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方法論記事

巨核球分化および人間の血小板形成臍帯血由来 cd34 陽性細胞の+

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DOI：

10.3791/56420

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2017年12月27日

 ,  ,  , 
1Haematology Research Unit, St George and Sutherland Clinical School, University of New South Wales, 2Haematology Department, St George and Sutherland Hospitals

この記事について

サマリー

巨核球の人口は非常に純粋なコードから得られる血由来 CD34+細胞。CD34 のメソッド+細胞分離と巨核球分化をここで説明します。

要約

血小板は、骨髄血小板と呼ばれるプロセスで主に発生します。血小板産生、中に造血前駆細胞は巨核球は、proplatelets と呼ばれる長い細胞質プロセスから血小板を解放する区別する末期と呼ばれるフォーム血小板前駆細胞に区別します。巨核球は骨髄に閉じ込められた珍しいセルであり、実験室の使用のための十分な数字で収穫することは困難であるため。ヒト巨核球を効率的に生産することができます達成体外CD34 を養殖+の適した条件下のセルします。ここで詳細なプロトコル CD34 の分離を記述する臍帯血液サンプルから磁気セルソーターによる細胞の+ 。無血清条件下で非常に純粋な成熟した巨核球の生成に必要な手順を示します。巨核球分化の表現型解析および proplatelet の形成と血小板の生産の決定の詳細もあります。巨核球分化および/または抗血小板抗体などトロンボポエチン ヒューマンミメティック最前線の proplatelet の形成に影響を与えるエフェクターは、生物学的機能を調べるための培養細胞に追加できます。

概要

通常研究室用プライマリ ヒト巨核球 (MK) の十分な数の分離は不可能です、骨髄での低周波による有核細胞1の ~0.01% のアカウントは、彼ら。便利な代替手段は、拡張前のヴィヴォと造血幹・前駆細胞の特定の成長因子の存在下で分化です。巨核芽球の文化の最も効果的な成長および分化因子は、MKs。 トロンボポエチン (TPO) を生産する培養システムの採用 (SCF; c キット リガンド) 幹細胞因子とインターロイキン (IL)-3 IL 11 などサイトカインの数がされています。単独で、または SCF と IL 32などの他のサイトカインが有効であります。TPO は、増殖と MKs2の成熟の両方で発生する幹細胞集団を操作できます。

1000 までは毎日 150-400 x 109/L. 血小板生産の in vitroの血小板数を維持するために形成された proplatelets と呼ばれる細胞質突起から MK プロデュース血小板や、生体内で約 1 × 10 の11の血小板が-これは CD34 を使用して多数の培養条件に上昇を与えているし体内の見積もり3より低いフォールド+を改善する MK と血小板生産体外造血前駆細胞。CD34 の初期ソース+ MK 分化用細胞は、ひと末梢血4だった。骨髄5,6、胚性幹細胞/誘導多能性幹細胞 (ESC/iPSC)7臍帯血 (UCB)8,9,10 などの他の細胞の源.ひと骨髄 CD34+ 11とマウス系統負, 骨髄細胞5生産 MK と血小板体外;人間の骨髄の可用性の欠如が CD34 のソースとしての使用を制限するそれにもかかわらず、+のセル。対照的に、ESC と iPSCの in vitro血小板の生産のための細胞の無制限のソースを表します。これらの細胞からの血小板の生産には、フィーダー細胞マウス OP9 細胞長期培養などが必要です。フィーダー無料条件で派生した血小板は、少ない機能12のように見えます。iPSC 由来血小板が大規模に拡張することができますので、臨床の現場で使用する可能性があります。このプロセスには、転写因子と長期的な細胞文化13レンチウイルスベクターを介した情報伝達が必要です。

UCB は CD34 のアクセス ソース+で容易に使用することができます細胞研究設定。TPO だけではコードの分化を促進することができます血由来 CD34+の血清添加またはフィーダー細胞との共培養を必要とせず非常に純粋な成熟した MKs を生じさせる細胞とこれ。他のサイトカイン SCF UCB CD34 から分化が低下するなど、+細胞、フェルマーの最終定理 3 配位子と IL-11 未熟な巨核球14の生産を推進中。このプロトコルは非常に純粋な臍帯血 CD34 から MK 文化+の生産を記述する無血清条件下で細胞。

