成長および線虫の繁殖に対する薬剤の効果を測定

毒性学的評価は、医薬品、栄養補助食品、機能性化粧品の開発だけでなく、様々 な環境汚染物質のリスク評価に不可欠です。齧歯動物モデルであるこの毒性試験用実験システム生体内で最も人気のあります。また、線虫などの非哺乳類生物も広く使われています。非哺乳類の毒性評価モデルは動物の倫理的な問題だけでなく、その利便性と経済性、保守性、速度、および再現性^{1,2 を考慮した有用性のため有益です。 ,3,4}。

線虫 c. エレガンス、土ワーム、ラウンドが様々 な基礎・応用生物学と化学の研究ではモデル動物として悪用されています。それは長さ 1 mm、透明の線虫の固体または液体線虫成長メディア (NGM)エシェリヒア属大腸菌OP50 細菌のひずみうんざりを単に維持されています。線虫が短いライフ サイクルと野生型の N2 の線虫は、約 300 の卵を産みます。そこで、実験材料^3,4,5として使用する簡単に伝達されます。また、線虫は、多くの薬物や環境汚染物質^6,7,8,9の毒性学的研究で広く使用されています。

多くの抗がん剤は、がん細胞が急速に分裂をターゲットとするため、急速に骨髄、消化管上皮、毛包細胞などの正常の細胞分裂にも被害が。たとえば、トポイソメラーゼ阻害抗がん剤ターゲット癌細胞の DNA 複製過程したがって、彼らはまた、急速に通常の細胞分裂を阻害します。すべての生きている有機体では、topoisomerases、これらトポイソメラーゼ阻害剤ほとんど影響環境生態系^6,10,11をご利用あり。したがって、モデル動物を用いた薬物毒性評価プラットフォームは、貴重な医薬品の開発に環境リスク評価です。

この記事で私たちは線虫モデルの有毒化学物質としてそのターゲット トポイソメラーゼ II、臨床抗悪性腫瘍剤であるエトポシドの毒性をテストする詳細なプロトコルを説明します。このため、体の大きさと線虫エトポシドで治療中に産んだ卵の合計数の測定法について述べる.

注: 全体の実験は 20 ° c 低発塵、ワーム、バクテリア処理時の汚染の最小化と維持きれいな分離研究室で行う必要があります。この目的のため、アルコール ランプやクリーン ベンチを使用しての炎の下で実験を行う必要があります

1 線虫 の卵化学テストに備えてメンテナンス

1. 維持 線虫 N2 (とブリストル) 20 ° C でうんざり NGM 寒天プレート ライブ エシェリヒア属大腸菌 OP50 ^{12。 , 13}.
2. 準備時代同期の卵のいずれかを使用して漂白ソリューション治療 ⁵ または時間卵産卵法 ^{6 , 14 , 15}
   。 注: 前に卵の準備、エトポシド含む NGM プレートの熱不活化下記のとおり エシェリヒア属大腸菌 OP50 コート。熱不活性 大腸菌 OP50 大腸菌 ^{6 , 16} の代謝活動を最小限に抑えるために使用します
。

2。熱不活性 大腸菌 の作製フィード OP50 C. elegans 毒性試験中に

1. は表 1 で説明したようにダブル酵母トリプトン (DYT) 媒体の 500 mL を準備し、上で培養した 大腸菌 OP50 単一コロニーを接種します。ルリア ベルターニカミラ (LB) 寒天プレート ⁵
。
2. インキュベート 14 h は、37 ° C、150 rpm の振動インキュベーターの エシェリヒア属大腸菌 OP50
。
3. 3,220 × g と 20 ° C で 30 分間遠心分離後すべて培養上清中の DYT 媒体を削除し、25 ml S バッファー、1 M MgSO ₄ の 250 μ L および 5 mg/mL コレステロール (エタノールに溶解) を 25 μ l 添加前の混合物を追加。すべてのこれらのソリューションは滅菌します
。
4. 細菌を再懸濁します、50 mL の使い捨て可能なプラスチック製のチューブにそれらを転送します
。
5. 、再懸濁に孵化させなさい熱不活化、65 で 30 分間水浴の エシェリヒア属大腸菌 OP50 ° C
6. クールな部屋の温度と使用するまで 4 ° c の店に。これまで 1 ヶ月保存できます
。

