方法論記事

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

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DOI：

10.3791/56487

⸱

2017年10月18日

 ,  , 
1Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

この記事について

サマリー

微生物の相互作用を研究する多彩なホスト モデルとして線虫線虫を紹介します。

要約

モデルのホストとして線虫を使用して微生物の相互作用を研究する手法を示す.微生物は、腸疾患の主な場所を作る食事を介して紹介しています。線虫の腸管構造的、機能的哺乳類の腸を模倣し、透明な植民地化の微視的研究に従うことです。病原体が病気や死を引き起こす可能性ことを示します。我々 は変更された病原性を示す微生物の突然変異を識別することができます。生物的ストレスに保存された生得的な応答は、宿主自然免疫の面を調査する優秀なシステムを線虫になります。デュアル酸化酵素遺伝子の変異を持つホスト反応酸素種を作り出すことができないし、微生物の侮辱に抵抗することができないことを示す.さらにそれが微生物の増殖阻害剤の効果を研究する使用することができますを示すにより提示された生存分析の汎用性を示します。この試金を使用して、さらに宿主微生物間相互作用を明らかにする機会を提供すると同様、新規抗真菌薬の開発のためのターゲットとして真菌病原因子を発見するも可能性があります。この試金のデザインによく適して高スループット全ゲノム スクリーン、将来使用するための低温保持するワームに能力になりますが勉強するコスト効果の高い魅力的な全体の動物モデル。

概要

線虫は、50 年以上の強力なモデル有機体として使用されています。1960 年代、南アフリカ共和国の生物学者、シドニー ・ ブレナーは、線虫の細胞および動物の生物学の様々 な面を調査する科学者たちの長い系統の道を舗装神経の開発、研究にc. の elegansの使用を開拓しました。この系譜は、ノーベル賞受賞者クレイグ ・ メローとの RNAi の仕事1のアンドリュー ・ ファイアー、ロバート ・ ホロビッツ、ジョン ・ サルストン器官形成およびアポトーシス2,3,4、自分の仕事のため、マーティン ・ チャルフィー緑色蛍光タンパク質5彼の仕事。研究者が緑膿菌を含む様々 な人間の病原体の生物学を調査するためにc. の elegansを使用し始めているこのモデル有機体は、伝統的に過去の 15 年にわたって分子発生学を研究に使用されていますが緑膿菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、セラチア6,7,8,9,10。これらの研究は人間-病原体相互作用に関与するメカニズムの多くが保存されます明らかに線虫がまたこのモデル生物11,12に固有いくつかの免疫機構があります。自然の中でc. の elegansさまざまな土で現在の摂取された病原体からの脅威、これが進化し、腸管内の洗練された自然免疫系を維持する強力な選択圧を提供しています。遺伝子や腸管の保護に関与するメカニズムの多くが高い哺乳類11,13にも存在する非常に節約される要素によって調整されます。線虫は、したがって14サルモネラ、赤痢菌 boydii15、またはコレラ16のような消化管病原体を研究する素晴らしいモデルを表します。

ここで我々 は線虫のc. アルビカンスなど感染性病原体を研究するモデルのホストとしての驚くべき多様性を強調表示します。線虫モデルのホストとしては安価でカンジダ症42の研究に用いられるマウスのモデルよりも時間のかかる病原性の高スループット スクリーニングが可能です。

本研究では、このモデルと厚板の生存分析確実に使えるホスト生得免疫エフェクター ドライブの病原性病原体の決定要因、感染症に対抗する重要な留学を紹介し、薬理学的化合物のことができます。病因に介入します。前述の試金に異なる、このメソッドは、成人だけではなく、成人期、幼虫期から死43,44動物の生涯にわたって病原体への暴露を勉強するための手段を提供します。要約すると、我々 はc. の elegans - C. albicansモデルは、ドライブの感染・免疫遺伝的基盤を研究するだけでなく、治療的介入のための新しい化合物を識別するためにも使用できる汎用性と強力なツールです。

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プロトコル

1。 線虫成長媒体の準備 (NGM)

  1. 1 L メディアのため寒天 20 g、2.5 g 有機窒素源 (例えば、バクト ペプトン)、および 2 L フラスコの塩化ナトリウム 3 g を組み合わせます。975 mL の滅菌水を追加します。
      滅菌攪拌棒で
    1. 追加。15 分の自動メディアの注ぎ口、オートクレーブ チューブとメディアを使用している場合メディアする必要がありますのオートクレーブもはや高いボリュームを作った場合
      2. 。
  2. 撹拌プレートでメディアを設定し、冷却すること。
    1. メディアが無菌 (約 60 ° C) を触ると暖かく追加 1 M MgSO 4 の 1 mL ● H 2 O、1 M CaCl 2 の 1 mL、KPO 4、25 mL、1 mL のエタノールで 0.5% コレステロール
      2. 。
    2. メディア (手動で、または自動ポンプ) 流の下に入れて 35 × 10 mm 滅菌シャーレ。使用する前に 1-2 日のフードの下で乾かします
      。 注: プレートは汚染防止のための 4 ° C で保存する必要があります
      3. 。

