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方法論記事

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

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DOI:

10.3791/56508

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2018年2月6日

 ,  ,  , 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

この記事について

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サマリー

希少な B 細胞人間の血液循環から始まって、興味の抗原のために特定の抗体の生産のための手法について述べる。これらの自然抗体の生成は効率的かつ迅速、得られた抗体関連性の高い抗原の間で区別することができます。

要約

モノクローナル抗体 (Mab) は、両方の基礎研究および生体医に役立つ強力なツールです。抗体は (例えば、正常な蛋白質およびその変異バージョン) の関連性の高い構造を区別する必要がある場合、高い特異性が必要不可欠です。このような差別の Mab を生成する現在の方法には高価な時間のかかる複数の Ab-産生 B 細胞のスクリーニングが含まれます。提案する迅速かつコスト効果の高い方法の識別、生成のため B リンパ球を循環血液から始まって完全ひと抗体.この戦略の独創性は、容易に利用可能な末梢血単核細胞 (PBMC) を使用して、他のすべてのセルのカウンターの選択を組み合わせる特異抗原結合 B セルの選択によるものです。単一のセルを逆転写ポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) 技術を使用して人間で表されるその後に対応する mAb のコーディング (相補的デオキシリボ核酸) cDNA シーケンスを取得特定の B 細胞が分離されたら、セルです。わずか 1 ヶ月で、内自然 B 細胞レパートリーによって検出されたあらゆる目的の抗原に対して指示される高い識別人間 Mab のミリグラムを生成することが可能です。

概要

ここで説明する方法は、目的の抗原 (Ag) に対するモノクローナル抗体 (Mab) を完全に人間の迅速かつ汎用性の高い生産を可能します。Mab は、多くの基礎研究アプリケーションin vitroとin vivoで不可欠なツール: たとえばフローサイトメトリー、組織学、西部のしみを付けおよびブロックの実験の流れ。さらに、自己免疫疾患、がん、治療し、移植拒絶反応1を制御する Mab をより多くに医学で使用されています。たとえば、反 ctla の条項 4、抗 PD 1 (またはアンチ PD L1) Mab は最近がん治療2免疫チェックポイント阻害剤として使用されました。

免疫グロブリン (Ig) で作り出された最初のモノクローナル抗体-免疫マウスまたはラットの脾臓細胞から得られたハイブリドーマを分泌します。ただし、マウスまたはラット モノクローナル抗体と強い免疫反応は、その急速なクリアランスと過敏反応3のありそうな誘導のための人間の彼らの治療上の使用を妨げます。この問題に取り組むため、Mab の動物性タンパク質シーケンス部分的に取って代わられましたいわゆるキメラ マウス ヒトやヒト化抗体を生成する人間の物。ただし、この戦略は部分的にしかコストと生産時間規模の両方を大幅に増加させながら、免疫原性を減少します。よい解決策はヒト B 細胞から直接人間の抗体を生成する、このためのいくつかの戦略があります。それらの 1 つは、ファージや酵母のディスプレイの使用です。これは含まランダム人間 Ig 重のコンビナトリアル ライブラリから可変領域を表示し、光チェイン ファージや酵母と興味の特定の抗原を用いた選択のステップを実施します。この方法の主な欠点は、重く、軽鎖がランダムに関連付けられ、生成された抗体の多様性の非常に大きな増加につながることです。抗体は特定 Ag に対する自然免疫応答から生じるだろっているものに対応しています。また、人間のタンパク質の折りたたみおよびポスト翻訳の修正、複製は、体系的に原核生物や酵母。2 番目の人間 mAb 生産方法は、エプスタイン ‐ バーウイルス感染や抗アポトーシス因子 BCL 6 および BCL-XL4発現によって自然の人間の B 細胞の不死化です。ただし、このメソッドは、メモリー B 細胞にのみ適用され、多数 mAb 生産不死化 B 細胞が目的の抗原特異性と (もしあれば) いくつかの mAb のクローンを識別するためにスクリーニングを必要とする、効率的ではありません。メソッドはこのように高価な時間のかかるです。

