この記事では、大型無菌免人間住血吸虫マンソン住血吸虫の自由遊泳性の miracidia のコレクションのためのプロトコルおよび生体外の文化への導入、後続の処理について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
人間住血吸虫、住血吸虫属、それぞれカタツムリ中間および哺乳類最終的なホスト、内で無性生殖と性的発達段階を含む複雑なライフ サイクルがあります。分離し、体外で培養条件下で別のライフ サイクル段階を維持する能力は寄生虫の成長、開発およびホストを制御する細胞, 生化学的および分子機構の研究を促進しています。相互作用。住血吸虫症の伝送は、無性生殖とカタツムリ ホスト内で複数の幼虫の段階の開発を必要とプライマリおよびセカンダリの sporocysts を介して感染のミラシジウムから cercarial 終盤それが人間に感染です。本稿では大量孵化とマンソン住血吸虫感染マウスと生体外で文化にその後導入の肝臓から得られた卵から miracidia の分離手順プロトコルを提案します。詳細なプロトコルに従事し、住血吸虫研究のこの重要な分野を広げる新しい研究者を奨励することも予想されます。
概要
人間血蛭住血吸虫属、住血吸虫症、12 億 3000 万人推定世界を苦しめる顧みられない熱帯病の病原です。最も普及している種、マンソン住血吸虫、地理的に、南アメリカ、カリブ海諸島、中東、サハラ以南のアフリカ2で配布されています。マンソン住血吸虫など、およびその他の住のライフ サイクルは、哺乳類の決定的なホストと偏の中間宿主となるBiomphalaria属の淡水の貝を含む複雑です。
マンソン住血吸虫など男性と女性の大人のワーム ペア哺乳類宿主再現の後部上腸間膜静脈に住んでいる腸内の粘膜の小さな静脈にひっかかる鶏卵 (ova) の解放に終っています。卵の血管壁壊れる粘膜組織を移行し、最終的に糞便を無効になった彼ら、腸内腔を入力がします。Ova は、淡水性で自由遊泳の幼虫 (miracidia) ハッチを入力、短いのため、そのライフ サイクルを続行するために感染に適したBiomphalariaカタツムリを見つける必要があります、彼ら。この感染プロセスには、ホストに進行中の侵入と幼虫のエントリが続いてカタツムリの外側のボディ表面に miracidial の添付ファイルが含まれます。エントリー後すぐに、ミラシジウム小屋を開始するその外側の毛表皮板次の幼虫、プライマリまたは母の sporocyst の新しい外面 (テグメントタンパク) となるシンシチウム形成。無性生殖は、各プライマリ sporocyst 生成し、二次と呼ばれる sporocysts または intramolluscan 終盤、ケルカリア3の大規模な番号を解放と生成し、順番の娘 sporocysts の第二世代をリリース.カタツムリのホストからの脱出、時に自由遊泳セルカリアは接続して人間や他の適した哺乳類宿主の皮膚を直接貫通が可能です。新しいホストへの参入、セルカリア寄生 schistosomula ステージに変換、血管のシステムに侵入します。、彼らは順番に、肺と肝静脈成虫に成熟、男性と女性のペアを形成、そのライフ サイクルを完了する上腸間膜静脈への旅行、どこを移行します。
Intramolluscan 成功または幼虫住の「カタツムリ フェーズ"開発人間ホストに転送サイクルの継続に不可欠です。重要性のカタツムリ ホストとプライマリ sporocyst 段階、初期変換に自由遊泳のミラシジウムの期間の次のエントリです。寄生虫とホスト間の生理学的および免疫学的互換性、によってそれは幼虫の開発のこの段階で、その初期の成功または感染症が決定した4,56,を確立する失敗.無性人間感染セルカリアを生成し、二次 sporocysts を作り出すことができる主な sporocysts の後続の開発はさらに寄生虫の成長のすべてを提供する寛大な生理的ホスト環境を必要と生殖が必要です。