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プロトコル

このプロトコルは南東シドニー人間研究倫理委員会で承認され、大学のニュー ・ サウス ・ ウェールズの人間研究倫理委員会によって批准されました。健康なドナーから得られる臍帯血によって、シドニーの臍帯血バンク (シドニー, ニューサウス ウェールズ州, オーストラリア) が提供されました。約 100 mL のボリュームは、この手順で使用されました。

メモ: クラス II バイオ セーフティ キャビネットの無菌技術を使用であります。70% エタノールで臍帯血バッグの外側を消毒します。この手順 (はさみ、ピンセット) 滅菌器具を使用します。

1. 臍帯血細胞調製と CD34 の単離細胞の+

  1. 滅菌分離バッファー (SB) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で、pH 7.2, と含まれている 0.5% のウシの血清アルブミンと 2 mM EDTA を準備します。
  2. (血液の 10 mL あたり 1 つの管が必要) 50 mL コニカル チューブに SB の 10 mL を分注します。10 mL のシリンジにマウントされている G18 鈍針を使用して、バッグから 10 ミリリットルの血液を描画し、SB の 10 mL を含む 50 mL チューブに分注します。
  3. 2 つの層を作成する、希釈血液の入ったチューブの底部に 15 mL のリンパ球分離培 (材料の表を参照) を追加します。
    注: は、異なる層の混合を避けるために管の下でゆっくりとメディアを調剤します。
  4. 区切りなしとアクセラレータなし室温 (RT) で 30 分間 1,200 × g でチューブを遠心します。
  5. パスツール ピペットを使用して新しい 50 mL チューブに単核細胞 (各チューブから約 5-10 mL) を格納筒の中心に近い層を転送します。各容量 50 mL のチューブに SB を追加します。
  6. RT。 破棄で 10 分の 400 × g で遠心上清。
  7. 浮遊細胞 SB. コンバインの 5-10 mL のパスツール ピペットで注意深く細胞ペレットを再懸濁します、SB にて 50 mL にボリュームをもたらします。
  8. トリパン ブルー染色および診断を使用して、または自動のセルを数える細胞カウンター (材料の表を参照してください)。CD34 のパーセンテージを決定+のセルをサンプルでは、2.5 × 10 を再懸濁します5セル SB と染色の 100 μ L で 4 ° C で 15-30 分の抗 CD34 PE 抗体の 10 μ L を追加することによってフローサイトメトリー (図 1 a) によって分析します。
  9. 4 ° C で 10 分間 400 × g で遠心管上清を捨てます。
    注: すぐに必要でなければ、単核細胞はこの段階で冷凍することができます。
  10. SB の 300 μ L 108細胞/細胞を再懸濁します。FcR はヒト IgG の 100 μ L を追加 (ブロッキング試薬、材料表を参照) と 10 の8セルあたり CD34 磁気ビーズの 100 μ L。穏やかに混合し、, 4 ° C、30-40 分で。
    メモ: 単一細胞懸濁液は必要です (必要に応じて、細胞を通過も 30 μ m フィルター試薬を追加する前に)。記載されている以下の 10 の8セルの試薬ボリュームを使用します。以上 10 の8セル試薬 (SB、ブロッキング、および、CD34 磁気ビーズ) をそれに応じてスケール アップします。
  11. マグネット ホルダーに LS 列を配置し SB. 破棄の 3 mL 洗浄廃液、潜伏期間中に LS 分離カラムを準備します。
    注意: LS 分離カラムは最大 2 × 10 の8セルの総数をロードできます。小さくより大きい列があります。
  12. セルの混合物に SB の 5-10 mL を追加し、400 × g で 10 分間遠心上清を破棄します。
  13. SB の 1.5 mL の細胞を再懸濁します、LS 列に細胞懸濁液 (1.5 mL) を読み込みます。15 mL コレクション チューブ (負の分数 #1) のラベルのないセルを含む流れを収集します。ドレインし、SB の 1.5 mL でコラムを洗浄液ができます。
  14. (3 mL) を通じて収集した流れを列に読み込むし、同じ 15 mL コレクション チューブ (負の分数 #1) の流れを収集します。SB の 3 mL で 3 回 LS 列を洗います。
    注: 必要な場合、負の分数 (12 mL) でセルと汚されることができる抗 CD34 抗体 CD34 のキャプチャを確認するために+ LS 列による細胞します。
  15. 磁選機から列を削除し、SB の 2 mL で新しい 15 mL チューブに注射器のプランジャーをゆっくりと細胞をフラッシュします。
  16. 列に戻って戻って磁気分離装置と負荷セルの 2 mL に列を配置します。流れを収集し、2 ml の SB を洗います。これは、負の分数 #2 (4 mL) です。
  17. 磁気分離装置から LS 列を削除し、CD34 を収集するためにシリンジのプランジャーで着実に、しっかりと SB. フラッシュ セルの 2 mL を追加+細胞画分。トリパン ブルー染色、検定または自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。
  18. 4 ° C で 15 分間 400 × g で肯定的な分画遠心分離機管上清を捨てます。Cd34 陽性の血清自由な媒体の細胞を再懸濁します+細胞 (SFM、材料表を参照してください)。
    注: すぐに必要でなければ、セルを固定できる液体窒素でこの段階で。