新しいプロトコルは、隔離された単一 B 細胞5から人間の抗体の生産の最近記載されています。最適化された単一セル逆転写-ポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) の増幅の両方、重と光-鎖のセグメントを単一の並べ替えられた B 細胞からのエンコードを依存しています。真核生物発現系、完全に人間の mAb の再構築をできるように、クローニングと発現のこれらのセグメントのこの続きますです。このプロトコルは、ワクチン接種ドナーからの B 細胞から正常に使用されています。セルを目的の Ag に対して指示される B 細胞の高い周波数を取得し、6をスクリーニングするために必要な時間を制限するワクチン接種後数週間収穫されました。他の完全ひと抗体は、HIV+ (ひと免疫不全ウイルス) 感染患者7と黒色腫患者8から生産されています。これらの進歩にもかかわらずプロシージャがないまだ利用可能メモリ表現型や頻度の独立した Ag 固有の B 細胞の分離ができます。

手順ここで効率的な前のヴィヴォ完全ひと抗原特異的モノクローナル抗体低上映時間と高収率で生産が続く、BCR 特異性に基づいて人間の循環 B 細胞の分離につながる。メソッドは、メモリー B 細胞や抗体産生 B 細胞免疫反応を誘導する制限されていないが、人間ナイーブ B 細胞レパートリーにも適用することができます。Ag 特定 B 細胞は非常に低い周波数で存在からでも動作する、効率の良い指標です。法の原理は次のように: 末梢血単核細胞 (PBMC) は興味の抗原を提示 2 テトラマーと汚れる、それぞれ異なる蛍光色素 (例えば、フィコエ リスリン (PE)、アロフィコシアニン (APC))、というラベルの付いた密接に関連抗原提示第 3 四量体共役 3 蛍光色素 (例えば、ブリリアント バイオレット 421 (BV421))。抗原結合セルの豊かにする細胞は、抗 PE をコートしたビーズと孵化させると反 APC Abs、細胞分離カラムでソートします。PE+ APC+細胞画分が選択されます種類 PBMC 細胞 B 細胞の同定を許可するために特定の抗体の様々 なステンド グラスと受ける流れ cytometry 細胞選別します。PE+と APC+、鮮やかなバイオレット-、しかしである B 細胞は分離されています。この手順は、カウンター B 細胞ではないまたは tetramerized の抗原にはバインドしませんが、PE/APC (PE+ APC-または PE- APC+これらの細胞になる) または使用されるテトラマー (これらの非抗原部分にバインドを行うセルを選択しますセルになります BV421+)。B 細胞の高い関心のエピトープに固有ではないがこのステップでも反選択されます (これらの細胞に BV421 なるも+)。したがって、このメソッドは、表現する B 細胞受容体 (BCRs) 2 つの非常に密接に関連抗原の間で区別することができる非常に特定の B 細胞を浄化できます。チューブに収集され、単一の特定の B 細胞と、Ig の PCR 増幅 Cdna (相補的デオキシリボ核酸) を複製し、分泌された IgG 抗体としてのひと細胞ラインで表現。

概念の証拠としてこの調査は記述するペプチドが提示主要な組織適合性の複雑なクラスによって認識される人間の抗体の効率的な生成 (MHC-私) 分子とを区別することができますこのペプチドと同じで読み込まれる他のペプチドMHC-私の対立遺伝子。このメソッドは (i) に Ag 固有 Mab; の高収量回復を可能この Ag の複雑さのレベルは重要ですが、(ii) 構造的に 2 つを区別することができるモノクローナル抗体の生産は、Ags を閉じます。このアプローチは、プロトコルのままには、ワクチン接種や感染患者に拡張することができます、ヒト化ラット システム9にもすでに、正常に実装されています。したがって、本研究は基礎研究と免疫療法で使用することができます完全ひと抗体を生成する汎用性と効率的なアプローチについて説明します。

