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方法論記事

キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

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DOI:

10.3791/56411

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2017年11月9日

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

この記事について

サマリー

ここで我々 は急性の機械的刺激に対する細胞応答を評価するための方法を説明します。顕微鏡ベースのアッセイでは、蛍光標識したバイオ センサー シアー流を含む簡単な刺激の局在を調べる。我々 はまた、生化学的急性の機械的刺激に対する応答の興味の様々 な蛋白質の活性化をテストします。

要約

走化性、または、走化性因子のグラデーションを移行は、指示移行の最高の理解できるモードです。社会的なアメーバを用いた研究キイロタマホコリカビは並列経路の複雑なシグナル伝達ネットワーク走化性因子への応答を増幅し、偏ったアクチンの重合との仮足の突起が生じることを明らかにした、グラデーションの方向。対照的に、作用するせん断流れまたは電界への暴露による指示の移行などの他の種類の運転機構は知られていません。走化性の多くのレギュレータはローカリゼーションまたはグローバル刺激、走化性因子の活性化に一時的な変更を表示し同様、リーディング エッジまたは遅れエッジ移行細胞の局在を示します。指示移行の他の種類の分子機構を理解するには、せん断流れに (2-5 s) の簡単な露出に基づく急性の機械的刺激に対する細胞応答の検討を可能にする方法を開発しました。この刺激は、個々 のセルの動作を調べるバイオ センサーの蛍光標識を発現する細胞をイメージしながら、チャネルで配信できます。さらに、溶解し, プレートとエスディーエス興味の蛋白質のアクティブなバージョンを認識する抗体を使用してセル人口を刺激できます。両測定法を組み合わせることによって 1 つは変化細胞内局在および/またはリン酸化によって活性化分子の広い配列を調べることができます。このメソッドを使用して急性の機械的刺激が走化性シグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワークの活性化を引き起こすことを求めました。急性の機械的刺激に対する細胞応答を調べる機能せん断流動誘起運動に必要な開始のイベントを理解するために重要です。このアプローチは、走化性因子受容体の交絡影響なし走化性シグナル伝達ネットワークを勉強するためのツールを提供します。

概要

真核細胞の移行は水溶性または基質結合塩基のグラデーション、基板、電気フィールド、またはせん断流の可変剛性を含む環境の多様な化学と物理の合図によってバイアスされています。走化性を運転する分子機構の理解に多くの進歩をされているが、以下は指示移行と統合を生成する細胞レベルでこれらの多様な信号を統合する方法の他の種類について知られている渡り鳥応答。

監督、走化性因子の集積が進む方向への移動には行動の 3 つのコンポーネントが含まれます: 運動方向検出、極性1。運動は、仮足突起により細胞のランダムな動きを指します。方向性、走化性因子の原因を検出する細胞の能力は、センシングでも発生することができます細胞を固定化しました。極性は、リーディング エッジと運動の増加の永続につながる細胞の遅行エッジ間細胞内コンポーネントのより安定した非対称的な配分を指します。

4 つの概念上定義された制御ネットワークの活動に依存する、走化性因子への細胞応答: 受容体/極性1アクチン細胞骨格、シグナル伝達蛋白質 G。G タンパク質共役型受容体への走化性因子のバインドは、ヘテロ三量体 G タンパク質 α と βγ 方向信号を増幅する下流のシグナル伝達ネットワークを経由で信号を送信します。シグナル伝達ネットワーク内の複数経路並行行為し、アクチン細胞骨格ネットワーク バイアス アクチン重合とグラデーションの方向に、結果として仮足突起にフィードします。走化性の重要な規制当局の間では、しますグアニル酸シクラーゼ、ホスファターゼとは、テンシンの相同物 (PTEN) ホスホイノシチド 3-キナーゼ (PI3K) Ras GTPase、TorC2。シグナル伝達ネットワークの内で、およびシグナル伝達とアクチン細胞骨格のネットワークをさらにフィードバック機構は、応答を増幅します。最後に、定義が不十分な極性ネットワークはアクチン細胞骨格から入力を受け、さらにグラデーションの方向で永続的な移行を促進するシグナル伝達ネットワーク バイアスがかかります。

走化性のメカニズム理解の多くは、制御ネットワークのさまざまなコンポーネントのタグ付きの蛍光バイオ センサーの開発のために可能になった。多くの走化性規制規制分子自体またはその活動の非対称的な配分があります。たとえば、認識バイオ アクティブ バージョンの小さな低分子量 g 蛋白質 Ras や Rap1-Ras 結合ドメイン (称します RBD) Raf1 のモデル、それぞれ-chemotaxing 携帯2,3のリーディング エッジにローカライズします。同様に、PI3K およびその製品ホスファチジルイノシトール (3,4,5)-三リン酸 (PIP3)、プレクストリン相同性 (PH) ドメインで認識もセル4、5の前面にローカリゼーションを表示します。対照的に、3 ホスファターゼ PTEN 変換 PIP3 ホスファチジルイノシトール (4, 5) に戻る-ビスリン酸、ローカライズ セル6のラギングの端に。重要なは、これらのバイオ センサーは、走化性因子とグローバルの刺激への応答への局在を変更します。ゾル性細胞質または皮質局在と欠席しているエッジ マーカーの遅れをとっているに対し、皮質に戻して静止細胞の突起の先端にリーディング エッジ マーカー静止細胞の突起の先端からなる後ゾル性細胞質刺激。バイオ センサー、走化性因子とグローバルの刺激への応答分布の解析は、運動と極性、観測をしばしば混同の貢献を最小化します。走化性因子、細胞懸濁液のグローバルまたは一様刺激はしばしばタンパク質リン酸化7,8,9によって検出される蛋白質のアクティブ化人口全体の変更を評価するツールとして使用も.顕微鏡制御ネットワークのさまざまなコンポーネントの動作に関する時間的・空間的情報を収集するために使用に対し主、この生化学的な試金は時間情報を取得する使用されます。