までに、少しは知られているについて生理学的、生化学的な基礎となると住血吸虫カタツムリの相互作用を制御する分子過程、特に分子や経路に関与する幼虫の発育と生殖を規制、または変調ホストの免疫反応。体外で培養実験的操作を可能にする条件の下でこれらの幼虫の段階の多数へのアクセスが大いに促進され発達経路の発見と細胞増殖、分化のメカニズム再現。重要な寄生虫の経路やメカニズム、体外実験によって識別される可能性があります、カタツムリ ホストで幼虫の成長・再生を妨害するまたはカタツムリ ホストの認識と排除に関与する免疫メカニズムを識別するためにmiracidial または sporocyst の段階。
この記事とビデオ プレゼンテーションは、我々 提供自由遊泳マンソン住血吸虫などの大規模な番号を分離する方法の詳細については、実験のフォロー アップを受ける生体外の文化への導入 miracidia操作 (プロトコル ワークフローの概要は図 1を参照)。ただし、同様の手順を記載されている以前7,8,9, 詳細なプロトコルが関連するまだ未回答の質問に対処するこのモデルを採用する研究者に役立つだろうと感じましたintramolluscan 幼虫の発育、細胞増殖と住血吸虫カタツムリ免疫の相互作用。さらに、このアプローチは、肺吸虫や肝蛭膀胱住居S. ビルハルツなど他の医学的に重要な吸虫類からの卵の分離に適合しやすい可能性があります。
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プロトコル
制度的ケアおよび使用委員会議定書の下でウィスコンシン州マディソンの大学がすべての動物の世話と実験プロシージャを承認しません。V005717。次のプロトコルは、このプロトコルで描かれた住血吸虫段階のどれもが人間や他の哺乳類に感染が人間の病原体のためのバイオ セーフティ レベル 2 (BSL2) 施設での作業を伴います。リスク グループ 2 (RG2) 人間の病原体を処理するための機関のポリシーに従ってください。
注: 我々 は降伏より大きい卵負担感染10より高い感受性のため (週齢 6) 女性のスイス ウェブスター マウスを使用します。タッカーらは、このモデル システム11で使用されるマウスとカタツムリ感染プロトコルを説明します。テーブルの材料には、特定の機器、材料、試薬、この実験的プロトコルを実行するために必要な動物の源のすべてが表示されます。
1. 感染した肝臓の処理
- CO2窒息 (毎分室の容積の 10-30% の率) によって 6-7 週間後感染マウスを安楽死させます。呼吸・心拍停止のためマウスを監視します。
注: 通常、20 マウスまで処理できます特定の時点で。 - バイオ セーフティ キャビネットに安楽死させたマウスを転送した後、背中にマウスを置き、70% エタノール腹側表面をスプレーします。1 分間浸してみましょう。
- ピンチし下腹部の皮膚を引き上げ、滅菌手術用ハサミで腹部に最も近いピンチ肌のベースでカットします。前方カット皮膚を引っ張って (すなわち、頭に向かって) 肝臓を明らかにします。肝臓の拡大し、(図 2 a) 卵誘発肉芽腫性反応のため斑点する必要があることに注意してください。
- 肝臓を取り出し、含む滅菌 1.2 %nacl ソリューション含むペン/連鎖球菌の 200 mL ビーカーに置きます。
- 1.3 と 1.4 残りのマウスとの手順を繰り返します。
注: 20 マウスは通常単一収穫で処理されます。 - 滅菌シャーレに肝臓を配置し、滅菌ピンセットで非肝脂肪・結合組織を削除します。
- ペン/連鎖球菌を滅菌 1.2 %nacl 水溶液の ~ 200 mL を含む滅菌 250 mL 遠心ボトル/きれいにトリミングされた肝臓に転送します。
- 積極的に肝臓の入ったボトルを振るし、泡/フローティング破片過剰な表面滅菌使い捨てピペットを使用して、削除します。ゆっくりと残りの食塩を容器に注ぐまたは漂白剤 1% 含む (消毒) をシンクします。
