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方法論記事

ひと心筋細胞外マトリックスの in VitroとIn Vivo応用のハイドロゲルを自己組織化に向けての処理

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DOI:

10.3791/56419

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2017年12月4日

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1Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2Berlin-Brandenburg Center for Regenerative Therapies (BCRT), 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), 4Deutsches Herzzentrum Berlin (DHZB), 5Department of Cardiovascular Surgery, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、その細胞外マトリックス成分を維持しながらひと心筋の完全な decellularization について説明します。さらに微粒子と胃酸の自己組織化ハイドロゲルの生産における細胞外マトリックスの結果の処理。

要約

無細胞性細胞外マトリックス製剤は細胞マトリックスの相互作用を研究するために役立ち、再生細胞療法の適用を容易にします。ゲルまたは膜として商業細胞外マトリックスのいくつかの製品がありますが、これらは組織固有の生物学的活性を持っていません。灌流 decellularization は通常は人間の心臓組織で可能でないために、浸漬 3 段 decellularization プロセスを開発しました。手術中に調達した人間の心筋スライスは最初イオン洗剤、ドデシル硫酸と孵化によって続いて洗剤無料高浸透圧換散バッファーと扱われ、固有の DNase 活性を利用することで完了です。ウシ胎児血清。この手法による心臓の細胞外マトリックスの細胞シートで残されて線維組織のアーキテクチャと生体高分子の組成を示した心臓細胞と多能性幹に特定の環境手がかりを提供するにはセルです。心臓の細胞外マトリックス シート、さらにさらに化学修飾することがなく微粒子粉末に加工したり、短期のペプシン消化経由で自己組織化心臓細胞外マトリックス ハイドロゲルに保存生体活性。

概要

細胞外マトリックス (ECM) だけでなく構造サポートが、生物の細胞にとっても重要ですし、組織機能1を提供します。中心部に線維化、炎症、血管新生、心筋収縮機能、生存率、および居住者の前駆細胞の運命などの病態生理学的応答の調節における ECM が参加しています。その主要なコンポーネント - 線維性糖タンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン - に加えて分泌された成長因子、サイトカイン、および核酸, 蛋白質の2,の3を含む膜小胞のホストが含まれます。

最近、無細胞性 ECM 準備がだけ潜在的な治療上のセル ベースのアプリケーションにとっても、細胞マトリックスの相互作用を研究するため非常に貴重ではないこと明確ななっています。治療細胞製品、エンジニア リング組織に適切な環境を提供することの重要性が広く認められています。定義された biopolymeric ゲル4,5,6またはマウス肉腫細胞 (すなわちマトリゲル、Geltrex) から分泌されるタンパク質カクテル細胞懸濁液または活性化合物を結合する試みがなされました。7しますただし、元の生物活性を限られている、後者は GMP グレード プロセスで問題が発生、心臓 ECM (cECM)8,9,10,の組織固有活性の両方に欠ける。11,12,13。

心筋の decellularization は以前冠血管14,15を介して心臓全体の灌流によって行われています。これは動物の心で可能ですが、そのまま人間の心はほとんどあります。したがって、手術で得られた組織のサンプルを処理することができます浸漬プロセスが支持されました。私たちの「3 ステップ」プロトコルは、別の 3 を含んでいるインキュベーション手順すなわち溶解、可溶化、および DNA 除去。それは主に保存されタンパク質とグリコサミノグリカンの構成16,17ヒト心筋 ECM を得られます。これらの cECM スライス体外細胞マトリックスの相互作用の研究を可能にするが、悪い潜在的な人間のスケールの治療への応用に適しています。製造工程、凍結乾燥 cECM 微粒子または cECM ハイドロゲル18生成に延長されました。

このプロトコルは、心筋細胞外マトリックス (ECM) とその生物学的活性の主要なコンポーネントを維持、手術標本から得られるひと心筋の decellularization を使用できます。保存された組織固有の生物活性を持つヒトの心臓 ECM が細胞マトリックスの相互作用に関する実験的研究に必要な場合、または細胞を用いた心筋再生のアプローチに適した環境が必要な場合は、このプロトコルをお勧めします。原則として、処理された cECM の使用は、実現可能な将来の治療への応用をする必要がありますにも GMP グレードの条件このプロトコルに適応する可能です。

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プロトコル

研究プロトコルは、ヘルシンキ宣言に記載されている倫理原則に適合し、シャリテ医科大学施設内審査委員会および倫理委員会で承認されました。提供されるすべての患者は、実験的研究のための中心のティッシュの使用のためのインフォームド・コンセント書かれて。