シグナル伝達ネットワークには、興奮性システム10,11の機能が組み込まれています。スープラしきい値走化性刺激に対する応答は「全か無か」であり、不応期が表示されます。応答が確率的に発生しても、振動現象を示すことができます。シグナル伝達イベント波12,13,14,15として伝播する大脳皮質の領域に局在しています。前面、または背面、マーカー、募集または伝播する波のアクティブ ・ ゾーンから切り離します。末尾のアクティブなゾーン ・難治性地域のため逆方向の波を彼らを満たして全滅させます。伝搬波の信号伝達細胞移行10を仲介する細胞の突起の根底にあります。

同じような調節機構が好中球とその他哺乳類の細胞の種類16 に該当するも、走化性については前述の多くはキイロタマホコリカビ、社会的なアメーバの研究から来た.細胞性粘菌単一細胞の何千もを最終的に胞子を含む多細胞の子実体を形成集計センターへ移行と飢餓では、堅牢な走化性応答のある確立されたモデル有機体をあります。走化性は、この生物の細菌の食料源を検索するための単一細胞の成長段階も重要です。重要なは、単一の細胞性粘菌の移行は、哺乳類の好中球または非常に急速なアメーバ型移行を受けるすべての転移性癌細胞の移行に似ています。実際には、両方全体的な制御ネットワークのトポロジと同様、走化性に関与する個々 のシグナル伝達経路の多くは、細胞性粘菌と哺乳類白血球17の間保存されます。さらに、線維芽細胞など、他のセルは、Gpcr; 代わりに受容器のチロシンのキナーゼ (RTK) を使用します。ただし、RTKs は同じようなネットワークにフィード可能性があります。

走化性と対照をなして指示移行の他の各種のモードを駆動する信号メカニズムの理解が欠けています。同様に細胞走化性因子のグラデーションで移行するいくつか報告されている活性化および/または局在アクチン重合、PIP3 および/または細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK) 1/2 を含む典型的なリーディング エッジ マーカーで、経るセルの前面は、作用するせん断流れまたは電界18,19,20,21の変更への応答で移行を指示しました。しかし、これらの研究の刺激に連続暴露も結果細胞遊走と疑問が残ったかどうか、具体的には、刺激に対する反応のリーディング エッジ マーカーのローカライズなど、または彼らは単にリーディング エッジにローカライズために移行するセルの前面に仮足数の増加。

人口レベルで両方のせん断流れと個々 のセル22として配信される急性の力学的摂動に対する細胞の反応を観察することができるアッセイを開発しました。走化性因子、急性 stimula グローバル刺激に似ていますせん断流のグローバリゼ-ションは、運動または極性から交絡の貢献をせず機械的刺激に対する細胞応答の研究をことができます。遺伝的または薬理学的摂動とこれらの生化学的および顕微鏡的アッセイを組み合わせることにより、私たちはどのように力学的刺激については、認識されて学ぶことして転送します。また、このアプローチはまた走化性因子、受容体/G からシグナル伝達とアクチン細胞骨格のネットワーク分離のない状態で走化性因子の受容体の下流のシステムへのタッピング法を提供しますタンパク質ネットワーク。

最近我々 は以下の方法を使用して、走化性シグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワーク22の複数のコンポーネントの活性化につながるその急性のせん断応力を示した。さまざまな間隔で急性の機械的刺激により、我々 は、同様にする走化性因子、力学的刺激に対する応答も展示下応答の全か無かの動作を含む、興奮性システムの機能実証飽和条件と不応期の存在。最後に、機械的、化学的刺激を組み合わせることによって示したシグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワーク、可能性があります複数バイアス細胞遊走刺激の統合を可能にする、2 つの刺激を共有します。