- 肝臓に新鮮な食塩水の ~ 200 mL を追加し、手順 1.8 を 3 回繰り返します。
2. 肝抽出および miracidial の分離
- 小さな滅菌ステンレス製ブレンダー カップに肝臓を配置し、1.2 %nacl 水溶液 (図 2 b) 〜 2 mL を追加します。
- 箔とこぼれを防ぐためし、低・高速度 (20 s の低速/10 秒高速; 繰り返し) を交互に 1 分のブレンドにペトリ皿カップをカバー (図 2)。
- (20 の肝臓は、4 ボトルを使用) の遠心分離機 250 mL 滅菌瓶にブレンド肝サスペンションが均等します。
- 〜 200 mL 合計ボリューム/ボトルに抗生物質と滅菌生理食塩水を追加します。遠心分離前にボトルの重さ/バランス。
- 遠心分離機 290 x g 4 oC. 静かに 15 分間でブレンドされた肝臓は培養上清を破棄する前に漂白剤と容器に注ぐ。
- 2.4 2.5 の手順をもう一度繰り返します。必ず遠心分離前に肝臓の土砂を徹底的に再懸濁します。
- 最後の生理食塩水を破棄した後 (ステップ 2.6) を洗って、小球形にされた肝組織、土砂、再懸濁し、懸濁液を滅菌 1 L のメスフラスコは、完全にアルミニウムで覆われているに転送する手ふれにペン/連鎖球菌と 200 mL 滅菌池の水を追加箔、首 (図 2 D) の 3 cm 上を除いて。
注: は、1 L フラスコあたり 2 本 (= 10 肝臓) を使用します。池の水は、卵から孵化を miracidial を刺激するために必要な自然の淡水環境をシミュレートします。 - 滅菌池の水を使用すると、首をカバーする箔の上約 3 cm に、フラスコを埋めます。その後、遅滞なく (、miracidia はすぐに孵化を開始)、残留泡とすぐに池の水の残骸を含む ~ 12 mL をピペットで表面に浮かぶ肝組織を取り外し、管別に破棄破棄します。新鮮な滅菌池の水を交換してください。
- クリーニングのステップ 2.8 回廃棄管 miracidia の有無の確認 3 つを繰り返します。洗浄液に miracidia が表示されて場合手順を洗浄の繰り返しを停止します。
- 最後の洗浄後徐々 に上のきれいな、滅菌の暖かい水と温度勾配を作成する (加温 30 oC) 暖かい滅菌池水 〜 12 mL を追加します。
注: 最善の混合を避けるためにフラスコの首の側面に沿って水をゆっくりと放電による方法です。 - フラスコの開口部に小さなシャーレ カバーを置き、水の上部の表面を照らす箔カバー上フラスコの上部に明るい光を照らします。
注: 通常、5-10 分以内 miracidia、光に惹かの水泳に集中する多数の池の水 (図 3 a) の最初の 2-3 cm 以内。
3. Miracidial の収穫と栽培
- Miracidia を 10 分後表面に蓄積しているときは、滅菌ピペットを使用して 〜 8 mL の池の水と滅菌 15 mL 遠心チューブへの転送を削除します。氷の上の miracidia を含む管を配置します。
- バック 8 mL の容積測定フラスコの内側に沿って暖かい滅菌池水を追加し、別の 10 分を待ちます。
- たびに新しいチューブを使用して、さらに 3 回の 3.1 と 3.2 の手順を繰り返します。4thコレクション後解決するため miracidia を許可する 10 分間氷の上最終管を維持します。チューブのこのセットには、最初の収穫が装備されています。
- 遠心チューブ 290 x g 4 oC 予冷冷却遠心機で 1 分で miracidia を含みます。
- 寄生虫ペレット (図 3 b) の邪魔にならないように注意しながら上澄み (〜 7 mL) のほとんどをすぐに削除します。
- プールの 1 つにこの最初の収穫からすべての miracidia チューブ、すべて 〜 1 mL 滅菌池の水を使ったオリジナル チューブを洗浄、「プール」チューブ追加。
- 〜 5 分間氷の上解決する寄生虫を許可し、再度 4 oc 以上で 1 分間 290 x g で寄生虫を遠心
