ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部のシナプス電流の焦点 Macropatch 録音

サマリー

ショウジョウバエ第 3 齢幼虫神経筋接合部シナプス ボタンの可視化から塊状性シナプス電流を記録できます。この手法は、単一のシナプスブートンのアクティビティを監視できます。

要約

ショウジョウバエ神経筋接合部 (NMJ) はグルタミン酸作動性シナプス伝達を研究するエクセレント モデル システムです。ショウジョウバエ幼虫 NMJ で可視化研究からシナプス電流の焦点の macropatch 録音の手法について述べる。この方法で高倍率、長距離水浸対物レンズ、差動干渉の対照 (DIC) の光学、蛍光顕微鏡と同様に、マイクロ ピペット、記録のカスタマイズ加工を必要添付ファイル。記録電極は選択したシナプスブートン DIC 光学、エピ蛍光、あるいは両方に可視化の上に配置されます。この方法の利点は、リリースのサイトの限られた数のシナプスの活動を監視できます。記録電極は直径数ミクロン、および電極縁外に配置されるリリース サイト記録電流に大きな影響はないです。記録された性シナプス電流高速キネティックがあるし、容易に解決することができます。これらの利点、または非同期の自発的なシナプス活性の増強と突然変異のはえ系統の研究のため特に重要です。

概要

ショウジョウバエは、シナプス伝達を制御する分子機構を研究するエクセレント モデル システムです。ショウジョウバエの神経筋システムは、グルタミン酸とグルタミン酸作動性のリリースの保存の機能を勉強したがってショウジョウバエの神経筋接合部 (NMJ) を使用できます。以来 1 月および 1 月の研究¹、3 齢幼虫は興奮性接合電位 (EJPs) または (EJCs) の流れを監視することによって誘発と自発的なシナプス伝達を研究に広く使用されています。EJPs はよく鋭いガラス微小電極を細胞内に記録され、彼らは特定の筋線維のシナプスを作るすべてのボタンを含む全体の NMJ の活動を反映しています。

対照的に、神経やシナプス下肢近くマイクロ ピペット チップを配置することで先んじて、リリースのサイトの限られた数のアクティビティを記録できます。この手法がカッツと Miledi²、採用された当初と焦点細胞外記録が正常にカエル^3,4、5マウス⁶を含むいくつかの NMJ 製剤で採用されています。^,

プロトコル

1 記録電極の作製

電極引き手の

ガラス電極を引いて
1. 次を使用
2. プロトコル (材料の表 を参照してください):
   1. ライン 1: 熱。510 プル - 速度 30 時間 250;2 行目: 熱 490 プル - 速度 30 250 時間します
      。 注: 時間の単位は 1 単位当たり 0.5 ms に対応します。他のユニットは相対的です。ランプのテストが実行された後、すべてのフィラメントの熱の値を調整する必要があります
   。
3. に確実に ( 図 1 a) 7-10 μ m の範囲で引っ張られた電極内径顕微鏡 (35 倍) を使用します。塵の蓄積を防ぐために密閉容器に毛細血管を格納します
。
1. 火研磨
   1. 火ポーランド毛細血管 (1 〜 2 秒の最大熱値の 80-90%) マイクロ フォージを使用して (材料の表 を参照してください)。洗練された電極の最終の内径が 5 μ m ( 図 1 a) ²⁷ を確認します
   。
2. 曲げ

結果

焦点距離 macropatch の録音は、選択したシナプス ボタン (図 5) からシナプス アクティビティの監視を有効にします。シナプスブートン (図 5 a, サイト 1) の上に電極を配置すると、記録された mEJCs (図 5サイト 1) は騒音レベルを大幅に上回る振幅があるし、上昇の段階 (サブ ミリ秒の範囲) でシャープします。とき記録電極に移動されます、シナプスブートンから数ミクロン (図 5 aサイト 2)、記録された mEJCs 減少の振幅によってほぼノイズ レベル (図 5 bサイト 2)。記録された EJCs はノイズとほとんど区別できるし、彼らは上昇の段階 (図 5サイト 1 とサイト 2) 長.......

ディスカッション

ショウジョウバエでは、シナプス伝達の研究に有利なモデル生物を表します。いくつかの録画設定は、シナプス電位、2 つの電極電圧クランプ^33,34, 焦点の macropatch とシナプス電流の録音の細胞内の録音を含む、幼虫 NMJ で使用されています。ここで説明したシナプス電流の録音。後者の手法では、可視化研究でシナプス伝達の正確な定量をことができます。

記述されていたプロトコルの成功は批判的に関心のある分野を明確に視覚化し、電極の作製をカスタマイズする能力に依存します。したがって、品質 DIC の光学系、長い作動距離、火災研磨と電極の曲げのためのカスタマイズされた装置と高倍率の水浸対物レンズ、非常に重要です。

このアプローチの利点は、記録電極の下には、いくつかのシナプスの活動を監視できます。注意してください、ただし、電極の縁の近くに位置する研究は、記録された活動へも一因かもしれません。そのため.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
サッター P-97	サッター装置	P-97	マイクロ電極プーラー
成重 MF-830	成重	MF-830	マイクロフォージ
WPI MF200	WPI	MF200	マイクロフォージ
ガラスキャピラリー	WPI	B150-86-10	ガラスキャピラリー
マイクロトーチ 1WG61	グレイナー	1WG61	マイクロトーチ
シルガード184 シリコーンエラストマーキット	ダウ コーニング	SYLGARD 184	解剖用プレート準備用シリコーン
解剖用ピン	アマゾン	B00J5PMPJA	幼虫の位置決め用ピン
ピン	WPIINC	500342	ピンを配置し、腸や気管を取り外すためのピンセット。
はさみ	WPIINC	501778	幼虫や神経のクチクラを切るためのはさみ。
オリンパスBX61WI	オリンパス	BX61WI	正立顕微鏡
オリンパス Lumplan FL N 60x	オリンパス	UPLFLN 60X	顕微鏡対物レンズ 60X
オリンパス UPlan FL N 10x	オリンパス	Uplanfl N 10X	顕微鏡対物レンズ 10X
成重マイクロマニピュレーター	成重	MHW-3	3軸水油圧マイクロマニピュレーター
npi Electronic GmbHELC-03XS	npi Electronic GmbH	ELC-03XS	電気生理学的増幅器
A.M.P.I Master 8	A.M.P.I.	マスター8	刺激装置
A.M.P.I Iso-Flex	A.M.P.I.	Iso-Flex	Stimulus アイソレータ
TMC 防振テーブル	TMC	63-9090	防振テーブル
TMC ファラデーケージ	TMC	81-333-90	ファラデーケージ
Digidata 1322A	Axon Instruments	Digidata 1322A	Digidata
Computer	Dell	Dimension 5150	Win XP OS
電極ホルダー	WPI	MEH3SW	電極ホルダー
光学フィルター	オメガ光学	XF 115-2	緑色蛍光タンパク質(GFP)検出用フィルターキューブ
pCLAMP 8	Axon Instruments	8.0.0.81	信号記録用ソフトウェア
Quantan	社内ソフトウェア	-	信号処理用ソフトウェア
Canton-S (Wildtype)	Bloomington Stock Center	64349	コントロールフライライン
cpx SH1	J.T. Littleton-Complexinの寛大な贈り物		アウトフライライン 自然発生的なエキソサイトーシスの増加
CD8-GFP	ブルーミントンストックセンター	5137	ニューロン蛍光(GFP)タグ付きフライライン

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