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プロトコル

1 ですソリューションの準備

  1. 以下を使用して準備 HL 5 メディア: ブドウ糖 10 g/L、10 g/L プロテオース ・ ペプトン 5 g/L 酵母エキス、0.965 グラム/L の Na 2 HPO 4 ·7H 2 O、0.485 g/L KH 2。PO 4、そして、特記されない場合は、脱イオン水で 0.03 g/L ストレプトマイシン。オートクレーブ中、室温で保管します
    。 注: プロテオース ペプトン、酵母エキスの異なるサプライヤーから入手した間だけでなく、個々 のバッチ間の違いによるメディアの pH は 6.4 に 6.7 の典型的な範囲に調整する必要があります
    2. 。
  2. 準備 SM 板次を使用して: ブドウ糖 10 g/L、10 グラム/L のペプトン 1 g/L 酵母エキス、2.31 g/L KH 2 PO 4、1 g/L K 2 HPO 4、および脱イオン水 20 グラム/L の寒天。オートクレーブ、クール、そして 10 cm シャーレごと寒天溶液 30 mL を注ぐ。寒天が固化したら 1 ヶ月の 4 ° C でプレートを保存します
    3. 。
  3. 準備 10 リン酸バッファー (PB) を使用して x 13.4 グラム/L の Na 2 HPO 4 ·7H 2 O および 6.8 g/L KH 2 PO 4 脱イオン水。4 で 10 x の在庫を格納を使用するために脱イオン水で 1 x ° C. Dilute
    4. 。
  4. X 2 mm MgSO 4 PB と 0.2 mM CaCl 2 1 を補うことで DB バッファーを準備します
    5. 。
  5. 脱イオン水で準備 100 mM カフェイン。デパート − 20 ° C
  6. 準備 100 mM キャンプ原液は脱イオン水でキャンプ ナトリウム一水和物の溶解によって。脱イオン水で通常在庫 1 mM を準備します。両方の原液を保存 − 20 ° c. の準備最終キャンプ ソリューション実験の日に DB に必要な濃度で
    。 注: 在庫ソリューションすることができます凍結融解に数回
    7. 。
  7. 1 x で準備 25 mM 葉酸 PB。パウダーが完全に溶けるまでは、1 N NaOH を数滴を追加します。デパート − 20 ° C
  8. 準備 3 x サンプルバッファー次を使用して: 187.5 mM トリス塩酸 pH 6.8, 6% (w/v) ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS)、30% のグリセロール、126 mM ジチオトレイトール、0.03% (w/v) ブロモフェノール ブルー。因数と店で − 20 ° C
    1. 前に使用し、37 ° C の水浴で解凍 3 x 1 x サンプルバッファーを希釈して 1 x、ピロりん酸ナトリウム 25 mM, 2 mM Na 3 VO 4 50 mM NaF を追加プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤サンプル バッファーを準備します。完全無料の EDTA プロテアーゼ抑制剤のカクテル脱イオン水で。手順 3.1.2-3.1.3 で説明されている手順を開始する前にすぐに、阻害剤を追加します
      2. 。
  9. 5 mM Latrunculin A DMSO 溶液を準備します。因数と店で − 20 ° C

2。D. キイロタマホコリカビ 細胞の調製

注: HL 5 メディアにおける D. キイロタマホコリカビ 細胞培養プレートのいずれかを維持または懸濁液の文化は、 23 を前述しました。必要に応じて、変換は標準エレクトロポレーション プロトコル 24 によると蛍光標識したバイオ センサーによる細胞します。バイオ センサーや関心の他の遺伝子をプラスミドと同様、様々 な D. キイロタマホコリカビ 株 Dicty ストック センター (dictybase.org) から入手できます

。
  1. 成長と栄養 D. キイロタマホコリカビ 細胞のコレクション
    1. 分析栄養細胞の成長、macropinosomes の数を減らすために通常見られる細菌の存在下で細胞axenically 成長細胞 25。
      1. 準備 機構の解析 文化を抗生物質なし HL 5 媒体の任意のボリュームに少数のグリセロール ストックからまたは以前の文化からの細胞を接種。16-18 のため室温 (20-22 ° C) で 200 rpm (0.42 x g) で軌道シェーカーで細菌培養を孵化させなさい
        注: K。ここで使用される 水素生成菌 株は非病原性 (材料の表 を参照してください).
    2. 組織培養プレートまたは懸濁培養から指数関数的成長段階に D. キイロタマホコリカビ を収集し、メーカーによると検定を使用してセルをカウント ' の指示。SM 板 260 μ k. 食 サスペンションを 1 x 10 5 D. キイロタマホコリカビ 細胞を拡散します。次の日ダウン上下プレートの電源を入れます。D. キイロタマホコリカビ 細胞細菌の芝生をクリアして起動するまでが、集計を開始する前に室温で細胞を成長 (36 ~ 48 h).
    3. 収集 D. キイロタマホコリカビ 細胞ガラス スプレッダーとそれらを削って 5 mL DB バッファー。50 mL ポリプロピレン チューブに細胞を転送します。別の 5 mL DB バッファーとプレートとオリジナルの懸濁液をプールにすすいでください。DB バッファーを 50 mL チューブを入力します
      4. 。
    4. 3-4 分間 360 x g で d. 菌 懸濁液遠心、上清を吸引し、50 mL にペレットを再懸濁します DB バッファー。洗浄のステップ上清までクリア (3 〜 へ 4 洗浄) を繰り返します。〜 10 6 セル/mL x 5 の最終密度 DB バッファー内の最後のセルのペレットを再懸濁します
      5. 。
  2. 集計の準備-主務 D. キイロタマホコリカビ 細胞
    1. 標準に従ってすべての 6 分後に飢餓と 50 nM のキャンプとパルスの 4 h 1 h 飢餓による細胞の開発 D. キイロタマホコリカビ 23 のプロトコルします
      2. 。
    2. の次の開発、細胞懸濁液の最終的な量を測定します
      3. 。
    3. 開発のため使用するセル数の初期値に基づく最終的な懸濁液の細胞密度を計算します
      。 注: キャンプは 6 分毎、100 μ L のボリュームで配信された場合、細胞容積により 1 mL キャンプ パルスのすべての時間の。したがって、DB の 4 mL で 8 x 10 の 7 セルを使用して標準的な条件のため開発の 4 h 後最終巻は 7 mL、最終セル密度 ~1.1 x 10 7 セル/mL
      4. 。

