡による肺実質と OS 細胞相互作用の前例のない、高解像度のイメージングが可能です。また、プーマ モデルを蛍光色素や蛍光タンパク質遺伝子記者と組み合わせれば、肺微小環境、細胞および細胞レベル下の構造、遺伝子機能および転移の OS 細胞におけるプロモーター活性研究者の研究することができます。プーマ モデルは、骨肉腫の研究者から新しい転移生物を発見し、新規抗転移、ターゲットを絞った治療法のアクティビティを評価するための新しいツールを提供します。

Introduction

転移性骨肉腫 (OS) の小児患者に対する改善結果重要な満たされていない臨床必要性¹が残っています。これは、新しい分子標的療法の開発の重要性を強調します。ターゲット腫瘍細胞の増殖転移性疾患, とこのように新しい戦略の治療に有効であることを証明されていない従来の化学療法は²転移プロセス自体をターゲットする必要があります。現在の記事、メンドーサと同僚³、新しい発見に有用なツールを提供するによって開発された肺転移アッセイ (プーマ)前のヴィヴォ肺転移モデルの比較的新しいタイプの実用的な側面をについて説明しますOS ^4,5で肺転移の進行で分子のドライバー。前に、しかし、転移、いくつかの現在のモデルは簡単に触れることが賢明だろう、試金する方法プーマ モデルは従来の in vitroでのいくつかの利点を提供しています。

特定のステップまたは転移の翼列のいくつかの手順を要約の in vitroとin vivoの系の転移を研究に使用される最も実験的モデルを構成します。これらの手順が含まれます: セカンダリ サイト、4) 血管外漏出およびセカンダリ サイト、5) 形....

Protocol

画像データが得られた動物のすべてのプロトコルを動物愛護や国立がん研究所の利用委員会、国立衛生研究所の承認を得て行った。説明ビデオの資料に描かれているすべての動物プロトコルは、ブリティッシュ コロンビア大学動物の世話委員会によって承認されています。

1. 注入とプーマのモデルのための材料の腫瘍細胞の準備

注: ソリューションおよび細胞量 1 マウスの十分であります。以上のマウスの研究で使用される場合、必要に応じてスケール アップ。メディアのレシピは、表 1と表 2を参照してください。

1. 中古 A メディア 37 ^oC の水のお風呂に 15 mL の円錐管に 5 mL を温めます。
2. 1.2% 低融点アガロース ソリューション (滅菌水) ラボ電子レンジを使用してを溶かします。
3. 溶融 agarose の 5 mL を 15 mL の円錐管に転送し、37 ^oC の水浴で保温します。37 ^oC と肺吸入工程の前に液体に溶かしたアガロースを確認します。
4. 細胞培養グレード氷バケットに 1 X ペン/球菌を添加した PBS の事前チル 30 mL。
5. 6 ウェル プレートの 1 つも前 B メディアの 1.5 ....

Results

低倍率広視野蛍光顕微鏡

プーマ肺のスライスの広視野蛍光顕微鏡、代表的な画像と定量化データは図 2、および図 4 aとBで示されています。高と低転移細胞の転移の性癖は進行時間のポイントを視覚的に明らかにされます。効率的に、MNNG セルは、HOS 細胞がすべて育つことができないに対し肺組織を植民地化できます。画像解析から図 4 bのグラフで示すように、時間をかけて成長を評価する定量的なデータを取得できます。1 つのイメージで全体の肺のスライスをキャプチャするために低倍率 (2.5 X) で取得お勧めします。このメソッドは、大きい番号のプーマ スライスのバッチ画像処理を許可します。

Discussion

次の技術資料では、OS で肺を植民地化の勉強にプーマのモデルのいくつかの実用的な側面について説明します。研究者が細心の注意を取る必要がありますプロトコルのいくつかの重要なステップは次のとおりです。

) の気管カニューレ装着。気管は、周囲の筋肉や結合組織を解剖しながら簡単に破損することができます。さらに、カテーテルの針は気管を通じて簡単にプッシュできます。カニューレを挿入するときに、針のベベルが気管を入力する方法に細心の注意を払います。

b) 穴をあけるか、肺の表面を損傷します。肺を簡単にパンクしたか胸骨を除去し、胸腔内を公開するはさみを解離性大破損することができます。胸腔内から抜くうち解離性に注意します。穴をあけるまたは肺の表面の損傷、液体アガロース/A-メディアに漏れ出してと肺はデフレートされます。

