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方法論記事

精細管スカッシュ マウス モデルを用いた精子の細胞学的解析法

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DOI:

10.3791/56453

⸱

2018年2月6日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この尿細管スカッシュ手法の目的は、急速に細胞の完全性を維持しながらマウス精母細胞の開発の細胞機能を評価するためです。このメソッドにより、精子形成のすべての段階の調査のため、マウスの減数分裂の研究のため他の生化学的な分子の生物学的アプローチと一緒に簡単に実装することができます。

要約

雄の減数分裂の進行は、規制の厳しい携帯電話イベント数の協調的な行動を必要とするプロセスです。減数分裂の間に発生したエラーは不妊、妊娠の損失または遺伝的欠陥につながることができます。思春期と成人期にわたって継続の発症時、精母細胞の連続準同期波まで精子を受ける、最終的に半数体精子を形成します。マウスの精母細胞の減数分裂の開始を受けての最初の波は産後 10 日目 (10 dpp) で表示され、35 dpp で成熟した精子と精細管の内腔に放出されます。したがって、関心の高濃縮の人口を得るためにこの発達の時間ウィンドウ内でマウスを利用するため有利です。珍しいセル段階の分析は、細管内細胞集団の多様性を高める連続の精波の貢献のための古いマウスのより困難です。ここで説明する方法は、マウス精原細胞、精母細胞、細胞などの精細管内で見つかった細胞の細胞学的評価のため簡単に実装されている手法です。尿細管スカッシュ技術分離の雄性生殖細胞の整合性を維持でき、他の手法とは表現しにくいセル構造の検討。この尿細管スカッシュ手法の応用可能性を示すためには、紡錘アセンブリは精母細胞転移中期に前期を進める (G2/MI 転移) で監視されました。さらに、染色体花束形成、減数分裂の性染色体の不活性化 (MSCI)、中心体の複製は、この尿細管スカッシュ メソッドを使用して観察することができます細胞構造の例として評価されました。突然変異または外因性の摂動によって引き起こされる精子の中に特定の欠陥を特定するこの手法を使用でき、精子形成の分子理解に貢献。

概要

減数分裂は、細胞分裂の 2 つの連続したラウンドを DNA 複製の 1 つのラウンドの後、複雑な携帯電話イベントです。正確な染色体分離を確保するための減数分裂の初期の段階で減数分裂固有のいくつかのイベントを調整しなければなりません。これらのイベントは、相同組み換え、姉妹の共同向きの完了を含んで第一減数分裂と同族体の chiasmata を解決するコヒーシン複合体の段階的な損失の間に体。これらのプロセスの精密な規則は、豊饒を維持するために、発達障害の遺伝的および自然流産1をもたらす染色体紡錘イベントを防ぐために必要です。

減数分裂のキー イベントが行われる男性と女性の両方で、重要な時間および作用機構の違い精子と卵形成2間存在します。たとえば、減数分裂女性、前期私は萌芽期の開発中に発生した、思春期まで dictyate 段階で逮捕。対照的に、精子形成は思春期で逮捕なしの大人の生活の中での波の進行開始します。男性と女性の減数分裂の違いが具体的に精母細胞や卵母細胞でこれらのプロセスを評価するに向かって仕出し料理方法を開発する必要性を強調しています。現在、主として減数分裂の進行を評価するクロマチン スプレッド3,4、5の使用に依存します。クロマチン スプレッドは減数分裂期の染色体を調べる場合に役立ちますが、彼らは紡錘体微小管、中心、核膜、テロメアの添付ファイルなどの細胞構造の評価を防止する、細胞の完全性を維持するために失敗します。ライブ イメージングと長期培養技術が大きく進歩した女性減数分裂; の私達の理解ただし、そのままセル全体を視覚化する同様のアプローチについては、精子6、7の研究のため実装頻度。男性減数分裂中の動的イベントを視覚化するために急速にマウス精母細胞8,9の開発の細胞の機能を評価するために確立された尿細管スカッシュ技術を適応しています。ここで説明する方法は、精子形成サイクルのさまざまな段階で複数の細胞構造の研究を有効にするセルの整合性を維持します。