3。機械や化学的刺激に対する細胞応答の生化学的解析

の 4 h 後 (手順 2.2) から
    1. プレート 2 x 10 6 集計主務を 急性機械的刺激の細胞に続いてセル換散 の細胞2 ml の DB 35 mm 料理の開発。室温で 10 分間を付けるセルを許可します。1 mL DB で 2 回細胞を洗浄します。プレートの妨害なしで 30 分間 2.5 mM カフェインと DB のセルをインキュベートします
      。 注: 場合細胞薬理学的阻害剤と扱われる必要があります、追加希望濃度の阻害または適切な車両の同じボリューム カフェインと basalation 中です
      2. 。 機械的刺激を適用する
    2. 軌道シェーカーに (一度に 1 つずつ) プレートを置き、すぐに 150 rpm (0.24 x g) 5 でオン s.
      注: プレートも手動では刺激を受けて動き約 5 cross-wise 方法で s.
      3. 刺激の開始後の時間が
    3. 吸引で指定されたバッファー。すぐにプロテアーゼとホスファターゼ阻害剤 100 μ L のサンプル バッファーを追加することによって、細胞を溶解します
      4. 。
    4. は、氷の上プレートを置き、1.5 mL チューブに液を収集します。' 時間 0 '、振ることがなく細胞を溶解させます。溶解後すぐにチューブを 10 分間 95 ° C の熱ブロックに転送します。免疫ブロットを続行または-20 の lysates を格納 ° C
  2. 、走化性因子と細胞の刺激
    1. 開発の 4 h 後急速に 30 分間軌道シェーカーで 200 rpm (0.42 x g) で 5 mM カフェインの存在下でそれらを揺することによって集約有能なセルを Basalate。
      1. 360 x 細胞懸濁液を遠心分離機 g で 3-4 分間、上清を吸引し、10 mL にペレットを再懸濁します冷たい DB バッファー。洗濯の手順を繰り返します
        2. 。
    2. 4 × 10 の 7 セル/mL の初期細胞数 (手順 2.2 参照) 電池を開発するために使用に基づいての最終的な密度に冷たい DB バッファーで最終的な細胞ペレットを再懸濁します。刺激応答性の前に氷の上細胞懸濁液を保つバッテリ。
      1. 軌道シェーカーにピペット 50 μ 10 μ M のキャンプまたはポリスチレン カップに車両配置します
        2. 。
    3. 細胞を刺激、同じカップに冷たい細胞懸濁液の 450 μ L を追加し、すぐに 200 rpm (0.42 x g) でシェーカーをオンにします。様々 な時代、刺激開始後で (例えば 10、30、45、60、120 s)、一時的に停止、シェーカー、細胞懸濁液の 50 μ 因数を取るし、25 μ L 3 X サンプルバッファーを含む 1.5 mL チューブにそれらを追加することによって、細胞を溶解します。
      1. の ' 時間 0 '、些細の冷たい細胞懸濁液から細胞を使用します
        。 注: 刺激中に細胞懸濁液の最終的な温度は 26 〜 9 ° C です。これらの条件の下でピーク応答に室温 (顕微鏡の付着性細胞の走化性因子刺激や付着性細胞の機械的刺激など) で実行される刺激の観察されたピークより少し後発生します
        2. 。
    4. 溶解後すぐにチューブを 10 分間 95 ° C の熱ブロックに転送します。免疫ブロットを続行または-20 の lysates を格納 ° C
  3. イムノブロット細胞応答の解析
    1. トリス-HCl、4-15% のポリアクリルアミドゲルの lysates (から 3.1.3 または 3.2.4 の手順) を実行、ポリフッ化ビニリデン フッ化物膜、ブロック、およびリン PKC とイムノブロットに転送Ζ (リン PKBR1 とリン PKBA を検出) を Thr410。西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗家兎二次抗体、化学発光基板を用いた化学発光が続くと孵化によって信号を検出します
      2. 。
    2. 複数のタンパク質の検出、除去バッファーでしみを除去し、再一次抗体リン-p42/44 MAPK Thr302/304 (リン ERK2 を検出) するために、プローブします。Coomassie ブリリアント ブルーとポリフッ化ビニリデン フッ化物膜の汚損によって読み込み同じ蛋白質を確認します
      3. 。

