Method Article

アレイ ・ ベース比較 Genomic 交配用高速中性子誘起ウマゴヤシ分子変異体のコピー数変化の効率的な検出

DOI:

10.3791/56470

⸱

November 8th, 2017

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1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

In This Article

Summary

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このプロトコルは、コピー数変化の全ゲノム配列に基づく比較 genomic の交配 (CGH) 解析を行うに興味を持っている研究者の実験の手順と分析ツール、機器、試薬に関する情報を提供します。植物。

Abstract

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変異体は、遺伝子機能研究のための非常に貴重な遺伝資源です。突然変異体のコレクションを生成するため、T-DNA やトランスポゾンなどの生物、メタンスルホン酸エチル (EMS) などの化学物質や電離放射線などの物理など、変異原物質の 3 つのタイプを利用できます。突然変異の観察の種類使用変異原によって異なります。電離放射線誘発突然変異の突然変異には、削除、複製、または再配置が含まれます。T DNA やトランスポゾンを用いた突然変異誘発は変換に影響を受けやすい種に限られているが、化学的または物理的な突然変異は種の広い範囲に適用できます。しかし、伝統的に化学的または物理的な突然変異から派生した突然変異の特性は、マップベースの複製のアプローチ、集中的な時間のかかる労働をあるに依存します。ここでは、効率的に検出し、コピー数変化 (CNVs) 変異株由来の高速中性子照射 (FNB) 突然変異を特徴付ける高密度のゲノム配列に基づく比較 genomic の交配 (aCGH) プラットフォームを適用できることを示すウマゴヤシ分子、マメ科草種。全ゲノム シーケンス解析は、50,000 以上の遺伝子または遺伝子M. 分子モデルがあることを示しています。M. 分子の存在、FNB 誘発突然変異体でゲノムにおける遺伝子機能研究のための非常に貴重な遺伝資源を表す以上 150,000 の M1 線から派生されます。ここで説明した aCGH プラットフォームは、 M. 分子で FNB 誘発突然変異体を特徴付けるための効率的なツールです。

Introduction

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マメ科植物 (マメ科)、大豆 (ダイズ) やアルファルファ (アルファルファ) など多くの経済的に重要な種の顕花植物の 3 番目に大きい家族です。マメ科植物は根粒が大気中の窒素をアンモニア用にホスト植物によって減少を開発する根粒菌の総称で、土壌窒素固定細菌と対話できます。など、マメ科作物の栽培は窒素肥料の少しの入力を必要とし、持続可能な農業に貢献。葉と種子と高たんぱく、優秀な牧草と穀物マメ科作物を生成します。ただし、栽培されているマメ科草種は一般的にマメ科特有のプロセスが面倒で重要な役割を果たす遺伝子の機能解析を行う複雑なゲノム構造を持ちます。ウマゴヤシ分子採用されているマメ科植物の研究のためのモデル種として主な理由は (1) がある比較的小さい半数体ゲノムのサイズ (~ 550 Mbp); 二倍体ゲノム(遺伝子機能研究のため 2) 植物を安定して変換できます。(3) はアルファルファ (M. サティバ)、牧草、女王とトランスレーショナル研究の他の多くの経済的に重要な穀物に密接に関連。最近、ゲノム Jemalong A17 M. 分子cv のリリース1,2をされています。ゲノムの注釈は、50,000 以上の予測遺伝子やゲノムの遺伝子モデルがあることを示しています。M. 分子....