- 慎重に上澄みを除去し、6-8 mL 滅菌チャーニンの平衡塩溶液 (バルト海沿岸 +; 参照テーブルの材料) 含むペン/連鎖球菌性を追加します。
- 優しく miracidia および 24 ウェル培養プレート (ウェルあたり 1 mL) にそれらは続いてバルト海沿岸 + 6-8 mL のチューブを洗浄とリンスの 1 mL を各ウェルに追加する因数を中断します。26 oC 培養条件下で寄生虫が孵化させなさい。分離 miracidia の濃度は異なりますが、通常 〜 7000/mL、平均は。
- 寄生虫はまだ光を集中している、孵化後半 miracidia を収穫を続けます 3.9 ステップ 3.1 を繰り返しますが、コレクションを 15 〜 20 分間の時間間隔を増加します。
注: チューブのこの新しいセットは、2 番目の収穫を表します。ただし、通常、miracidial の数値は低いため通常すべてのチューブから幼虫にもバルト海沿岸 + 2 mL を含む単一のカルチャにプールされます。 - 24 h 後収穫と栽培、軽くピペッティングによる者で sporocysts を再懸濁します。
- 井戸の底に沈殿する寄生虫を許可するように、いくつかの分を待ちます。一度彼らが定住している幼虫の変形の間に miracidia によって流す毛表皮板のほとんどが含まれます上清 (~1.5 mL) を慎重に取り外します。この「変換」上澄みは破棄または、幼虫の分泌製品の追跡調査に組み込む可能性があります。
- 各井戸と優しく sporocysts を再懸濁しますピペットに新鮮なバルト海沿岸 + 1.5 mL を追加します。さらに洗浄または別の媒体への変更が必要な場合は、3.12 のステップを繰り返します。
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結果
Miracidia の大半は収集最初の 2 つの「収穫」で通常されます。バルト海沿岸 + で孤立した miracidia の孵化は、ミラシジウム-sporocyst 変換プロセス (図 4 a-c) をトリガーします。最初の 1 時間内で文化に次の転送は、バルト海沿岸 +、miracidia 停止水泳 (図 4 a) の大半を含む井戸します。文化の 6 h で、miracidia は積極的に流して、繊毛上皮プレート (図 4 b) を進めています。この取除くプロセスと一致する、幼虫を形成、外側の合胞体 tegumental カバー主な sporocysts に変身をします。寄生虫のほとんどは、バルト海沿岸 + (図 4) では 24-48 時間後栽培によって完全に形成された sporocysts になっ...
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ディスカッション
マンソン住血吸虫など、分離、本明細書で説明されているように操作の Miracidia だけカタツムリ中間ホストに感染し、幼虫の開発のこの段階で人間バイオハザードは表現していません。ただし、 Biomphalariaカタツムリ種の影響を受けやすい可能性があります存在または維持領域から別の場所に miracidial の分離を実行する、カタツムリの偶発的な暴露/感染症を避けるためには、注意をすべき。独立したルーム、BSL2 スペースとして登録することを強くお勧めします。また、肝臓と幼虫の分離の処理で使用されるソリューションは、処分前に消毒剤 (例えば1% の漂白剤) で扱われるべきすべての洗浄。
肝臓からの外科的除去感染マウス、無菌条件下で生物学的安全キャビネット (BSC) のブレンド/均質化する前に、後続の処理を実行するに注意してください。ただし、実用的な理由 (一括サンプルを操作するための使いやすさ) 他のすべてのプロシージャは、滅菌容器 (例えば、ブレンダー カップ、フラスコ、ボトル、チューブ、転送 pip...