4。急性の機械的刺激とライブ イメージング 1 つ上のセルの顕微鏡

  1. フロー装置を用いた急性の機械的刺激に対する応答の評価
    1. を収集し、植生や集計主務を希釈~ DB それぞれ手順 2.1 と 2.2 で説明されているように 10 の 6 セル/mL x 1 のセルです。チャネルを使用してスライドに ~ 600 μ L を読み込む (詳細については 材料の表 を参照してください)。ために 10 分のスライドで入り江のすべては、完全に満ちていることを確認します。必要に応じて余分なバッファーをトップします
      。 注: 分析に使用する特定のスライドが狭く、1 mm のチャンネルにフィードが広い、3 ミリメートルの 1 つのチャンネルにマージし、3 つの入力。チャネルの高さは 0.4 mm です。広い部分だけがイメージ化されるセルは、チャネル全体でメッキが
      2. 。
    2. 流体ユニットのフロント右弁を通して 50 mL タンクに接続されているラインの 1 つを渡す (詳細については 材料の表 を参照してください)。バルブが閉じていることを確認、ポンプ用ソフトウェアを使用して (すなわち 左に)。DB と、リザーバーします。
      1. 50 mbar の圧力を設定し、それを入れます。埋めるし、バルブをそれを開きをクリックして DB の行をすすいでください。0 に戻って圧力を切り、30 ~ 後、バルブを閉め、s.
    3. 空気の泡をトラップすることがなくスライドの 1 つの側面の 3 つの入口の 1 つにラインを接続します。他の 2 つの入り江に差し込みます。スライドの 2 番目の側の単一の入口にドレーンからの線を接続します
      。 注: このセットアップで入力とドレイン線用チューブは、1.6 mm の内径
      4. 。
    4. は、顕微鏡 20 X 空気目的の下にスライドを配置します。チャネルを洗浄するラインを開きをクリックするバルブを切り替える " 力 " (~ 50 mbar または 40 〜 dyn/cm 2) ドレインにを介して液体をプッシュするより高い圧力で始まって。
      1. 液体は下水管から出てくる、一度ゼロに外部からの圧力を減らす (すなわち 重力流れのみ 〜 15 dyn/cm 2)、洗い 〜 30 s. スイッチの反対位置に流れを止めるバルブを続けますと。
        2. 。
    5. 3 秒間隔でオイル目的 X 40 の下で倒立蛍光顕微鏡に RFP または GFP 照明画像を取得します。閉じた状態でバルブと圧力でオンに 15 と 40 dyn/cm 2 の間に通常、所望の圧力 (0 - 50 mbar).
    6. バルブを切り替えることにより、刺激を提供 5 フレームを取得した後、" を開く " 位置。反対方向にバルブを切り替えることによって 2-5 秒後流れをオフします
      。 注: 特定の弱いバイオ センサー (例えば PTEN、サイナ、17 歳、およびモデル) の必要があります石油目的 X 40 を搭載した共焦点顕微鏡を使用してイメージ セルにします
      7. 。
  2. フロー装置を用いた急性の機械的刺激に対する反応の薬理学的阻害剤の試験効果
    1. 4.1.1 の手順で説明するようチャネルをスライドで細胞をプレートします。2 つの明細行の設定: ステップ、4.1.2 のようにフロントの右弁で 1 行を渡す 2 番目後ろから左右の弁。左の線をクランプし、バルブを入れて、" 閉 " (左) の位置。興味 (例えば 5 μ M Latrunculin A) の薬理学的阻害剤を含む溶液を適切な車両と 2 番目を含むデータベースの 1 行を入力します
      。 注: ので、物理的に左の線をクランプする必要がある、" 閉 " 左の位置がそのラインのバルブを開ける
      2. 。
    2. 塗りとリンス 50 mbar の圧力をオンとバルブの切り替え線の右、" を開く " (右) の位置。バルブに切り替えて左 〜 30 s の塗りつぶしと 〜 30 s. 接続のクランプを外して左ラインを洗浄後 2 つのチャネルを使用してスライドの 1 つの側面の入口の両方の行、残りのインレット プラグ、2 番目の側の単一の入口にドレインを接続
    3. は右の行のバッファーを使用してスライドを洗って 4.1.3 および 4.1.4 上記の手順で説明されているように同じバッファーに刺激を実行します
      。 注: このセットアップでの最初の 1 つとして右の行を選択するが順序反転可能性がありますされる
      4. 。
    4. 次の刺激、圧力ゼロ (すなわち 重力流のみ、15 ~ dyn/cm 2) で右の行を開くにバルブを切り替えます。左の線からクランプを外し、バルブを開いてその行に左に切り替えます。最初の行をクランプします
      5. 。
    5. を介して阻害剤と 3-5 mL のバッファーを実行した後右に流れを止めるバルブを切り替えるし、時間の必要な長さの阻害剤で細胞を孵化させなさい (例えば 15 分)。切換弁 〜 15 〜 10 分毎によって流れをオン酸素の剥奪を防ぐために s。2 行目での刺激を繰り返します
      6. 。
  3. マイクロ ピペットを使用して急性の機械的刺激に対する応答を評価するための代替メソッド
    1. によると標準プロトコル 23 DB でいっぱいマイクロ ピペットを設定。1,500 psi で補正圧力を維持します
      2. 。
    2. は、収集し、手順 2.1 栄養細胞を希釈します。少なくとも 10 分付着し、3 ml の DB をカバーできるように ~7.5 x 10 5 セル/mL 1 よくチャンバーの場所 25 μ L 滴
      3. 。
    3. は、40 X 石油目的を搭載した倒立蛍光顕微鏡でチャンバーを配置します。セルを探します。それがまずチャンバーの底に触れるまで優しくビューのフィールドの真ん中にマイクロ ピペットを下げる
      。 注: 1,500 Psi で補正圧力が設定されているのでセル連続にさらされる DB の非常に遅い流れ、マイクロ ピペットから
      4. 。
    4. は、3 秒間隔で RFP または GFP のイルミネーションの画像を取得を開始します。適用、' クリーン ' ピペットから液の塊をリリースします。私をイメージングを続けるn 単独で補正圧力による流量の存在
      5. 。
  4. バルク バッファーによる急性の機械的刺激に対する応答を評価するために別の方法
    1. を収集し、手順 2.1 栄養細胞を希釈します。1 ~ 10 6 セル/mL で DB 8 ウェル室からよく途中で × 20 μ L 細胞滴を配置します。少なくとも 10 分の付着する細胞を許可
    2. は、3 秒間隔で 40 × 対物装備倒立蛍光顕微鏡に RFP または GFP 固有照明の画像を取得を開始します。ドロップのエッジに近い領域に焦点を当てるです
      3. 。
    3. は急速に井戸の 1 つの側面に DB の 430 μ L を追加します。イメージングを続行します
      4. 。
    4. 、機械的、化学的刺激との相互作用の分析 12 または 45 秒の機械的刺激、優しく追加 50 μ L (DB) の車や葉酸 (最終濃度 20 nM) の力学的応答を誘発することがなく。イメージングを続行します
      5. 。
  5. 反応の定量化
    1. 画像解析ソフトで 32 ビット TIFF イメージを開く 27 (詳細については、材料表 を参照してください)
      2. 。
    2. の下で、' 分析 ' タブへ " 設定測定 "。チェックのボックスをオン ' 平均グレー値 '。その他のボックスがチェックされていないことを確認します。クリックして " OK ".
    3. の下で、' プロセス '] タブをクリックして " を引く背景 "。50 ピクセルでローリングの球の半径を保持し、メニューに記載されているオプションのいずれかをチェックしません。1 つのセルを使用してズームイン、' 虫眼鏡 ' ツール
      4. 。
    4. 使用の ' 四角形 ' ツール、細胞質、核や細胞膜上にそれを描画しないように作るのボックス (~2.5 2.5 μ m 2 x) を描画します。プレス " Ctrl " + " M " かへのキー、' 分析 ' タブをクリックして " メジャー " ボックスの平均グレー値を決定します。細胞質のままボックスを確かめて後続のフレーム ・再びメジャーへ進出
      。 注: D. キイロタマホコリカビ 細胞は非常に急速に動くのでボックスに移動できます 1 つのフレームから次に細胞質でそれを維持します
      5. 。
    5. 結局フレームの分析されている、値をワークシートにコピーします。様々 なバイオ センサーの表現のレベルで細胞に変化のために、時間 0 で観測された平均グレー値の値を正規化します。大脳皮質の信号の蓄積を反映する値の逆数を計算します
      6. 。