2。ワームのピックアップを作る

  1. アルミ線の 1.5 cm 部分をカットします。パスツール ピペットの先端に約 0.5 cm の長さを慎重に挿入します。
    1. 炎のピペットにピペット チップの元の形状を損なうことがなくワイヤを安全に付着するまでゆっくりと回転してガラス ピペット チップを溶かすブンゼン バーナー、アルコール ランプを使用しています
      2. 。

3。大腸菌 培養の準備

  1. 滅菌ループを使用して、大腸菌 OP50 ルリア スープ 200 mL に 単一コロニーを接種します。37 で揺れで一晩インキュベート ° C
  2. 液体培養は使用次の日の準備ができて、使用しないときは 4 ° C で保存されるかもしれない
    。 注: OP50、エシェリヒア属大腸菌 株の食物源として使用されて 線虫。この文化に使用するかもしれないいくつかの 4 に格納されているときに数ヶ月まで ° c.

4。本質的な c. の elegans メンテナンス

  1. プレートの中央に準備された OP50 液体培養の約 50-100 μ L をスポッティングにより NGM 寒天で 大腸菌 を作製した種子
    2. 。
  2. カバー プレート、および 24 時間室温で乾燥させます。一度乾燥し、急速な成長のために夜通しの 37 ° C でプレートを配置またはより遅い成長が必要な場合、室温で維持します
    3. 。
  3. プレートにワームを追加いずれか "、" (プロトコル手順 5 を参照してください " Chunking やピッキング ワーム ")、ワームを個別に選択または直接プレート ワームの卵を配置すること (プロトコル手順 6 を参照してください " 卵準備 ").

5。Chunking やピッキング ワーム

注: "、" c. の elegans の保守に共通する方法を示します。これは、ワームを含む NGM 寒天プレート部を切り、新しい板にこの作品を転送するもプロセスのワームの大規模な数を転送するために含まれます。汚染は、この方法でプレートから切り出されることがあります。ワームを選ぶときは、寒天の穴にワームを失われることが寒天の整合性を維持するために重要です。さらに、寒天を溶解またはワームを燃焼を防ぐためにプレートに触れる前に冷却するための選択をできるようにすることが重要だ

。
    新しいプレートの上にワームの大量を迅速に転送するために
  1. は、へらを使用して選択したワームを含む NGM 寒天の部分をカットしました。カットの部分を削除し、新しいプレートの OP50 の芝生の端に顔ダウン配置します
    2. 。
  2. 転送プロトコル手順 8.2 で下記のとおり個別にワーム " 生存分析、" ワームを使用してを選択します。それが赤になるまで炎ワームでワイヤーを選択します。炎から外し、数秒間冷却します
    3. 。
  3. ピックにワイヤーをカバー、新しいプレート上に成長した OP50 文化の芝生をこすり、ピックにワイヤを使用して優しく
    4. 。
  4. ワイヤの先端を覆う粘性の文化により、ワームの選択のヒントに固執する、こうして優しく強打する運動を使用して選択したワームをピックアップします
    5. 。
  5. 選択したワームが収集され、一度は優しく文化を寒天にスワイプによって新しいプレート上に配置します。ピックに残り文化を削除する炎にワイヤを配置します
    6. 。