2. 純度チェック分離 cd34 陽性細胞の+

  1. 2 x 104 10 μ L 抗 CD34 PE 抗体と 4 ° C (アイソタイプ コントロールのために個別のチューブ使用) で 15 分の 20 μ L 抗 CD45 PerCP 抗体陽性分画細胞を染色 (図 1 b)。
  2. 洗浄する SB の 1 mL を追加します。400 × g で 10 分間の遠心分離機の SB の 200 μ L にペレットを再懸濁します。
  3. フローサイトメトリーによる解析を行い、ゲートの残骸 (図 1 b) を除外する生きているセルの人口。PE、PerCP アイソタイプ コントロール (図 1 b) を使って PE、PerCP の肯定的な人口のためにゲートを設定および cd34 陽性の割合を決定する+/CD45+細胞。

3. 巨核球分化

  1. シード 5 × 105セル/mL cd34 陽性細胞 12 ウェル プレートのウェルあたり 50 ng/mL の組換え人間トロンボポエチン (rhTPO) を添加した SFM の 2 mL の+ 。37 ° c、5% CO2加湿雰囲気の中で細胞を孵化させなさい。分析のために必要である前に、細胞が合流、セルを収穫し、新鮮なメディアと rhTPO の複数の井戸に分割します。
    注: 2 つまたは 3 つの井戸は、異なる時点 (例えば7、9、および 10 日間) で分化を監視するために特に準備されるべき。
  2. 他の井戸のセルを妨げないで分化を監視するために脇の井戸から細胞を採取します。
  3. 20 μ L 抗アスピリン/CD41 FITC 抗体で染色細胞と 100 μ L の最終巻で 10 μ L 抗 GPIX/CD42a Alexa Fluor 647 抗体コントロール設定はそれぞれアイソタイプ コントロール抗体を用いた管します。4 ° C で 15-30 分間インキュベートします。
  4. 洗浄する SB の 1 mL を追加します。
400 × g で 10 分間破棄上澄みで遠心し、フローサイトメトリーによる SB. 分析の 200-300 μ L でペレットを再懸濁します。
  • 各 fluorophore の FITC と Alexa 小麦粉 647 の肯定的な人口のためのゲートを設定するアイソタイプ コントロールを分析します。CD41 の割合を判断する染色細胞サンプルの分析+/CD42a+ダブル陽性細胞、成熟した MK (図 1) を表わす。
  • 可視化セルの表面マーカーは、3.3 で説明したように細胞を染色します。
    1. 洗浄する SB の 1 mL を追加します。400 × g で 10 分間遠心分離が 100 でペレットを再懸濁します SB と 30 s. 空気乾燥、メタノールで浸ることによってスライドの 5 分修正セル 1,000 x g でスライド ガラス上にスピンの μ L を追加 DAPI を含むメディアのマウントの 20 μ L (材料の表を参照)、、coverslip でカバーし、蛍光顕微鏡 (図 2 a) を使って視覚化。
  • 細胞内抗原の可視化は、PBS のセルを再懸濁します、室温で 15 分間パラホルムアルデヒド (最終濃度が 1%) で修正します。セルを permeabilize トリトン X100 (0.1%) を追加し、PBS/0.1% トリトン X100 2 mL を 15 分洗浄セル間インキュベートします。PBS/0.1% トリトン X 100 の 100 μ L で再懸濁します抗 vWf や抗 CD62p 抗体 (希釈 1: 200) 追加して、室温で 30 分間インキュベートします。
    1. 2 mL PBS/0.1% トリトン X100 で洗って 10 分 400 × g で遠心分離機、同じバッファーの 100 μ L で再懸濁し、抗マウス IgG Alexa 594 と抗うさぎ IgG アレクサ 488 (1: 100) を追加します。室温で 30 分間インキュベート、2 mL PBS/0.1% トリトン X100 で洗って、同じバッファーの 100 μ L で再懸濁します、CD42b APC アンチの 20 μ L を追加します。3.6.1 の手順で説明するようにスライド ガラスに細胞をスピンし、3.6.1 の手順で説明するよう、顕微鏡可視化のサンプルを準備します。
  • 倍数性決定のため日 12 または 13 分化細胞を収穫します。洗浄する SB の 1 mL を追加します。10 分の 100 μ L の最終巻に 20 μ L 抗アスピリン/CD41 FITC 抗体染色 400 × g で遠心 4 の ° c で 30 分間加温。
    1. SB の 1 mL で 1 回洗浄し、低張性クエン酸バッファー (1.25 mM クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム 2.5 mM、3.5 mM ブドウ糖) 含む 20 μ g/ml propidium ヨウ化物及び 0.05% の 300 μ L でペレットを再懸濁しますトリトン X 100。光から保護 4 ° C で 15 分間インキュベートします。
    2. 最終濃度 20 μ G/ml に RNase を追加し、光から保護 4 ° C で 30 分間インキュベートします。CD41 FITC+の人口 (図 2) の 30,000 に 50,000 イベントを収集して、フローサイトメトリーによる propidium ヨウ化物の強度を決定します。