5。連続の機械的刺激とライブ イメージング 1 つ上のセルの顕微鏡

  1. 上記手順 4.1.1 - 4.1.3 で急性の力学刺激負荷分析のとおりセルを設定します。一度に数分以上の応答を分析した場合、ボリュームを越えることができるのでバッファー付きタンクをカバー プラグを開きます
    。 注: ため貯水池は、実験の間開いたままになります、この試金は外圧のない状態で実施し、重力流だけに依存しています。顕微鏡下の表に、重力によって流れの速度を増加するドレインを配置できます
    2. 。
  2. は、バイオ センサーの応答の分析の 3 s 間隔で 40 × 対物装備倒立蛍光顕微鏡に RFP または GFP 固有照明と細胞のイメージングを開始します。また、全体のセル移動の分析 10 秒間隔で 20 × 対物を使用して位相コントラスト画像します
    3. 。 ゼロ圧力設定にいくつかのフレームの後の流れをオンに
  3. (すなわち 流れが重力だけであったり 〜 15 dyn/cm 2) オープンの位置にバルブを切り替えることによって。流体のレベルは 5-10 ml 貯水池に該当するときより多くのバッファーを持つトップします。空気の泡を行う行に閉じ込め得ること流体を慎重に追加してください
    。 注: セルにショック反応を避けるために同じ温度の液を追加することが重要です
    4. 。
  4. セル速度と永続化移行解析ソフトウェアを用いた定量化 (詳細については 材料の表 を参照してください) メーカーによると ' の指示
    5. 。

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結果

急性の機械的刺激に対する走化性の規制当局の時間応答

D. キイロタマホコリカビ細胞の機械的刺激に対する反応を評価するために付着凝集有能なセルはせん断流れの短いパルスにさらされました。集計主務+ キイロタマホコリカビ細胞分泌するキャンプは、隣接する細胞で感知することができます。細胞シグナリングの貢献を克服するために細胞は、カフェイン、 d. 菌のアデニル酸シクラーゼを抑制し、キャンプ分泌28を防止することと扱われました。確かに、セルと前処理をカフェイン PKBR1 および ERK2 の非常に低い基底活性を持っていた、これらのキナーゼ (図 1 a) せん断流 5 秒刺激の重要な残基のリン酸化の強力な増加を示した。応答一時的なされ、ピークの周り 10-15 s、PKBR1 と 30 前後、ERK2 の ...