6。卵の準備

  1. ピッキングまたはチャンキング プロトコル手順 5 で説明したように約 20 大人動物 (約 20 ° C で育てられたとき、孵化後 2-3 日) に配置 " Chunking とピッキングのワーム、" 50 シード プレートOP50 大腸菌株の μ L.
    2. 卵を収集し、10 mL の M9 バッファーとプレートの洪水の 1-2 日後に
  2. 。ガラス血清ピペットを使用すると、旋回し、振とう OP50 または大人動物にこだわった卵を解放する寒天プレート上のコンテンツ。成虫と卵を含むすべての液体を収集します
    3. 。
  3. 15 mL の円錐形に転送 M9 と OP50 ソリューション チューブ。遠心分離機の 2,100 x g で 2 分間で 15 mL の円錐管
  4. OP50 ペレットを乱すことがなく上澄みの約 9 mL を吸引します
    5. 。
  5. 2 mL の滅菌水、漂白剤 1 mL と 0.25 M NaOH の 1 mL にペレットを再懸濁します
    6. 。 通常、卵はそのまま残りますこの短い漂白剤治療中に、シェルのため
  6. はインバージョンによるを穏やかに混合し、大人動物の大半 (およそ 70%) が分離表示されるまでです。遠心分離機の 990 x g で 2 分間で円錐管
  7. ペレットを乱すことがなく吸引清。M9 バッファーの 10 mL にペレットを再停止します
    8. 。
  8. は、不穏なペレットなし 2 分吸引上澄みの 990 x g で円錐形の管を遠心分離機します。M9 バッファーの 200 μ L でペレットを再停止します
    。 注: 卵の準備は、複数の試験を必要があります。彼らは長すぎるため漂白剤にさらされている場合、卵を破壊可能性があります。卵は孵化しない場合、漂白剤溶液中の濃度を減少または漂白剤への露出の期間が減少します
    9. 。

7。感染症板セットアップ

  1. YPD 滅菌試験管に 3 ~ 5 mL を省略し、カンジダ ・ アルビカンス 滅菌ループを使用して単一コロニーで接種します。
    1. 30 で約 16-18 時間回転ドラムにチューブを配置 ° C
  2. ラベル 1 つ 1.5 mL および microfuge チューブ c. アルビカンス、および別の OP50 を含むを格納します。それぞれの空の管の重量を記録。
    1. 一晩チューブに C. albicans 文化の場所 500 μ L 標識 C. albicans と一晩 OP50 文化 (ステップ 3.1) からの 1,500 μ L OP50 というラベルの付いたチューブにします
      2. 。
    2. G. 吸引清不穏なペレットなし x 16,100 で 10 分間遠心します
      3. 。
    3. は再 500 μ L の滅菌水でペレットを中断します。16,100 x g. で 5 分間遠心
    4. ペレットを乱すことがなく吸引清。Microfuge の管の最終的な重量を記録します
      5. 。
    5. 最終的な重量から microfuge の管の初期の重量を差し引くことによって各ペレットの重量を決定します
      6. 。
  3. 10 mg/ml、C. albicans ペレットと 200 mg/ml OP50 ペレット再中断 滅菌水を使用しています。ストレプトマイシンの 50 mg/mL の溶液を 10 μ l 添加、OP50 文化の 2.5 μ L、c. アルビカンス 文化の 0.5 μ L 7 μ L の滅菌水を組み合わせることによりミックス マスター感染を作る。
    1. 制御板、C. albicans 文化のボリュームを滅菌水に置き換えることによりマスター ミックスを作成します。感染症のミックスやマイクロ ピペットを使用して NGM センター プレートに OP50 制御ソリューションの 20 μ L をシードします
      。 注: 分析中に統計的有意性を決定する約 100 のワームが必要です。この試金は 3 通で通常実行されます。したがって、感染ミックス x 3.2 と同様、制御ソリューション x 3.2 が行われます。これらのミックスは、完全 20 μ L のシードは、各プレート、エラーのための部屋を許可することを確保するため元 × 3 強に作られています。C. アルビカンス を消費する (L1 L3) 初期幼虫段階でワームの咽頭が小さすぎるために、このマスター ミックスが作成されます。フルコナゾール ( 図 3 b) などの薬剤への暴露, エージェントは感染症混合物に導入します。剤の濃度を経験的に決まります。たとえば、 図 3 b、50 μ M のフルコナゾールを表され、0、12.5、25、50、100 μ M フルコナゾールもいたが同じプロトコルを使用してテストします
      2. 。