    • 4. proplatelet カウント、血小板の列挙、および血小板の活性化

    1. 1 × 104細胞/ウェル 50 ng/mL rhTPO を添加した新鮮な SFM の 200 μ L で 48 ウェル プレートでの日 8 または 9 の分化と種 (ステップ 3.1) から細胞を採取します。37 ° C、5% で 5 日間文化 CO2.
      注: 定量用、種子は 3 通の井戸します。この低密度は可視化に必要な文化の 2 日後に表示される proplatelet 担 MK. Proplatelets 通常のカウント開始。ピークは、4 日から 5 日間です。
    2. 10 X、20 X 目標を用いた倒立顕微鏡上全体の井戸の proplatelet ベアリング MK の数をカウントします。
      注: 温水 (37 ° C) 顕微鏡のステージは、proplatelet 拡張子の収縮を引き起こす長時間室温で細胞を維持するので望ましい。Proplatelets は、MK の体から長い拡張子として観察されます。各 MK proplatelet いくつかの突起があります。Proplatelets を開発し、MK の本体サイズが小さくなります。
    3. 細胞を収穫し、室温で 10 分間 400 × g で遠心分離機します。3.3 と 3.4 の手順で説明するように 20 μ L 抗ひと CD41 FITC 抗体で細胞を染色します。Proplatelet ベアリング MK (pbMK) のパーセンテージを計算: pbMK (%) = [(Proplatelet ベアリング MKs よく/)/(総 CD41+細胞/ウェル)] x 100
    4. 培養液中に放出される血小板をカウントするには、優しくパスツール ピペットで細胞をミックスし、14 または 15 文化の日で 100 μ L を収集します。
      1. 4 ° C で 20-30 分の 20 μ L 抗ひと CD41 FITC 抗体で染色します。それぞれのアイソタイプ コントロール抗体を用いた制御管を設定します。
      2. SB の 150 μ L とビーズを数えるの 50 μ L を追加します。
      3. フローサイトメトリーによる解析、FSC と SSC を対数スケールを設定します。血小板豊富な血しょうから使用通常ひと血小板は、セクション 4.4.1 血小板 (図 3 a) のゲートを設定するの説明に従って CD41 FITC と汚れます。
      4. フローサイトメトリーによるビーズを数えるとステンド グラスの血小板を分析します。SSC 散布図 (図 3 a) と FSC を用いたビーズを数える 1,000 イベントを収集します。CD41 FITC ポジティブなイベント (図 3 b) 数式を使用してに基づく血小板の数を計算します。
        Μ L あたり血小板 = [(CD41 FITC 肯定的なイベントの番号)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/ボリュームのサンプル)]