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ディスカッション

ここで説明する方法は、人口とせん断流れに対する個々 のセル動作の両方を評価するために便利な方法を提供しています。重要なは、以前の研究は、導くおよび移行中にエッジ マーカーをラギングの局在解析、現在のアプローチは鋭くせん断流を適用することによって即時の効果の調査をできます。このメソッドを使用して、実際には、せん断流れに細胞の初期応答必要がないこと細胞の移動を行った。代わりに、初期せん断流刺激に対する迅速かつ過渡応答せん断流れ、走化性因子のグラデーションを見て初期グローバル応答と同様に、長時間見られる方向の移行の前に。

各メソッドは異なる長所と短所を持っているにもかかわらず、生化学的およびミクロ的アプローチは補完的なデータを生成します。続いてセル換散、PKBs、KrsB、および、ERK のイムノブロット刺激はたとえば、菌の全人口を分析し、こうして個々 のセルの動作を検査するアッセイとは異なり、細胞間変動の平均値します。ただし、人口に基づく試金は個々 の細胞を分析することによって簡単に観察できる細胞行動の微妙な変化をマスクする傾向があります。さらに、ここで説明した生化学的アッセイのみ理由...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、国立衛生研究所健康付与 R35 GM118177 PND によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬
デキストロースフィッシャーD16-1HL-5培地とSMプレートの調製に使用(ステップ1.1、1.2)
プロテオースペプトンフィッシャーDF0120-17-6HL-5培地の調製に使用(ステップ1.1)酵母
抽出物フィッシャー50-550-445HL-5培地とSMプレートの調製に使用(ステップ1.1、1.2)
Na2HPO4·7H2OFisherS373-500HL-5培地、および10Xリン酸緩衝液の調製に使用します(ステップ1.1、1.3)
KH2PO4FisherP386-500HL-5培地、SMプレート、および10Xリン酸緩衝液の調製に使用します(ステップ1.1-1.3)
ストレプトマイシン(硫酸ジヒドロストレプトマイシン)フィッシャーICN10040525HL-5培地の調製に使用します(ステップ1.1)
ペプトン(バクト)フィッシャーDF0118-17-0SMプレートの調製に使用(ステップ1.2)
K2HPO4FisherP288-100SMプレートの調製に使用(ステップ1.2)
寒天フィッシャーBP1423-500SMプレートの調製に使用(ステップ1.2)
MgSO4FisherM65-500DBバッファーの調製に使用(ステップ1.4)
CaCl2>FisherC79-500DBバッファー(ステップ1.4)カフェ
インフィッシャーO1728-500カフェイン(ステップ1.5)
cAMP(EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3フィート、5フィート-環状一リン酸、ナトリウム塩)フィッシャー11-680-1100MGcAMPの調製に使用(ステップ1.6)
葉酸シグマF7876葉酸の調製に使用酸 (ステップ 1.7)
トリスベースFisherBP152-5003X サンプルバッファーの調製に使用 (ステップ 1.8)
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)FisherBP166-5003X サンプルバッファーの調製に使用 (ステップ 1.8)
グリセロールFisherG33-5003X サンプルバッファーの調製に使用 (ステップ 1.8)
ジチオスレイトール (DTT)バイオ・ラッド16106103X サンプルバッファーの調製に使用 (ステップ 1.8)
ブロモフェノールブルーバイオ・ラッド16104043X サンプルバッファーの調製に使用 (ステップ 1.8)
NaFFisherS299-100プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むサンプルバッファーの調製に使用 (ステップ 1.8)
Na3VO4Fisher50-994-911プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むサンプルバッファーの調製に使用 (ステップ 1.8)
ピロリン酸ナトリウム十水和物ッシャーS390-500プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むサンプル緩衝液を調製するために使用します(ステップ1.8)
完全なEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル(ロシュ)シグマ11873580001プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むサンプル緩衝液を調製するために使用します(ステップ1.8)
ラトランクリンAエンツォライフサイエンスBML-T119-0100ラトランクリンA(ステップ1.9)を調製するために使用します
4-15% Tris-HCl ポリアクリルアミドゲルBio-Rad3450029イムノブロッティングに使用 (ステップ 3.3)
ポリフッ化ビニリデンBio-Rad1620177イムノブロッティングに使用 (ステップ 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) ウサギ抗体細胞シグナル伝達2060イムノブロッティングに使用するための一次抗体 (ステップ 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP 抗体Cell Signaling4370一次抗体 (ステップ 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Entire Ab (from Donkey)GE HealthcareNA934-100ULSecondary antibody for use in immunoblotting (ステップ 3.3)
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate)Bio-Rad1705060イムノブロッティング用 (ステップ 3.3)
ストリッピングバッファー(Restore Plusウェスタンブロットストリッピングバッファー)ピアスPI46430イムノブロッティングに使用(ステップ3.3)
クマシーブリリアントブルーフィッシャーPI20278イムノブロッティングに使用(ステップ3.3)
K.エアロゲネス株(非病原性)ディクティストックセンター(dictybase.org)
名前Companyカタログ番号コメント
><材料および機器
Orbitalシェーカー(モデルG-33、または同等の代替品)ニューブランズウィック州科学的な使用K.aerogenesを成長させ(ステップ2.1.1)、およびD.discoideum細胞をbasalateおよび刺激する(ステップ3)。このシェーカーの旋回半径は9.5mmです。
10 cm ペトリ皿フィッシャーFB0875712SM プレートの準備に使用 (ステップ 1.2)
血球計算盤フィッシャー02-671-51BD. discoideum 細胞のカウントに使用 (ステップ 2.1.2)
35 mm ディッシュ (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)フィッシャー08-772Aに続く細胞溶解のためのプレートD. discoideum細胞に使用 (ステップ 3.1.1)
ポリスチレンカップ(5mL)VWR13915-985走化性物質でD.ディスコイデウム細胞懸濁液を刺激するために使用します(ステップ3.2.2)
