神経変性のショウジョウバエモデル アダルト登山行動を分析するための自動化された迅速な反復負走アッセイ

さまざまなプロトコルおよび方法は、ショウジョウバエ成人登山行動を分析するために開発されています。かなり骨の折れる、伝統的な分析はほとんど 1 つのフライを入れている個々 のバイアルが含まれます、同期^1,2,3,4のハエを叩く手動力を使用します。退屈な時間のかかる、高スループットの大規模研究には不向きで、ハエだけでなく、その他の制限をタップするために使用マニュアルの力の潜在的な変化です。アッセイを改善するために同じ時間⁵時多数のハエを高スループット分析が可能迅速な反復負走 (リング) アッセイを開発されました。ただし、アッセイはまだ飛ぶアクションを同期に手動で発揮力が必要です。改訂前の測定の時にリングの試金の私達のバージョンには、自動的に飛ぶ同期⁶を駆動する電気モーターによって制御される複数のフライを含むバイアルをホスティング金属ベースが含まれています。録音時に同期が、記録された後すぐにクライミング場を用いて自己設計されていたソフトウェア。私たちの自動化されたリングの試金、1 つずつ、1 つのフライからのデータ収集に手間と労力のかかるプロセスを排除しより効率的なデータ取得プロセス。さらに、自動リング アッセイは、機構の基になるアルツハイマーを明らかにする研究、パーキンソン病、高効率^{7,8,9 でのアプローチを検証の数で採用されています。}.

この記事では、RNAi ハエを駆動DDC Gal4を使用して自動化されたリングのアッセイを示しています。DDC Gal4はドーパミン作動性 (DA) とセロトニン神経細胞で具体的に表現する Gal4 ライン¹⁰神経変性を伴う運動障害に関連付けられているターゲット遺伝子の効果を分析するための素晴らしいツールをこうして表します。さらに、我々 はUA Dicer2UAS-Dicer2;を生成するための RNAi の効率を高めるフライラインを組み込むDDC Gal4ライン ツールします。私たちを使用する選択 RNAi ハエはオーキシリン(aux) RNAi v16182 (auxR¹⁶¹⁸²)、我々 は以前の効果を展示する識別した遺伝子飛ぶ運動⁸。auxGFPハエもaux過剰発現に及ぼす影響を分析するため用意しています。自動リング試金を使用してフライ負走を測定、結果を提示し、結果から取得で何か影響を議論する方法を紹介します。

1 飛ぶコレクション

1. 25 ° C、湿度 70%、12/12 h 明暗サイクルで標準的なはえの食糧にハエを維持します。
。
2. 収集 UAS-Dicer2;DDC GAL4 フライ virginsunder 二酸化炭素 (CO ₂) 麻酔
。
3. は 2 日間の古い大人の男性のハエの次の遺伝子型を運ぶにこれらの処女をクロス: UA mCD8GFP (コントロール) auxR ¹⁶¹⁸² (aux RNAi) 、auxGFP (aux 過剰発現)、および auxR ¹⁶¹⁸²;auxGFP (救助)、男性: 女性の比率 1:2
。
4. 個別収集新しく 25 で標準的な食品の各正規フライ バイアルに 10 ハエを配置する実験ごとに各グループの 3 バイアルにこの男女 ° C
5. 実験によって維持、収集まで 35 日間を飛ぶし、5、15、25、35 日で自動リング分析に使用します
。

2。リング測定を自動化

1. 転送 10 採集されたハエ (男女兼用) 遺伝子ごとに各バイアル、し、ネジでバイアル。コントロールや一緒に実験のセットごとに異なる遺伝子型を運ぶ蠅を分析 (最大で 10 バイアル同時に各バイアル 10 ハエ).
2. 装置の前に置かれたデジタル カメラの電源し、ハエを一度録音を開始、すべて読み込まれ、準備ができています
。
3. バイアルに定住するハエの 1 分を可能にした後オンにステップ ドライバー制御ステップ コント ローラー; これは、連続して上昇し、4 回に 2 装置をタップを接続されているレバーを制御する小さな電気モーター ドライブ s。 図 1 を参照してください。
   1. めねじでは、ハエが壁を登るを開始することに注意してください。録音を続けることを確認します
   。
4. 3 に 5 の連続した試験の 2.3 で 60 の間隔の手順の説明に従って、自動同期を繰り返す
。
5. は、5、15、25、35 日間の古いハエの実験を繰り返します。グループごとに、少なくとも 3 の独立した実験を行う、各実験に少なくとも 30 収集飛ぶ (3 バイアル).