この尿細管スカッシュ技術は、蛍光顕微鏡による細胞構造の評価を可能にするセル全体アプローチです。ヘマトキシリン ・ エオシン染色パラフィン埋め込まれた精巣の凍結切片の免疫蛍光ラベリングなど男性マウスの減数分裂の進行を視覚化する一般的な組織学的アプローチは、減数分裂の進行の広範な概要。ただし、これらのテクニックは、単一細胞を減数分裂10,11全体で発生するイベントの詳細な分析に必要な範囲に解決する失敗します。減数分裂のプロセスを視覚化するための代替技術は、特定し、核物質の3,4,5を解決する状態の中断を重要な chemiosmotic に依存します。これらの化学治療は、一次精母細胞以外の細胞型の観測を妨げます。最近説明滑川による分離精母細胞の核の構造を維持する研究コミュニティが有効になって、cytospin およびいくつかの研究所の4にすぐに利用できない場合があります付属品の使用が必要です。対照的に、尿細管スカッシュ テクニックだけはほとんどの細胞生物学研究所で一般的に標準的な装置が必要です。

圏内には精細管、セルトリ細胞、精原細胞、第一次および二次精母細胞など多様な細胞型を表示するは、ここで説明した尿細管スカッシュ メソッドを使用できます。若年マウス精子形成の近く同期の最初の波でこの手法を結合することにより減数分裂12を操作するときに、精子細胞の豊かな人口を得ることが可能です。このプロセスは、精子形成、初期前期イベントなどを通してプロセスの詳細な分析、G2/MI と後期遷移、および精子形成に中期に許可されます。さらに、尿細管スカッシュ準備は染色体 (interchromatid ドメイン (Icd) や体) と (由来と一分素材/行列) 中心の細胞像を可視化する使用できます。スカッシュ メソッドは、クロマチン スプレッドと蛋白質の抽出など、他の実験的アプローチと並行で容易に実行できます。さらに、この手法は、直接可視化13スライドに精子細胞を入金する正常に変更されています。

ここで説明したメソッドには、野生型 c57bl/6 j マウスにおける G2/MI 転移を分析するセル全体精細管スカッシュ テクニックが含まれます。第一減数分裂に入る一次精母細胞の細胞学的特徴は、減数分裂のスピンドルを観察する蛍光顕微鏡で視覚化しました。この汎用性の高い手法は、他の減数分裂の段階と異なる種類の細胞を可視化する簡単に変更できます。技術はまた、DNA と RNA の魚のアプローチなど、代替の可視化戦略に従うです。

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プロトコル

マウスの使用は、機関動物ケアとジョンズ ・ ホプキンス大学の使用・委員会によって承認されました。少年 (20-26 日産後、dpp) について実験を行った c57bl/6 j マウス、精子形成の準同期の最初の波の活用します。しかし、この手法も実行できますアダルト マウスを用いたします。

1. 解離とマウス精細管の分離

  1. 修正/溶解ソリューションと抗体希釈バッファー (ADB)の表 1と表 2に記載されているを準備します。
  2. リン酸緩衝生理食塩水 (1 x PBS、pH 7.4) x 1 の 3 ml 1 つ 35 mm シャーレとマウスあたり修正/溶解溶液 2 mL と別の 35 mm 皿を準備します。
  3. 頚部転位または CO2窒息を介してマウスを犠牲に、70% エタノールで腹側腹部をスプレーします。V 字形の開口部を作る生殖不能のはさみを使って腹部骨盤腔を開きます。精巣、鉗子による副睾丸脂肪パッドを取り外し、逃げずを妨害しません。1x PBS を含む 35 mm のペトリ皿に精巣を配置します。
    注:精子形成の最初の波を利用すると、金利14の富ませたセル人口を観察するために。精子形成サイクルの特定の段階は、年齢別のマウス (表 3) で濃縮されています。
  4. 鋭い先端の鉗子で組織を穿刺によって精巣逃げずを削除し、緩やかな精細管を収集します。細管を修正/溶解液 2 mL を含む新しい 35 mm のペトリ皿に転送します。
  5. 室温で 5 分間修正/溶解液尿細管を孵化させなさい。

2. 精細管の準備

  1. 液体ブロッカー ペンでスライドのエッジのアウトラインによるポリ-L-リジン コーティング ガラス スライドを準備します。
  2. スライド ガラスの中央に修正/溶解溶液 100 μ L を適用します。
  3. 滅菌の鉗子を用いたはさみはそっと離れて毛尾をいじめる。長い個々 の細管を切削セグメントの長さ約 20 mm。
    注:中心などの長期固定露出に敏感な構造を視覚化する、1 × PBS の細管をまず分離し、直接表面に細管をミンチにポリ リジン スライドは修正溶解溶液 100 μ L でコーティング。
  4. 5 つの 20 mm 長い精細管セグメントを含む修正/溶解液準備ポリ L リジン コーティング ガラス スライドに転送します。
  5. 1.5 から 3.0 mm のセグメントに滅菌はさみミンチ精細管を使用しています。
  6. 使用して滅菌鉗子がスライド ガラス上の尿細管のセグメントを配置組織が重なっていないと細管が均等に分散されます。
    注:スライド ガラス上の尿細管のセグメントの最適数は 20 と 40 の間です。