1. ひと心筋の区分のための準備

  1. 左室心筋を取得 (サイズは、手術の種類によって異なります) 手術室と冷 PBS 滅菌コンテナー輸送から直接。
  2. 無菌条件下で第 10 刃で生殖不能のメスのすべての脂肪組織を削除します。
  3. 約 1 × 1 × 1 cm のメスを使用してキューブに心筋をカットします。
  4. 50 mL の滅菌チューブにキューブを配置します。
    メモ: 一時停止、実行ステップ 1.5、それ以外の場合、2.2 の手順に進みます。蛋白質の分解と組織の品質の低下を防ぐために繰り返し凍結融解は避けてください。
  5. -80 ° C でキューブを含むチューブを格納します。組織は、数ヶ月間保存できます。

2. 心筋キューブのスライスの断面

  1. 冷凍庫から準備されたキューブを含む尿管を取る。
  2. クリオスタットに氷の上を転送します。
  3. -15 ° C にオブジェクトとチャンバーの温度を設定します。
    注: 適切な温度は完璧な区分を保証することが重要です。
  4. チル空 50 mL チューブ、商工会議所またはドライアイスのスタンプ。
  5. レイヤーを追加 (約 0.5 - 1.0 mL) コールド スタンプ、聞かせに cryosection 媒体のそれはそれが白と固体になるまで凍結します。
  6. Cryosection 中の 2 番目の層を追加し、この層に心筋キューブを配置します。
  7. Cryosection 培地を確認し、続行する前に、心筋が完全に冷凍します。
    注: サンプルと cryosection 中もフリーズしていないとき、断面損なわれます。完全に凍結 cryosection 媒体は流体と透明から固体、白い、および非透明に変わります。心筋のキューブでは、1 h 1.4 の手順からの続き場合を完全に凍結するまで、少なくとも 30 分を必要があります。組織の冷凍ピンセットで触れた/処理するときは変形する必要があります。
  8. ホルダーに冷凍心筋とスタンプを挿入してすべてのネジを締めます。
  9. でも断面の表面が得られるまでは、組織の表面をトリミングします。
  10. 300 μ m の厚さの切片を設定します。
  11. 冷凍の心筋のセクション自動断面を。これは均一断面を保証します。約 30-40 のセクションは、1 つのキューブからスライスすることができます。
  12. 50 mL の冷却管に緩くセクショニング後各スライスを配置します。
    注: を押さないでください、スライスまたはパックしっかりと。約 40 のスライスは、1 つの管に合うことができます。
  13. 満たされた管を閉じて、氷の上に配置します。
    注: 2.14 のステップの移動を一時停止、それ以外の場合に 3.2 の手順に進みます。
  14. 心筋スライス-80 ° C で保存します。スライスは、数ヶ月間保存できます。

3. ひと心筋の decellularization スライスします。

  1. -80 ° C のフリーザーと氷上輸送から心筋セクションを含む 50 mL チューブの必要な数を取る。
  2. ステップ 3.1 から 1 つの滅菌ビーカーにすべての 50 の mL の管の凍結切片を転送します。約 40 のスライスは、50 mL のチューブごとビーカーに追加されます。ビーカー 50 mL チューブ; 量の 3 倍をする必要があります。例えば、 1 つの 50 mL チューブの decellularization 150 mL ビーカーを使用します。
  3. 心筋スライスを 50 mL チューブあたり 50 mL 溶解ソリューション (10 mM トリス、0.1 %w/v EDTA、pH 7.4 H2O) を追加します。
  4. 室温で 2 時間の連続 100 150 rpm で滅菌ビーカーに心筋スライスを振る。
  5. 粗いこし器を通って組織のスライスと液体をひずみ。鈍ピンセットを持つ組織スライスを新しい滅菌ビーカーに転送します。PBS で心筋スライス (例えば、使用 100 mL SDS ソリューション心筋のセクションの 2 つの 50 mL チューブを脱がされている場合) の最初の 50 mL チューブあたり 0.5 %sds の 50 mL を追加します。
  6. 室温で 100-150 rpm で 6 時間継続的に横に振る。
  7. 粗いこし器を通って組織のスライスと液体をひずみ。新しい滅菌ビーカーに鈍ピンセットを持つ組織スライスを転送し、150 rpm で揺れながら 10 分を 50 mL の PBS で 3 回洗います。次に、1% ペニシリン/ストレプトマイシンと 1% で PBS で一晩洗ってナイスタチン (PBS-P/S ・ N) で 100-150 rpm と揺れながら 4 ° C。
    注: 徹底的に洗浄、残留の SDS を完全に削除することが重要です。SDS の残りのトレースは、ECM が細胞との組み合わせで使用される有毒です。
  8. 洗濯ソリューションを削除し、25 mL を追加 1% ペニシリン/ストレプトマイシンと 1 %fbs (37 ° C) を予熱した心筋のスライスの最初の 50 mL チューブあたり decellularized スライスにナイスタチンです。
  9. 37 ° C で 3 時間インキュベートします。この手順ですべての残りの DNA は、FBS の固有の DNase 活性によるマトリックスから削除されます。
  10. 新しい滅菌ビーカーにスライスを転送し、150 rpm で揺れながら 10 分を 50 mL の PBS で 3 回洗います。
    注: ECM スライスに格納できる PBS P S N 4 ° C で数日間。しかし、すぐに続行することをお勧めします。