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Protocol

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注: 図 1 アレイ CGH のプロトコルの 5 つの手順を示しています。彼らは、: 1) 工場用資材の準備2) 高品質 DNA サンプルの分離3) ラベリングと DNA サンプルの精製4) ハイブリダイゼーション、洗浄、および全ゲノム配列のスキャン・ 5) CGH データ分析。M. 糸状菌 ゲノム タイリング アレイには、50,000 以上の遺伝子または遺伝子ゲノム (材料の表 を参照) モデルをターゲット 971,041 のユニークなオリゴ プローブの合計が含まれています。ユニークなプローブの間隔は約すべて 150 塩基対 (bp) exonic 地域で 261 m. 糸状菌 ゲノムのイントロン領域で bp

。

1 です植物材料の準備

  1. Scarify 野生型 (WT;。M. 分子 cv Jemalong A17) と 8 分の濃硫酸と FN6191 突然変異種 (材料の表 を参照してください)。削除し、液体廃棄物容器に硫酸を破棄します
    2. 。
  2. リンスの脱イオン水をオートクレーブで種 3 回
    3. 。
  3. 表面消毒種子で 10 分間 20% の漂白剤の解決策
  4. リンスの脱イオン水をオートクレーブで種 3 回
    5. 。
  5. 3....

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Results

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図 2は、全ゲノムを渡る WT 信号対変異体の正規化 log2比の分布を示しています。CGH のデータの分析はおおよそ明らかになった全体サンヘンプ遺伝子33と他のいくつかを含む, 染色体 4 22 kb 削除注釈遺伝子の FN6191 変異体 (図 2、図 3)。候補削除された領域は、-2.5 (補足表 1) 未満の平均正規化 log2比アレイ上 73 の連続したプローブで覆われていた。削除のボーダーの検査は、この突然変異体における推定の削除は座標 22,313,168 と 22,334,934 染色体 4 (図 3) の間に位置するプローブが並ぶことを提案しました。削除の境界線を確認、PCR .......

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Discussion

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アレイ ・ ベース CGH プラットフォームの検出と高速中性子照射 (FNB) の特性を開発した- M. 分子品種 Jemalong A17 の突然変異体の誘発。アレイ CGH 法遺伝子変異の検出の使用を示すためには、aCGH S. 法 Sm1021を接種したときに野生型植物と対照をなしてハイパー根粒形成表現型を表わした FN6191 変異体の解析を行った。セグメント化の分析のため、セグメントはセグメント内プローブは上限しきい値上またはその指定された配列比較の下限しきい値以下ログ2の比率を意味するのなら重要なと判断されました。各比較のしきい値の上限は、すべてのデータ ポイントの 95 パーセンタイル値のログ2比値であることに決定されました。各比較の下限は、すべてデータ ポイント24の 5 パーセンタイルのログ2比値であることに決定されました。

我々 の分析を示した 2.5 平均正規化 log2比率は平均より大きい.......

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Disclosures

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著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

Acknowledgements

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この作品が資金を提供一部助成金 NSF 植物ゲノム研究 (IOS 1127155) から。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Medicago truncatulaゲノムアレイ、1 x 1 MAgilentG4123A
Medicago truncatula FN6191 (変異体)自社内FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (参考)社内A17
硫酸Sigma-Aldrich320501
DNeasy PlantミニキットQiagen69104
ナノドロップ分光光度計Thermo Scientific1000D
SureTag DNA ラベリングキットAgilent5190-3400
ランダムプライマーAgilent5190-3399
アセトニトリルSigma-Aldrich271004-1L
サーモサイクラーMJ 研究PTC-200
遠心分離機Labnet international IncSpectrafuge 24D
Stabilization and Drying SolutionAgilent5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization KitAgilent5188-5380
Hybridization Chamber gasket slidesAgilentG2505
Human Cot-1 DNAAgilent5190-3393
オリゴ aCGH/ChIP-on-chip 洗浄バッファー 1 および 2Agilent5188-5221
ハイブリダイゼーションチャンバー、ステンレスAgilentG2534A
ハイブリダイゼーションオーブンAgilentG2545A
精製カラムAgilent5190-3391
レーザースキャナーRocheMS200
NimbleScan 2.6RocheNimblegen5225035001
Signal Map 1.9Roche NimblegenSignalMap1.9

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312(2014).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. ....

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Comparative Genomic HybridizationCopy Number VariationsFast Neutron BombardmentMedicago truncatulaArray based CGHDNA IsolationMicroarray HybridizationWashing BufferSpectrophotometer AnalysisSignal Mapping Software

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