    5. 血小板の活性化を分析するには、優しくパスツール ピペットで細胞をミックスし、14 または 15 文化の日で 100 μ L を収集します。細胞のペレットに 5 分間、200 x g でタイロード バッファー (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2、 0.2 mM Na2HPO4、12 mM NaHCO3、5.5 mM D-グルコース、pH 6.5) および遠心分離機の 1 mL を追加します。
      1. 血小板サイズの粒子をペレットに 10 分間、800 × g で遠心、上清を収集します。
      2. 上澄みを廃棄し、タイロード バッファーの 100 μ L で再懸濁します。PAC1 FITC 抗体とアデノシン二リン酸 (ADP) の 20 μ L を加える最終濃度 20 μ M の FITC 肯定的なイベントの割合を決定するため 20 分分析フローサイトメトリーによる部屋の温度で加温。肯定的な制御 (図 3) と同じように扱われる新鮮なひと血小板を使用します。

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    結果

    このプロトコルにより、コードから高純度の MK 文化準備血由来 CD34+細胞。CD34 の割合+細胞コード血は約 1.315 (図 1 a)、10 x 90-300 から単核細胞 (ステップ 1.8) 範囲の総数 UCB 単位6 。CD34 の純度 + CD45 陽性細胞分離範囲は 90 から 99% (図 1 b) 後。MK (CD41 として定義されている+細胞) 無血清 CD34 の早い段階で観察される+細胞 rhTPO の存在下で培養します。7 日の割合成熟 MK (CD41+と CD42a+細胞) は通常 30-40% (図 1)。最高レベルの CD41+と CD...

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    ディスカッション

    ここで説明されているプロトコルは、MK と臍帯血から文化における血小板の一貫生産に適しています。これらの細胞は、MK 増殖、分化、proplatelet の形成と血小板の生産に及ぼす薬や生物学的活動など様々 なプロセスを研究に使用できます。

    文化メディアとサイトカインの組み合わせの様々 な文献で紹介されています。また幹細胞因子、フェルマーの最終定理 3 配位子、IL-3、IL-6 サポート CD34 などサイトカインの+は細胞増殖です。しかし、この拡張は文化14の減らされた MK 純度の結果します。無血清メディアとだけでも、rhTPO を使用して、ここで提示法前駆細胞の大幅な拡大はできませんが unilineage 巨核球の増殖と分化、MK の一貫生産が可能 (90-99 %cd41+CD42a+二重陽性細胞) 他の血統からの汚染なし。MK の形成のための培養時間は 10 ~ 12 日間質をサポートまたはフィーダー細胞を必要とせずです。これはより大きい文化期間 (20 ...