4. 粉に Decellularized cECM の処理

  1. 新しい滅菌 6 ウェル プレートに緩く ECM のスライスを配置します。-80 ° C で ECM を凍結し、エアカーテンで 2 日間の凍結乾燥します。
    注: 1 つ以上のスライスは、ウェルあたり配置できます。井戸の表面を完全にカバーするスライスを配置します。スライスを重複しても、その後粉砕の成功には影響しません。
  2. ECM スライスの粉砕に使用特定加工チューブ (参照材料表) 含む 1.4 mm セラミック ビーズです。滅菌鈍ピンセットを使用して凍結乾燥の ECM で緩く管を埋めます。最適な結果を得るには、10-20 mg の間 ECM の総重量をお勧めします。
    注:、ECM は詰めすぎて加工管の場合粉砕プロセスは否定的影響します。
  3. スナップ-凍結チューブ液体窒素。
    警告:液体窒素は超低温、適切な個人用保護具を着用します。
  4. フライス盤に冷凍のチューブを挿入し、ECM を粉砕します。
    1. 30 の期間設定 s、最大速度、デバイスを起動します。
    2. 終えた後、チューブを取り出し、再度に凍結液体窒素で。
    3. 5 回繰り返します。
  5. 1 mL ddH2O あたりチューブと手ふれや完全な可の渦を追加することによって、チューブから微粒子を洗います。50 mL のチューブに 200 μ m メッシュで異種のソリューションをフィルター処理します。
  6. -80 ° C または液体窒素でチューブを固定します。
  7. 管の標準蓋を 0.22 μ m のフィルターに置き換えます。このフィルターのふたは粉がチューブから流れ出るを防ぐ水の蒸発の空気の循環をことができます。
  8. エアカーテンでチューブを挿入、ステップ (ステップ 4.5) から水を除去するもう一度凍乾
    メモ: この手順で凍結乾燥は 3 日前までにかかります。
  9. さらに処理まで-80 ° c の粉を保存または 5.1 の手順に進みます。

5. cECM 微粒子の酵素による均質化

  1. 1 Mg/ml の濃度を 0.01 M 塩酸 (pH 2.0) 豚ペプシンを溶解します。それを完全に溶解するまで室温でシェーカーに配置します。
  2. 最終濃度 10 mg/mL にペプシン溶液中凍結乾燥人間 ECM 粉末 (ステップ 4.8) で溶解します。ピペッティングを徹底的にミックスします。総容積は必要な ECM ソリューションの量に依存します。たとえば、ECM 粉末 1 mL ペプシン溶液の 10 mg を溶解します。
    注: 粒子の溶解は、穏やかなボルテックス (1,000-1,500 RPM) をサポートできます。残りの微粒子の塊すると、消化に悪影響を及ぼす可能性があります。
  3. チューブあたり 1 mL の量 2 mL チューブにソリューションを転送します。
  4. 48 時間は、27 ° C、1,200 rpm 管シェーカーにチューブを置きます。
  5. チューブを取り出してシェーカーと氷や予冷チューブ ホルダーの上に配置。
  6. ミックス 1/9 寒い 10 x PBS (pH 7.4) 冷たい 0.1 M の ECM ソリューションの体積の 1/10 の ECM ソリューションの量の水酸化ナトリウム冷却管と氷の上の場所。この混合物は消化の ECM ソリューションを中和し、ペプシンを不可逆的に不活化します。
  7. ECM ソリューションを追加すると、中和の混合物、ピペッティングまたはボルテックスを徹底的にミックスします。
  8. ECM を 1x PBS (pH 7.4) と目的の濃度に設定します。解決の pH は、ph 試験紙でチェックできます。
    注: 10 mL で計算の例は消化 ECM ソリューションです。
    HCl (pH 2.0) 10 mL に 10 mg 豚ペプシンを追加します。
    100 mg ECM 粉末をペプシン ソリューションに追加します。
    注: 10 mL を中和するための計算例消化 ECM ソリューションと 8 mg/mL の濃度に設定。
    巻最終開始c x Vol開始=/c最終10/mL x 10 mL/8 mg/mL を = = 12.5 mL
    巻10xPBS集開始=/9 = 1/9 10 mL = 1.11 ミリリットル 10 x PBS から
    巻NaOH集開始=/10 = 1/10 10 mL = 1 mL から
    巻1xPBS集最終- 巻開始- 巻10xPBS - 集NaOHを = = 12.5 mL ・ 10 mL ・.11 mL-1 mL = 0.39 mL

