Method Article

デジタル ホログラフィー顕微鏡 (DHM) を用いた低濃度で微生物の定量化

DOI:

10.3791/56343

⸱

November 1st, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Engineering, California Institute of Technology, 2Department of Earth Sciences, University of Southern California, 3Jet Propulsion Laboratory, California Institute of Technology

In This Article

Summary

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デジタル ホログラフィー顕微鏡法 (DHM) は、50 〜 100 倍焦点と明視野顕微鏡に匹敵する解像度よりも厚い実行画像サンプルを後処理により体積手法です。ここで DHM はカウントの識別に使用する、および低密度と光学密度計測、プレート カウント、直接カウントと比較して非常に微生物を追跡します。

Abstract

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正確に検出し、まばらな細菌のサンプルを数える医療診断、他の惑星や太陽系の衛星にロボット ミッションによる生体検出、食品、飲料、医薬品加工業の多くのアプリケーションには。現在、文化のめっきや落射蛍光顕微鏡によるスパース細菌サンプルがカウントされます。培養皿を必要とする長いインキュベーション時間 (数日数週間から)、および広範な染色とサンプルの濃度、落射蛍光顕微鏡が必要です。ここでは、軸外デジタル ホログラフィー顕微鏡法 (DHM) を使用して、非常に希薄文化 (100 104セル/mL) 中の細菌を列挙する方法を示します。まず、カスタムの DHM の建設は、建物の低コスト計測器についての詳細と一緒に議論されています。ホログラフィーの原理は、説明、およびビデオにする必要がありますどのくらいの時間を推定する統計モデルを使用計測器の光学特性と (表 2) の細菌の溶液の濃度を基にセルを検出します。.10 セルのビデオ検出5104103、および 100 細胞/mL、非再建されたホログラムを使用してリアルタイムに示されて。振幅と位相像の再構成は、オープン ソースのソフトウェア パッケージを使用して示されています。

Introduction

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非常に希薄サンプルで正確な細菌数の決定は多くのアプリケーションで重要である: 少数の例は水と食品品質解析1,2,3;血液、髄液、または喀痰4,5で病原体の検出滅菌水6; を含む医薬品の生産オープン海堆積物7,8,9などの低栄養環境で環境社会分析。木星や土星、特にヨーロッパ10、11エンケラドス12,13,の氷衛星における現存する微生物生命の検出に対する興味も高まっています14、地下の液体の海を持っている知られています。別の惑星で現存する生命を発見する 1978 年バイキング以来ミッションがないので、....

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Protocol

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1。 成長と列挙体の細菌

注: これは、ほぼすべての菌株の適切な媒体 36 で栽培に適用。例では、我々 は 3 系統を使用: 一般的な簡単な個人ラボひずみ; として セラチアより小さく、高運動性環境負担、シェワネラ oneidensis 氏 1。検出を比較するには、対非運動性細胞、変異体 シェワネラ 非運動性、Δ 運動 FlgM、また使用されます比較 37。ホストゲノム スープ (LB) ですべての株が栽培されています

。
  1. 準備滅菌 LB 培地 (蒸留水 1 リットルあたり: バクト トリプトンを 10 g、5 g バクト酵母、10 g 塩化ナトリウム; フィルターまたはオートクレーブ)。標準 100 mm 径 LB 寒天培地プレート (同じ培地を加えて 1 リットル当たり 15 グラムの寒天レシピ; オートクレーブ (121 ° C、20 分) を殺菌し、注ぐときに処理するために十分に涼しい) を準備します。冷蔵庫の中、板を格納します
    2. 。
  2. 実験前日シード 5 6 mL の " マスター " 培地から新鮮な細菌のコロニーは、正しい滅菌とバイオ技術を使用して。〜 12 h. インキュベーション時間はひずみと成長率に依存するため、30 ° C でシェーカー (120 rpm....

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Results

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結果は、DHM によって、非常に低いレベルでの生活、死んで細菌を検出する能力を示す必要があります。細菌カウント数はピープル ハウザー カウント室とプレート カウントを使用して得られた結果と一致してはずです。標準的な統計的手法は、様々 な細菌濃度の異なる検出法の精度についての情報を提供します。

図 1は、細胞の直接列挙体で使用されるカウントの商工会議所の組織だけでなく、使用されるピープル Hausser カウント商工会議所を示しています。図 2 aは、十分な許可された典型的な濃縮培養プレートを示していますs. の marcescensコロニー (室温で 16 時間) を成長するための時間。図 2 bは、使用されるすべての系統の成長曲線を示しています。外径

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Discussion

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ホログラムの数値復元: ホログラムの数値復元、角度スペクトル法 (ASM) が使用されます。DHM のグリーン関数とホログラムの畳み込みが含まれます。特定焦点面での映像の複雑な波面は、次のようにフーリエ畳み込み定理を用いて計算できます。

figure-discussion-1(1)

どこfigure-discussion-2フーリエ変換演算子は、figure-discussion-3ホログラム行列とfigure-discussion-4として定義されている DHM の緑の機能です。

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Disclosures

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著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

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著者は、この作業を資金調達のためカリフォルニア工科大学に 4038 とベティ ・ ムーア財団助成金 4037 ゴードンを認めます。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
バクト酵母BDバイオサイエンス212750
クトトリプトンBDバイオサイエンス211705
塩化ナトリウムグマアルドリッチ7710購入のための多くのオプション
バクト寒天BDバイオサイエンス214010
10センチメートルシャーレVWR10053-704
15mL培養チューブファルコン(コーニングライフサイエンス)352002ルーズキャップ付き
ペトロフハウザーチャンバー電子顕微鏡科学3920
10 mLシリンジBD バイオサイエンス309604ルアーロックチップ不要
オス ルアーから1/16インチへのバーブフィッティングマクマスターカー51525K291
オートクレーブ可能 1/16インチID 流れ用PVCチューブNalgene8000-0004長さで販売、それに応じて購入
シリンジポンプハーバード装置PHD 2000
サンプルチャンバーカスタムn/a材料セクションを参照
ホログラフィック顕微鏡カスタムなし / aウォレスらを参照してください。
オープンソースソフトウェアカスタムhttps://github.com/bmorris3/shampoo
バシ

References

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  1. Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
  2. Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
  3. Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R.

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