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    開示事項

    著者が明らかに何もありません。

    謝辞

    著者は、(プロジェクト助成 1012409 BHC にリンク) オーストラリア健康と医学研究評議会のサポートを認めます。

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    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    細胞培養試薬
    組換えヒトTPOMiltenyi Biotec130-094-013
    StemSpan SFEM IIStem Cell Technologies9605CD34 +細胞用無血清培地
    名前Companyカタログ番号コメント
    strongCD34 単離試薬
    CD34 MicroBeadキット 超高純度Miltenyi Biotec130-100-453このキットには、FcRヒトIgGブロッキング試薬とCD34マイクロビーズが含まれています。これらのビーズには、抗CD34抗体クローンQBEND/10が含まれています。純度チェックには、別の抗CD34クローン(クローン8G12など)を使用します。
    LymphoprepAlere Technologies1114545リンパ球分離培地 (密度 1.077 g/mL)
    滅菌分離バッファー (SB)Miltenyi Biotec130-091-221このバッファーには、0.5% ウシ血清アルブミンと 2 mM EDTA を含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.2 が含まれています。無菌の細胞培養グレードのコンポーネントを使用して調製できます。気泡がカラムを塞ぐ可能性があるため、使用前にガスを抜いてください。
    名前会社カタログ番号コメント
    Flow Cytometry and Cell Staining Reagents
    PE Mouse anti-Human CD34BD Biosciences340669Clone 8G12.CD34の純度チェックにお使いいただけます。最終抗体濃度1:10希釈。
    PerCPマウス抗ヒトCD45BD Biosciences3474641:10
    PerCPアイソタイプコントロールBD Biosciences3490441:10
    FITC マウス抗ヒトCD41aBD Biosciences340929最終抗体濃度1:5希釈。
    APCマウス抗ヒトCD42bBDバイオサイエンス551061この抗体は、成熟MK(通常、抗CD42aよりも低い陽性細胞の割合)を検出するためにも使用できます。最終抗体濃度1:10希釈。
    Alexa Fluor 647 マウス 抗ヒト CD42aAbD セロテックMCA1227A647T現在、バイオ・ラッドが販売しています。最終抗体濃度1:10希釈。
    Alexa Fluor 647 Mouse Negative ControlAbD SerotecMCA928A647現在、バイオ・ラッドから販売されています。アイソタイプコントロール抗体
    アンチフォンヴィレブランド因子ウサギポリクローナルアブカムAB69941:200
    V450マウス 抗ハムナ CD41aBD バイオサイエンス584251:20
    V450アイソタイプコントロールBDバイオサイエンス5803731:20
    PAC1-FITC 抗体BDバイオサイエンス3405071:10
    抗CD62pマウスモノクローナルAbcamAB66321:200 希釈
    Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ IgGInvitrogenA110081:100 希釈
    Alexa Fluor 594 ヤギ抗マウス IgGInvitrogenA110201:100 希釈
    Ig アイソタイプコントロール カクテル-CBD Biosciences558659アイソタイプコントロール抗体
    ヨウ化プロピジウムSigma AldrichP4864
    CountBright Absolute Counting BeadsMolecular Probes, InvitrogenC36950カウンティングビーズ
    名前会社カタログ番号コメント
    材料
    LSカラムMiltenyi Biotec130-042-401小型および大型のカラムも市販されています
    MidiMACSセパレーターマグネットMiltenyi Biotec130-042-302
    MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
    Falcon 5mL丸底ポリプロピレンFACSチューブ、スナップキャップ付き、滅菌In Vitro技術352063
    スライドガラスMenzel-GlaserJ3800AMNZ
    封入剤 DAPI付き Vector LaboratoriesH-1200あせ防止封入剤 DAPI
    名前会社名カタログ番号コメント
    strong<>Equipment
    倒立顕微鏡ライカDMIRB 倒立顕微鏡
    蛍光顕微鏡ツァイスVert.A1
    細胞分析装置BD バイオサイエンスFACS Canto II
    サイトスピン遠心分離機サーモサイエンティフィックサイトスピン 4
    名称会社名カタログ番号コメント
    ソフトウェア細胞
    分析ソフトウェアBD BiosciencesFACS Diva ソフトウェア
    シングルセル解析ソフトウェアTree StarFlowJo
    蛍光顕微鏡ソフトウェアZeissZen 2 blue edition
    希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 色

    参考文献

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