3. 退治精細

  1. ベンチトップに分散した精細管セグメントを含むガラス スライドを転送します。スカッシュ ステップ中に組織を失うことを避けるために研究室のワイプを使用して余分な液体を削除します。
  2. スライド ガラスの上に観察 (22 × 60 1.5 mm) を適用し、10-20 秒の手のひらのかかとで圧力を適用します。精細管から精母細胞を分散させるのに十分な力を適用することが重要です。
    注:尿細管のすべてのセグメントが中断されるので、退治の手順を最適化するために解剖顕微鏡を用いた尿細管を観察します。
  3. スライド鉗子を使用すると、すぐにフラッシュ凍結液 N2の小型のデュワーのガラス スライドを 15 秒間、または液体が泡を停止するまで。反応は、すぐにストレート エッジかみそりの刃で coverslip を削除する場合、は、先端の鉗子または 21 g 針を罰金します。
    注:最適な結果を得る、immunolabel スライドをすぐに (手順 4 を参照)。ただし、この時点でスライドできる-80 ° C で 2 週間。タンパク質と細胞構造の寿命を最大にするには、すぐにドライアイスまたは-80 ° C の冷凍庫に転送でスライドを格納し、スライドに、coverslip を保管します。反応は、スライドを保存する場合は、手順 3.3 で説明した、15 秒間液体 N2のスライドを浸すことによって、coverslip を削除します。

4. マウントした精細管の反応

  1. 1 × PBS と 3 回 1x PBS を含む 50 mL Coplin jar で 5 分間洗浄のスライドを浸します。
    注:スライドを許可しない反応の間に完全に乾燥。
  2. 1 mL の加湿チャンバー内で 1-2 時間のブロックをスライド ガラス上に抗体希釈バッファーを適用します。
  3. 抗体希釈バッファーを削除し、加湿チャンバー内抗体希釈バッファーで希釈した一次抗体 100 μ。
    注:最良の結果は、4 ° C で一晩一次抗体を孵化させなさい。Coverslip やパラフィルムでスライドを覆うことによって抗体 (例えば50 μ L) のより小さいボリュームを使用します。検証し、一次抗体15を最適化します。
  4. 1x PBS を含む 50 mL Coplin jar に 3 回 5 分用のスライドをすすぐ。
    注:洗浄を高めるためには、小さな電磁攪拌棒を使用して Coplin jar を扇動し低速で電磁攪拌プレート上に配置または卓上ミキサー低速での Coplin jar を配置します。
  5. 室温で加湿チャンバーで 1 から 1.5 時間抗体希釈バッファーで希釈した二次抗体の 100 μ L を適用します。写真は共役分子蛍光抗体の漂白を避けるために暗いボックスにスライドを孵化させなさい。
    注:Coverslip やパラフィルムでスライドを覆うことによって抗体 (例えば50 μ L) のより小さいボリュームを使用します。
  6. 1x PBS を含む 50 mL Coplin jar に 2 回 5 分用のスライドをすすぐ。
  7. メディアを含んでいる 4', 6-diamidino-2-phenylindole マウント (DAPI、1.5 μ g/mL) のスライドをマウントし、coverslips (22 × 60 1.5 mm) を適用します。
  8. スライドを保持し、coverslips の移動を防ぐ明確なマニキュアでスライドに coverslips をシールします。

5. 分析やイメージングの尿細管スカッシュ準備

  1. 正確な z 軸の動きと画像をキャプチャするための高解像度カメラにより自動ステージと落射蛍光顕微鏡を使用します。また、レーザー共焦点顕微鏡を使用します。
    注:このステップのすべての利用可能なハードウェアとソフトウェアを使用します。たとえば、図 1および図 2で表示される画像は、ツァイス セル オブザーバー Z1 シャチ フラッシュ 4.0 CMOS カメラにリンクし、ツァイス禅 2012 青版画像ソフトウェアで解析を使用して捕獲されました。
  2. スカッシュの準備の質を決定する 20 × 対物を使用してスライドを評価します。良質のスライドが等間隔に核の分子があります。
    注:スライドのいくつかのセクションは他の人より、さらなる高倍率を使用して分析のためのスライドの最高の領域を見つけることができますの座標をメモすると便利です。
  3. 高い倍率目的 (例: 63 X または 100 X)、核の一貫した単分子膜を持つスライドのキャプチャ領域を使用しています。地域を選択すると、上限を設定、確実にすべてのフォーカスの光をキャプチャ Z スタックを下ろします。
    注:Z スタックの上限と下限の制限の間に捕捉の最適数画像集録ソフトウェアが一般に指定し、は、それぞれの目的によって異なります。
  4. 画像処理ソフトウェアを使用して、奥行きを拡張焦点画像をコンパイルします。ソフトウェアは各 Z スタックからフォーカスの光を組み合わせた、尿細管スカッシュ製剤の最適な画像のために不可欠です。