3。NGM プレートを含むいずれかの 1 %dmso や 750 μ M の準備エトポシド

1. 準備 2 きれいな 200 mL ガラス瓶。1 つのボトルに, 塩化ナトリウム 0.6 g、ペプトン、マグネチックスターラーと 195 mL の蒸留水、寒天、3.4 g の 0.5 g を追加します。他の空ボトルに磁性攪拌器を追加します
。
2. 121 ° C、55、30 分クールダウン水浴中にボトルで 15 分間オートクレーブこれら 2 つボトル ° C
3. 1 M CaCl ₂ の 0.2 mL、5 mg/mL コレステロールの 0.2 mL、1 M MgSO ₄、0.2 mL、1 M KPO ₄ (すべてのこれらのソリューションは、滅菌) 5 mL を追加し、55 でホット プレート上の磁気攪拌によるそれらをミックス ° C
4. は、混合 NGM 媒体を同じボリューム (100 mL) を 2 本に分割します。次に、1 つのボトルに 1 mL の DMSO を追加、再び磁気攪拌を使用してそれをミックスします。次のステップまでの 55 ° C の水浴中他のボトルを格納します。各 35 x 10 mm ² シャーレに DMSO 含有培地の分注 3 mL。このステップから約 33 DMSO 含有 NGM プレートを行うことができます
。
5. 磁気攪拌を使用して他のボトルをミックス、エトポシド 75 mM (ストック DMSO に溶解) の 1 つの mL を追加、もう一度、ミックス、分注の手順 (手順 3.4)。約 33 エトポシド (750 μ M)-この手順で NGM プレートを含む可能です
   。 注: 相関以前紙 ⁶、我々 はテスト 0、250、500、およびエトポシドの 1,000 μ M。そのデータに基づいて、我々 は本稿でエトポシド投与量の 750 μ M を選んだ
。
6. クール NGM プレートは化学を含む部屋の温度の下で約 3 時間、室温でそれらを残して、使用するまで 4 ° C で保存します
   。 注: 光に敏感な化学物質の場合光誘起分解を最小限に抑えるための光をブロックします
   。 メモ: 必要に応じて、アッセイは、以下のように 2 つの異なる化学治療条件を使用して実行することができますに産卵のため化学物質がなければ通常 NGM プレートをください
。
7. 追加 100 μ L の (セクション 2) として熱不活化 エシェリヒア属大腸菌 OP50、NGM の各板に普及します。化学試験の 20 ° C に c. の elegans のインキュベーターで一晩乾燥できるように

4。線虫 c. エレガンス の成長の測定

1. 750 μ M エトポシドまたは 1 %dmso を添加した NGM プレートに転送時代同期の 線虫 卵します
。
2. 4 日間の 20 ° c の定温器で加温 線虫。実体顕微鏡を用いたワームを観察し、顕微鏡画像を毎日取る。通常 20 倍の倍率 (1 X 対物レンズ、2 倍のズーム倍率 10 X 接眼レンズ レンズ) は c. の elegans の成長観察に適しています。またワームのサイズ校正用顕微鏡ステージ マイクロメータの顕微鏡像を取る
   。 注: 飢餓毒性試験に影響します。したがって、十分な細菌をフィード転送 線虫 を調整したり先頭で番号の卵します。飢餓の可能性を除外する 3 日まで観察します
。
3. DMSO や ImageJ ソフトウェアを使用して各時点でエトポシドで治療の c. の elegans の体長を測定します
   。 注: 各サンプル測定 50 ワームは統計分析のために十分な。
   1. ImageJ では、顕微鏡ステージ マイクロメータのイメージを開く (' ファイル ' → ' を開く ').
      メモ: マイクロメータのイメージとワーム イメージ (ステップ 4.2) は、同じ倍率である必要があります
   。
   2. を使用してマイクロメータ校正画像を 1,000 μ m のラインをドラッグ ' 直線 ' ツール
   。
   3. クリック ' 分析 ' → ' 縮尺の設定 ' 入力 1,000 μ m におよび、' 距離を知られている ' ボックスと ' 長さの単位 '] ボックスに、それぞれ。チェック ' グローバル ' クリック ' OK '.
   4. がワームの画像を開く (' ファイル ' → ' オープン ')。使用して、各ワームの特徴に沿って線を引く ' フリーハンド ' ツール。クリックして本体長さデータを取得 ' 分析 ' → ' メジャー '.
   5. 50 ワームのこの手順を繰り返します
   。