8。肛門領域の変形 (Dar) 表現型と生存の試金の分析

  1. 視覚化 Dar 表現型
    注: L3 期とそれ以降に最適ダルな可視化します。Dar は、時間の経過とともに顕著となる ( 図 2 a)、ワームのポスト肛門領域に小さな突起として提示します。
    1. 動物解剖顕微鏡のステージ上プレートをすばやくタップして Dar; Dar と動物がどちらかの必要になりますすぐに後方移動 Dar はなく動物を持っている場合確認繰り返し逆方向、または彼らにタップのラウンド全然しません
      2. 。
  2. 生存分析
    1. プロトコル手順 6 で前述したように完全な卵の準備 " 卵の準備 "。郭清範囲の下で卵をカウントし、μ L あたり約 5-6 健康的な卵の濃度を達成するまでに M9 と卵ソリューションを希釈します。20 μ L の試料を細菌の培養とプレートの側面間の領域の準備の NGM プレート約 30 卵を分配、ピペットを使用して (卵とワームは、食品、OP50、2 つの個別の点では) です
      2. 。
    2. 48 h の 20 ° C に加温プレート。解剖顕微鏡の下で、各プレート上のライブと死んでいる大人のワームの数だけでなく、ダルでワームの数をカウントします。Dar と % を記録します
      3. 。
    3. アルミ線またはプレートで軽くたたくことによって頭を叩かれてに応答しない場合に死んだ動物を考慮します
      4. 。
    4. 毎日、転送残り成虫ピッキングによってプロトコル手順 5 で説明したよう " Chunking とピッキングのワーム、" 新しい感染症やコントロール プレートに。この時点で、必要な場合は毎日ライブ、死者および行方不明の虫の数を追跡することによって生存分析を実行します
      。 注: このアッセイを卵の準備を始めて 2 週間、実行可能性があります。さらに、卵ソリューション ソリューションは、OP50 を殺すことができる漂白剤の痕跡を含む場合がありますので、細菌培養には調剤していないします。ソリューション必要があります卵寒天プレートの側面の間に挟まったように、プレートの端から約 0.5 cm を調剤します。さらに、ワームの急速な普及、により転送新しいプレートの上に大人は彼らの子孫とは異なる重要な
      5. 。
  3. 分析生存
    1. 生存曲線の解析ソフトウェアを用いた結果の分析 (資料の一覧を参照してください).
    2. 比較生存曲線 Grehan ・ ブレスロウ Wilcoxon メソッドを使用して (初期の生存期間からデータが後の時代よりも正確、重量データに応じて) だけでなく、各統計ツール 45
      。 注: たとえば、 図 4 b に -C、同質遺伝子野生型コントロールや complementarystrains で治療にワーム変異体 C. albicans で治療の生存率を比較します
      3. 。

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結果

C. アルビカンスと線虫を使用して病因分析 (図 1) は、私たちラボ17,18して他ラボ19,20以前記載されています。線虫を使用してC. albicans細胞ワームがすぐに摂取が遅い歩行を引き起こす腸の内腔に蓄積されることを示すc. アルビカンスの病原性を研究するを示す変形アナル地域 (Dar) (図 2 a) は、(図 2 b) 外陰部の腫れ、膨満腸 (図 3 a) の致死率 (

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ディスカッション

別の病原体をテストするためについてはC. albicansに一生さらされる線虫感染症や生存を試金する方法を変更できます。別の細菌または菌の液体培養したし、同様の方法でc. の elegansを供給します。シリアルの感染可能性がありますさらに、試金する前述のように、まず 1 つの病原体に幼虫を公開し、成人期に達した後別の病原体を含む新しいプレート上に動物を移すことによって。

このアッセイを行いながらタイミングに細心の注意を払うことが重要です。まず、試金のための卵を収穫するために卵の準備を完了したときは、卵が漂白剤にさらされている時間の量を制限する重要です。卵を解放する漂白剤溶液で大人を溶解するために必要な時間が異なります。漂白剤溶液を管理するには、直後には、worm ソリューションを解剖顕微鏡の下で注意深く監視されなければなりません。ワームの約 70% が崩壊した後、ソリューションは遠心分離にする必要があります。卵の準備に実行可能な卵が得られない場合は、漂白剤の濃度または漂白剤への暴露の期間を減らします。この試金を完了するために重...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は公演され、ウースター工科大学でサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
寒天(粒状、細菌学グレード)Apex BioResearch Products20-248
アルミニウムワイヤー(95% Pt、32ゲージ)Genesee Scientific59-1M32P
Axiovision Zeiss 倒立顕微鏡Axiovision Zeiss
Bacto-PeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
C. elegans strain Bli-3CaenorhabditisGenetics CenterBli-3(e767) CB767
塩化カルシウムフィッシャーサイエンティフィックBP51-250
コレステロール シグマグレード 99%以上シグマC8667-25G
ディスポーザブル培養チューブ (20 x 150 mm)ブランド14-961-33
解剖顕微鏡 (NI-150 高輝度イルミネーター)ニコンインスツルメント株式会社
大腸菌Caenorhabditis Genetics CenterOP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)GraphPad Software
LB Broth (Miller's)Apex BioResearch Products11-120
Magnesium SulfateFisher Scientific10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)Falcon
リン酸カリウム 一塩基性SigmaP0662-500G
塩化ナトリウムフィッシャー・サイエンティフィBP358-1
リン酸ナトリウムフィッシャー・サイエンティフィBP332-500
野生型 C. アルビカンス SC5314ATCCSC5314
野生型 C. elegansCaenorhabditis 遺伝学センターN2
353001ック ック

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