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結果

ここでは、中期に前期を受けて一時的な細胞集団を視覚化する尿細管スカッシュ メソッドを使いましたが (G2/mi)、精子形成 (24 の最初の波を受けている少年の野生型マウスの精巣を収穫して濃縮した移行dpp)。図 1は、尿細管のスカッシュ メソッドを使用して視覚化することができますさまざまな細胞段階の代表的なイメージを示しています。中期の個体群を濃縮私精母細胞は α-チューブリン (図 1 a) に対する抗体を用いて可視化しました。初期と後期の減数分裂のマーカー利用段階減数分裂進行します。尿細管スカッシュ準備された前期 i. Leptotene/zygotene の段階を視覚化する SYCP3 減数分裂蛋白質への抗体とカルビンディン抗体と pachytene/diplotene 精母細胞は図 1 bに示します。精母細胞が第一減数分裂を受けては α-チューブリン抗体を使用して明確に識別することがで...

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ディスカッション

マウス精子形成時の減数分裂の進行を支配する細胞の活動を研究するための有用なモデル生物であると証明します。さらに、それはツールが終了するので、多くのイベントなど減数分裂前期から私の精子形成過程の研究に仕出し料理を開発する必要がある、性的に二形であります。このプロトコルでは、精細管スカッシュ法可視化とマウス精子形成サイクルのさまざまな段階の研究について説明します。このメソッドは、細胞の完全性を保持し、核と細胞質の構造の詳細な解析により。本研究で描かれている代表的な結果は、このプロトコルを一次精母細胞減数分裂の進行中の評価の有用性を示しています。また、このプロトコルは、精子形成、増殖、精原細胞の分化と精子形成27,28の段階を含む時他の細胞プロセスの研究にも使用できます。内で説明する方法は、前述した尿細管スカッシュ テクニック8,9時から合わせられます。しかし、このプロトコルはすべての試薬や蛍光顕微鏡による単一...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、日の出 (R01GM11755) に P.W.J.、S.R.W.、j. h. 訓練助成フェローシップ国立がん研究所 (NIH) (CA009110) からサポートされていた
 

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
16% パラホルムアルデヒド水性電子顕微鏡科学 (EMS)15710
10x PBS品質 生物学的119-069-161
トリトン X-100シグマT8787
BSAシグマA1470
馬血清シグマH-1270
35mm x 10mm ペトリ皿、滅菌、無処理CellTreatP886-229638
ポリ-L-リジンコーティングガラススライドSigmaP0425-72EA
リキッドブロッカー ペン電子顕微鏡科学 (EMS)71310
湿度ボックスエバーグリーン240-9020-Z10
ウィートン コプリン ガラス染色皿 5 枚または 10 枚のスライド用フィッシャー08-813E
VECTASHIELD 退色防止取り付けDAPIベクターラボH-1200
顕微鏡カバースライド(22mmx60mm)フィッシャー12-544-G
クリアネイルポリッシュアマゾンN / A
Microsopes
名前Companyカタログ番号Comments
SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000 
Observer Z1Zeiss4109431007994000
Zeiss ZEN 2012 ブルーエディション 画像ソフトZeiss
ORCA-Flash 4.0 CMOSカメラ浜松
Primary 抗体
strong>名会社名>カタログ番号<strong>コメント
マウス 抗SYCP3サンタクルーズsc-745691 in 50
ウサギ抗SYCP3フィッシャー (Novus)NB300-2311 in 1000
ヤギ anti-SCP3サンタクルスsc-208451 in 50
ヒト anti-Centromere ProteinAntibodies Incorporated15-2351 in 100
マウス抗アルファチューブリンSigmaT90261 in 1000
マウス抗AIM1BD Biosciences6110821 in 200
マウス抗ガンマ;H2AXThermo FisherMA1-20221 in 500
マウス anti-CENT3AbnovaH00001070-M011 in 200
ウサギ 反ペリセントリンAbcamab44481 in 200
ウサギ anti-REC8Courtesy of  Dr. Karen SchindlerN/A1 in 1000

参考文献

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