3。データ分析

1. 録画したビデオをコンピューターにインポートします
。
2. 6 でビデオのスナップショットを取るトライアルごとにタップした後で s.
3. RflyDetection ソフトウェア スナップショット イメージをインポート ( 図 2 を参照) を使用して、' ファイル ' メニュー
。
4. ツールバーの [ベースライン アイコンを使用して画像の上限と下限のベースラインをマークするカーソルを使用して正確にバイアルの上限と下限のベースラインを設定します
。
5. 入力 (例えば、10 ここ) バイアルあたりハエの数、' rect を飛ぶ ' フィールドとバイアルの長さ (例えば、14 cm ここ) で、' チューブ高さ ' 設定バー内にあるフィールド。
   1. 個々 の飛行位置を検出し、各バイアルの画面上のドットの付いたメモします
      。 注: 図 2 は、すべてのメニューのボタンのクリックの位置を示します
   。
6. ソフトウェアは自動的に各フライの登山距離を決定します、右側のパネルの表に各バイアルに 10 ハエから平均値が表示されます。( 図 2 参照)
7. プロセス、さらに統計分析統計ソフトウェア (例えば プリズム) 登山番号です
。
8. 現在データとして意味 ± SEM.
9. P を計算-意義の値 (アスタリスクで示されている * p < 0.05、* * p < 0.01、* * * p < 0.001) 複数の比較テスト ボンフェローニの一方通行 ANOVA を使用して

この記事では、フライの負の走動作を評価する自動リング アッセイの使用を示します。以前リング アッセイとは異なり、我々 の分析含む飛ぶアクションを同期に電気の力を提供し、数百のハエを分析自動化装置同時に (図 1)。Dicer2; の解析DDC > auxR16182 、DA ニューロンのaux式、フライの自発運動に重要示唆しているハエは、男女ともにハエの 6 のタイム フレームで登山距離、年齢依存的な低下を示した。DA ニューロン、 auxGFP過剰発現に影響していないよう登坂力と共同auxR16182およびauxGFP DA ニューロンで発現救出 RNAi 表現型 (図 2および図 3)。検証に加えて自動リング アッセイ DA ニューロン変性に関連付けられているモーターの欠陥を評価するための高スループットで効率的な方法として、これらの結果もこの自動化されたアプローチがある可能性を特定するに役に立つパーキンソン病のリスク因子し、神経変性職務上の手掛かりを提供します。

図 1。自動リング装置。(AとB) フロントと装置の背面ビュー: (6) フレーム (3)、透明プラスチック バイアル (4)、バー (5) 泡、金属ベースの管、マイクロ ステップ ドライバー (7)、電子コント ローラー (8) を確保するためのネジ、垂直鋼棒 (2) ソケット (1)スイッチ (9)、小型モータ (10)、小さな電気モーター (11) に接続されているレバー。長方形の金属フレームのサイズは、46 cm × 26 cm × 16 cm、10 透明なプラスチック バイアル (直径 14.5 cm 高さ 2.1 cm) ネジを使用して保護を保持しています。装置をオンに最初 (8) が点灯するスイッチ (9) をクリックして (7) と (10) その結果。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2。代表の分析 RflyDetection による画像のスナップショットします。スナップショット イメージは RflyDetection ソフトウェアにインポートし、インターフェイスで各アイコンのアクション、右側のテキストで示されます。上部と下部の基準計画を設定した後、ソフトウェアは自動的に検出し、バイアル内フライの位置をマークします。6 登山距離 (cm) 各フライの s と各バイアルの平均値がテーブルに表示されます。これらの数字は、さらに統計分析のための統計解析ソフトウェアにインポートされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3。統計バー グラフの年齢に依存して減少を示す登山能力を飛ぶは、 aux式が DA ニューロンのダウンレギュ レートします。自動リング試金が次の遺伝子型を運ぶハエの負の走動作の分析に使用された: auxR16182/+ (ないの Gal4) UA Dicer2;DDC Gal4ハエw1118 (コントロール)、 UA mCD8GFP (コントロール) auxR16182auxGFPとauxR16182; auxGFP (救助) に渡った。男性と女性の両方のハエ登ったときaux式の DA ニューロンの減少した時間をかけて大幅に遅くなることに注意してください。歩行障害は、 aux式を再導入時に救出されました。5、15、25、35 日間の古いのハエを評価しました。男性 (A) と (B) のメスの成虫が個別に表示されます。遺伝子型ラベルの異なるバーの色に対応する伝説は、右側に表示されます。データのとおり、平均 ± SEM. p-意義の値 (アスタリスクで示されている * p < 0.05 * * p < 0.01、* * * p < 0.001、ns: オブジェクトを示すアスタリスクの下意義、バーが描画されません比較) mCD8GFPコントロールまたはaux RNAi ボンフェローニの多重比較検定一方通行 ANOVA を使用して比較することを求めた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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