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
NIH グラント RO1AI015503 によって部分的に資金を供給しました。住血吸虫感染マウスは備リソースを介して配布する NIH NIAID 契約 HHSN272201000005I を通じて NIAID 住血吸虫症リソース センター生物医学研究所 (メリーランド州ロックビル) によって提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | 1L of solution | ||
| 2.8 g 塩化ナトリウム | フィッシャーサイエンティフィック | S271-3 | 塩化カルシウムを除く塩を溶解し、 |
| 塩化カリウム0.15g | Sigma-Aldrich | P5405 | 糖、800 mL ddH2O |
| 0.07 g リン酸ナトリウム、二塩基性無水 | Fisher Scientific | S374-500 | 塩化カルシウムを 200 |
| 0.45 g 硫酸マグネシウム七水和物 | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g 塩化カルシウム二水和物 | Mallinckrodt | 4160 | カルシウムsolnを塩/砂糖solnにゆっくりと加えます |
| 0.05gの重炭酸ナトリウム | フィッシャーサイエンティフィック | S233-3 | 一定に混合した |
| バイオメディカル152527 | pH 7.2に調整し、a を使用して滅菌をろ過します。 | ||
| 1 gトレハロー | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm 使い捨てボトルトップフィルター |
| 10 mL 100X ペニシリン/ストレプトマイシン | ハイクロン | SV30010 | ろ過したペニシリンとストレプトマイシンを追加 以前の使用 |
| Incomplete Bge medium (Ibge)< | strong>900 mL 溶液用 | ||
| 220 mL Schneider's ショウジョウバエ培地 改変 | ロンザ | 04-351Q | シュナイダー培地と 680 mL ddH2O |
| 4.5 g ラクトアルブミン酵素加水分解物 | Sigma-Aldrich | L9010 | を添加 ラクトアルブミン加水分解物とガラクトース |
| 1.3 g ガラクトー | Sigma-Aldrich | G0625 | pH 7.2 に調整し、0.22 µ を使用してろ過滅菌します。m 滅菌済みディスポーザブルボトルトップフィルター |
| Complete Bge medium (cBge)< | strong>For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | FBSを熱不活化するには:解凍したFBSをインキュベートします。 | ||
| 9 mL 熱不活性 ウシ胎児血清 (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | ウォーターバス 60°C;Cを1時間、優しく |
| 1 mL 100X ペニシリン/ストレプトマイシン | ハイクロン | SV30010 | 10 分ごとにボトルを渦巻く 熱不活化 FBS を 15 mL チューブに分注 で保存し、-20°Cで保存します。培地+ FBSおよび フィルターを混合し、0.22µを使用して滅菌します。m 滅菌済み 使い捨てボトルトップフィルター 使用前にペニシリンとストレプトマイシンを追加 |
| 池の水(ストック溶液) | strong<> | ||
| >12.5g炭酸カルシウム | ッシャーサイエンティフィ | C64-500 | ddH2O 1Lにすべての塩を混合 |
| マグネシウム1.25グラム | フィッシャーサイエンティフィック | M27-500 | が完全に持っているわけではないことに注意してください |
| 1.25 g 塩化ナトリウム | Fisher Scientific | S271-3 | 溶解激しく振って吊り下げます |
| 0.25 g 塩化カリウム | Sigma-Aldrich | P5405 | 塩を作業溶媒を作る前に |
| 池の水(作業溶液)< | strong>1.5Lの溶液 | ||
| 0.8mLのストック溶液池の水(使用前に振とう)で | ストックをddH2Oに混合 | ||
| 1500mLのddH2O | クレーブで池の水を滅菌します(slow サイクル) | ||
| 100Xペニシリン/ストレプトマイシン1.5mL | ハイクロン | SV30010 | ペニシリンとストレプトマイシンを以前に使用 |
| <ストロング>生理食塩水(1.2%NaCl) | <ストロング>1.5Lの溶液 | ||
| 18gの塩化ナトリウムを1500mLのddH2O | 、 | ||
| 100Xペニシリン/ストレプトマイシンの1.5mLを | クロン | SV30010 | 使用前にペニシリンとストレプトマイシンを追加 |
| <強力>追加の機器と材料: | |||
| 7-Lマウス安楽死チャンバー | 承認されたIACUCプロトコル番号V001551マウス | ||
| Taconic Biosciences | Swiss-Webster、女性、6週齢、マウス | ||
| CO2タンクとレギュレータ | ー病原体フリー | ||
| 24ウェル組織培養プレート | TPP | 92424 | |
| 1-L 容積フラスコ | |||
| 光源 (150W) | チウテックコーポレーション | モデルF0-150 | |
| 遠心分離機、冷蔵、スイングバケット | エッペンドルフ | モデル5810R | |
| 遠心分離機ボトル (250 mL) | Nalgene | ||
| 15 mL 遠心分離チューブ、滅菌済み | Corning | 430053 | |
| 滅菌済み使い捨てトランスファーピペット | フィッシャーサイエンティフィック | 1371120 | |
| 0.22 & マイクロ;m 滅菌済み使い捨てボトルトップフィルター | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| ステンレス製ブレンダー | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| レンダーカップ 容量100mL | Waring 業務 | ||
| 用倒立複合顕微鏡 | ニコンインスツルメンツ | エクリプス TE300 |
参考文献
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