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結果

ひと心筋の decellularization の 3 ステップのプロトコルは、ECM のキーコンポーネントと ECM の高次構造を維持しながら細胞材料のほぼ完全な除去の結果を掲載します。Decellularization 後、組織からの細胞の総除去 (図 1 a) の色の変化によって明白であります。H & E とマッソン Trichrome 汚れと組織学的分析では、そのまま残留細胞 (図 1 b) の完全な欠如を明らかにしました。ECM の個々 のコンポーネントの定量的アッセイ SDS だけで (図 2 a) によって decellularization と比較してより完全な DNA 除去と総コラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカンのより良い保全を明らかにしました。機能性 cECM の生物学的活性に関するエビデンスは図 2 b

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ディスカッション

目標は次を達成するために、ヒトの心筋 ECM を準備するとき: 免疫細胞の関連資料、ECM の整合性と生理、不妊、最終製品、GMP プロセス互換性の非毒性の保全の除去と処理の面で特定のアプリケーションのための製品の適合性。微粒子や自己組織化ハイドロゲルにさらなる処理と私たち 3 段 decellularization プロトコルを組み合わせて、人間の心臓の ECM 材料が得られ、特定の生物学的作用を有している、簡単な操作で可能性を秘めていると複数アプリケーション体外と体内の、何がいくつかの動物種11,13,20,21から ECM 製品に示されているよう。

心筋組織の初期処理中に、化合物の濃度と治療期間が 300 μ m のスライスの滴定されているため断面と同一の厚さのスライスを心筋に重要です。...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

研究プロトコルは、ヘルシンキ宣言に記載されている倫理原則に準拠しています。患者組織の研究目的のための使用のためのインフォームド コンセントの提供し、組織を収集するプロセスは、制度検討委員会とシャリテ ・ ベルリン Universitätsmedizin (EA4/028/12) の倫理委員会によって承認されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BalanceDR Precisa, Dietikon, SwitzerlandPrecisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3InstrumenteNRW, Erftstadt, GermanySK-10-004
Cell culture plates (6-well)Greiner, Frickenhausen, Germany657160
Cryostat CMLeica, Wetzlar, Germany3050S
EDTACarl Roth, Karlsruhe,ドイツ8043.3
エッペンドルフ反応チューブ (1.5 または 2 ml)Greiner, Frickenhausen, Germany616201, 623201
Falcon 15ml, 50mlGreiner, Frickenhausen, Germany188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS)Biochrome, Berlin, GermanyS 0115
Freeze Dry SystemLabconco, Kansas City, USA7670520
冷凍庫 (-80°C;C)Thermo Scientific, Waltham, MA, USAForma 900 Series
HClCarl Roth, Karlsruhe, Germany281.1
Microtome Blades Type 819Leica, Wetzlar, Germany14035838925
Minilys HomogeniserPEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany91-PCSM
NaOHCarl Roth, Karlsruhe, GermanyK021.1
NystatinPAN Biotech, Aidenbach, GermanyP06-07800
PBSThermo Scientific, Waltham, MA, USA14190-094
Penicillin/streptomycinLife Technologies, Darmstadt, Germany15140122
PepsinSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyP6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mmPeqlab Biotechnolgie,エアランゲン、ドイツ91-PCS-CK14
Rotamax 120 プレートシェーカーハイドルフ、シュヴァーバッハ、ドイツ544-41200-00
SDSカール・ロート、カールスルーエ、ドイツCN30.3
実体顕微鏡ライカ、ヴェッツラー、ドイツM125
Steriflip-GP、0,22 & マイクロ;mメルクミリポア、ダルムシュタット、ドイツSCGP00525
スチュアートアナログロッカー&ローラーミキサーシグマアルドリッチ、タウフキルヒェン、ドイツZ675113-1EA
Tissue Tek O.C.Tコンパウンドハルテンシュタイン、ヴュルツブルク、ドイツTTEK
輸血セット200µmSarstedt, Nümbrecht, Germany798.200.500
TRISCarl Roth, Karlsruhe, Germany5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mmMedical Highlights, Rohrdorf, GermanyCV102-003
Vortex-Genie2Scientific Industry, New York, USASI-0256

参考文献

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