ポンプ付き流体ユニット(イビディポンプシステム)イビディ10902チャネル内のD.ディスコイデウム細胞に機械的刺激を与えるために使用します(ステップ4.1、4.2、および5)
チャネル付きスライド(μ-Slide III 3in1 ibiTreat:#1.5ポリマーカバースリップ、組織培養処理、滅菌)同上80316デバイスによって供給される機械的刺激のためのプレートD.ディスコイデウム細胞に使用(ステップ4.1、4.2、および5)
50mLリザーバー(流体ユニット用同上リザーバーホルダー)同上10978チャネル内のD. discoideum細胞に機械的刺激を送達するための流体デバイスのセットアップに使用します（ステップ4.1、4.2、および5)
流体ユニットのライン（灌流セットYELLOW-and-GREEN同上10964内のD.ディスコイデウム細胞に機械的刺激を送達するための流体デバイスのセットアップに使用します（ステップ4.1、 4.2、および5)。注:2本のラインは、1.6mmチューブ(カタログ番号10842)からもカットできます。
ドレン用ライン(内径1.6mmチューブ)Ibidi10842チャネル内のD. discoideum細胞に機械的刺激を与えるための流体デバイスのセットアップに使用します(ステップ4.1、4.2、および5)。
40X/1.3オイル対物レンズと20X/0.3空気対物レンズ(または同等の代替品)を装備したZeiss Observer.Z1倒立顕微鏡コントラストまたは蛍光照明(ステップ4および5)でD. discoideum細胞を画像化するために使用されます40
0.75 オイル対物レンズ (または同等の代替品)Perkin-ElmerDM 16000D. discoideum 細胞の画像化に使用される代替品 (ステップ 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247、または同等の代替品) with Eppendorf InjectManEppendorf5252000021D and 5192000027マイクロピペットでD. discoideum細胞に機械的刺激を与えるために使用します(ステップ4.3)。注:カタログ番号は、機器の最新バージョン(4i)のものです。
マイクロピペット(フェムトチップ; 1 μm外径、0.5μm 内径)エッペンドルフ930000035マイクロピペットでD. discoideum細胞に機械的刺激を与えるために使用(ステップ4.3)
マイクロローダーチップ(Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)Eppendorf5242956.003マイクロピペット(femtotip)にバッファーを充填するために使用(ステップ4.3.1)
1ウェルチャンバー(Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)フィッシャー12-565-472マイクロピペットによる機械的刺激のためのD. discoideum細胞のプレートに使用します(ステップ4.3.2)
8ウェルチャンバー(Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)Fisher12-565-338バルクバッファー添加による機械的刺激のためのD. discoideum細胞のプレートに使用します(ステップ4.4.1)
NameCompanyカタログ番号コメント
Software
Image Analysis Software(フィジー)NIHhttps://fiji.sc/機械的刺激に対する反応を定量化するために使用(ステップ4.5)
移行解析ソフトウェア(Tracking Tool PRO)Gradientechhttp://gradientech.se/tracking-tool-pro/細胞の速度と持続性を定量化するために使用(ステップ5.4)
フィメンブレン 機械刺激とそれ流体チャネル 位相×/1.25–

参考文献

  1. Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
  2. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
  3. Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
  4. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
  5. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
  6. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
  7. Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
  8. Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
  9. Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
  10. Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
  11. Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
  12. Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
  13. Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).
  14. Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
  15. Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).
  16. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  17. Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
  18. Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
  19. Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
  20. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
  21. Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
  22. Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
  23. Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
  24. Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
  25. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
  26. Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
  29. Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
  30. Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
  31. Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
  32. Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).

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