5。線虫 卵産卵アッセイ

1. 歳同期加温卵プレート含む DMSO または 64 h エトポシド (初産) の前に 20 の若い大人の段階まで ° c.
   注: それは成長測定実験からワームを使用するオプションです。成長の測定を行うし、卵産卵アッセイの一緒にすると便利です
。 無農薬 (条件 1、化学処置の若い大人の段階に卵からの時間の一定期間内)
2. 新しい NGM に転送 5 成虫プレートまたは同じ化学的前処理 (条件 2、連続投与を含む新しい NGM プレート全体的に実験期間を通して化学物質)、し、それらをインキュベートして 24 時間
   それぞれの治療のため 3-5 NGM プレートを使用してレプリケートする勧めします注意。統計分析のためこれらの複製を使用できます
。
3. は、前述のように、新しい NGM プレートに転送し、毎日卵の数をカウントします。逃げ出した、死亡した、内部的にハッチしていました、ワームをカウントします。編
4. ワームは、通常 5 日間で、ない卵を産むまでこれらの手順を繰り返します
。
5. 各板からワームあたりの産卵数を計算し、毎日卵の総数を決定する 5 日間のこれらの値を合計します
   。 注: 除外クロール ワームの数そして内部的に計算から孵化します
。

エトポシド (24-96 h) の治療は大幅線虫 c. エレガンスの成長を遅らせた。1.04 mm (図 1) に成長した車両処理ワーム培養 96 時間後エトポシド ワームは 0.86 mm 本体長さに増加。発育不良もどうやら、ステレオ顕微鏡観察 (図 2) の下で観察されました。72 時間で車両扱いワームからの卵を目にしました。その一方で、エトポシド療法の 96 時間後卵が観察されました。これらのデータから私達はc. の elegansの最初の出生時間をエトポシド治療に遅れると推測。

産卵の遅延に加えてエトポシド治療では、ワーム (図 3) 当りの産卵数が減少。若い成虫の有無 (図 3 b) 連続エトポシド治療の有無 (図 3 a) で培養した頃、生殖毒性、エトポシド処理による総卵数の減少が観察されました。両方の実験条件下でワームを制御処理間に有意差はありませんでした。一定期間の治療を (若い大人の段階に卵) からワームから卵の総数は、エトポシド投与ワームの著しく異なるでした。この比較のため一方向の分散分析 (ANOVA) 続いてテューキーの多重比較検定で統計解析を行った.

図 1: c. の elegansの成長の測定処理エトポシド。線虫 c. エレガンスの時代に同期した DMSO (車両制御、1%) を添加した NGM プレートに卵が育ったやエトポシド (750 μ M) 24-96 h. 顕微鏡写真 (図 2に示すように) は、毎日、撮影されたボディの長さを測定しました。ImageJ ソフトウェア。データは、平均 ± 標準偏差 (SD) として表現される (n = 50、1 グループあたり 50 ワーム)。p < 0.01、各時点での車両コントロールとエトポシド治療の間に大きな違い。学生のtを使用して統計分析を行った-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: c. の elegansのステレオ顕微鏡画像処理エトポシド。図 1に示すようにc. の elegansが扱われた (スケールバー = 1 mm)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: c. の elegansエトポシドで治療からレイアウトする卵の合計数。線虫 c. エレガンスの時代に同期した DMSO (1%、車両制御) を含む NGM プレート培養卵または 64 h のエトポシド (750 μ M)。次に、総産卵数は、(A) (B) の有無の 5 日間連続化学処理で観察されました。ワームは、通常 NGM プレート (A)、または同じ化学物質を添加した NGM 板に毎日を移された: 1 %dmso やエトポシド (750 μ M) (B)。産卵数はカウントされ、ワームあたり産卵数計算する毎日ワームの合計数で割った値します。ワーム当たりの卵数は 5 日間の加算されました。データは, 実験から平均 ± SD として表されます。p < 0.01、車両コントロールとエトポシドの治療の間に大きな違い。学生のtを使用して統計分析を行った-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1: 培養の成長媒体およびバッファーのレシピ。

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