c).をイメージしながら余分なメディアを肺セクションから削除します。周囲の肺セクション余分な液体メディアは、顕微鏡下で見たときは、「ミラー」効果を引き起こ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
表 2
細胞培養試薬 A-media, B-media, and complete media
MNNG-HOS	ATCC	CRL-1547	高転移性 OS 細胞株
HOS	ATCC	CRL-1543	低転移性 OS 細胞株
MG63.3	Amy LeBlanc Laboratory (NCI)	N / A	高転移OS細胞株
MG63	ATCC	CRL-1427	転移OS細胞株
10X M199培地	サーモフィッシャー	11825015	A培地およびB培地用ベース培
地蒸留水(滅菌済み)	サーモフィッシャー15230-147A		培地のコンポーネント&B媒体
7.5%重炭酸ナトリウム溶液	サーモフィッシャー	25080094	A媒体の成分&B-media
ヒドロコルチゾン	Sigma-Alrich	H6909	A-media のコンポーネント &B-media
酢酸レチノール-水溶性	Sigma-Alrich	R0635-5MG	A-mediaのコンポーネント &B-media
ペニシリン/ストレプトマイシン 10X 濃縮 (10000 U/ml) 溶液	サーモフィッシャー	15140122	A-media の成分 &Bメディア、コンプリートメディア。
ウシインスリン溶液(10mg / ml)	シグマアルリッチ	I0516-5MLA-media	のコンポーネント&B-media
DMEM、高グルコース	サーモフィッシャー	11965092	完全培地のベース培地
L-グルタミン(200 mM)	サーモフィッシャー	25030081	培
ウシ胎児血清	サーモフィッシャー	16000044	完全培地の成分
Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水	サーモフィッシャー	14190144	細胞培養に使用されます。
ハンク緩衝塩溶液、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし	サーモフィッシャー	14175095	注射前に細胞ペレットを再懸濁するために使用されます
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド	サーモフィッシャー	25200114	細胞培養に使用されます。
DAR4M	Enzo	ALX-620-069-M001	肺実質の標識に使用されます。
名前	会社	カタログ番号<	strong>コメント
strong表3
PuMA
Zeiss 710共焦点LSM	の		顕微鏡
ツァイス 780 共焦点 LSM	ツァイス	N/A	倒立LSM共焦点顕微鏡
SCIDマウス	チャールズリバー	N/A	NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl、女性、生後6-8週
GelFoam	Harvard Apparatus	59-9863	肺組織切片のサポートとして使用されます。
SeaPlaque Agarose	Lonza	50100	肺の気腹治療中に使用されます。
27ゲージ針付き1mlシリンジ	フィッシャーサイエンティフィック	14-826-87	尾静脈注射に使用されます。
10mlシリンジ	BD	309604	肺の送気に使用されます。
20ゲージカテーテル	テルモ	SR-OX2032CA	肺の気腹時に使用されます。
アボットIVエクステンションセット(30インチ、滅菌済み)	Medisca	8342	肺の気腹中に使用されます。
アルコールスワブ	BD	326895	注射前に尾静脈を拭くため
滅菌手術用手袋	フィッシャーサイエンティフィック	サイズにより異なる	マウスの肺の懐疑的な取り扱い
30cm定規	ステープル		肺の気通しに使用されます。
定規	Pipette.com	HS29022A	肺の送気に使用されます。
35mmガラス底培養皿	イビディ	81158	肺スライスのイメージング中に使用
防水防湿バリア付き吸収性アンダーパッド	VWR	56617-014	生物学的フードの滅菌作業領域を裏打ちするために使用されます。
Catgut Plain Absorbable Suture	Braun	N/A	カニューレ付き気管を縛るために使用されます。
名前	strong<>会社	カタログ番号	コメント
Table 4
PuMA用手術器具
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/	Sharp Roboz	RS-5910	肺切片切断用
4インチ(10センチ)ロングセレーションストレートエクストラデリケート0.5mmチップ	ロボズ	RS-5132	肺部分の操作/保持用。
4インチ(10センチ)長い鋸歯状のわずかなカーブ 0.8mm Tip	Roboz	RS5135	肺部の操作/保持用。
親指ドレッシング鉗子;鋸歯 状;弱い;4.5インチの長さ。1.3mmチップ幅	Roboz	RS-8120	一般解剖用。
親指ドレッシング鉗子 4.5インチ 鋸歯状 2.2mm 先端幅	Roboz	RS-8100	一般的な解剖用。
極細マイクロ解剖ハサミ 3.5インチ ストレートシャープ/シャープ、20mm刃	ロボズ	RS-5880	一般的な解剖用。
ナップハサミ;直;シャープ-ブラント;27mmのブレードの長さ;全長4インチ	Roboz	RS-5960	一般的な解剖用。