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プロトコル

すべてのひと末梢血サンプルはローカル倫理委員会 (エタブリセモン Français デュを歌った、EFS、ナント、プロシージャ PLER NTS-2016-08) に基づき、インフォームド コンセント後匿名成人ドナーから得られました。

1. ひと末梢血単核細胞の分離

注: 開始材料合計ひと末梢血や樹形サンプルできます。サンプルは、8 h 以上べきではないと、抗凝固剤 (例えばヘパリン) を添加しました。

  1. 2 つの容積 (ひと末梢血) とは、血液や RPMI (ロズウェル パーク記念研究所) 中の 5 冊 (樹形サンプル) を希釈します。
  2. 慎重に層の密度勾配 50 mL の円錐管中の 15 mL に希釈した細胞懸濁液 35 mL。すべての希釈した血液を配布する必要に応じて、多くの管を行います。オフ ブレーキ付けスイング バケツの回転子に室温で 25 分 1,290 × g で遠心分離機します。
  3. 慎重に密度勾配媒体とプラズマ層の界面に単核細胞層を吸引し、細胞を新しい 50 mL の円錐管に転送します。
  4. RPMI 培地で管を埋める、混合し、室温で 10 分間 1,290 × g で遠心分離機します。上清を慎重に取り外します。
  5. RPMI 培地および血小板を削除に 10 分間、200 × g で遠心分離の 20 mL の細胞ペレットを再懸濁します。上清を慎重に取り外します。この手順をもう一度繰り返します。
  6. 10 %rpmi 培地で細胞ペレットを再懸濁します胎仔ウシ血清 (FBS)。
    注: テトラマー ラベルに直接進むまたは 107セル/mL の濃度で一晩 4 ° C で細胞を保ちます。

2 Ag 特定の B 細胞の四量体関連磁気濃縮

  1. Ag テトラマーを準備するには、いずれかの PE を追加 APC ラベル プレミアム グレード ストレプトアビジンまたはビオチン標識抗原モノマーを 1:4 のモル比で BV421 標識ストレプトアビジンです。室温で 10 分ごと 1 つの因数を追加する 3 つの独立した部分にストレプトアビジン共役の適切な量を追加します。
  2. 15 mL の円錐管の細胞 (最大 3 × 108チューブあたり) を配布し、5 分 460 × g で遠心分離機します。
    注: 次のプロトコルは、1 つの管です。
  3. 2% で 200 μ L の PBS (リン酸緩衝生理食塩水) で細胞ペレットを再懸濁します FBS。PE ・ APC ・各 10 μ G/ml の最終的な集中に BV421 共役テトラマーを追加します。よく混合し、室温で 30 分間インキュベートします。
  4. 0.5 %bsa (ウシ血清アルブミン) と EDTA (エチレンジアミン四酢酸) PBS を使用して冷たい細胞分離バッファー (SB) の準備 2 mM。
  5. 5 分 460 × g で遠心分離によって SB. ペレット セルの 10 mL を追加します。
  6. 500 μ L 抗 PE と 50 μ L マイクロ アンチ APC 磁気ビーズの冷たい SB. 追加 50 μ の細胞を再懸濁します。
  7. よく混合し、4 ° C で 20 分間インキュベート
  8. 2.5 の手順を 2 回繰り返します。
  9. 上清を慎重に排除 andresuspend 氷冷 SB で 2 x 108セル/ml の濃度で細胞ペレット。
  10. SB の 3 mL で磁石に配置されている大規模な磁気列を平衡します。
  11. 2.9 釣合い列の一番上から細胞懸濁液を転送し、完全に排水すること。重要なステップ: 列の凝集を避けるために、70 μ m のナイロン メッシュを細胞を通過します。
  12. 3 ml の氷冷 SB の細胞を含んでいたチューブを洗浄し、(場合にろ過、洗浄、70 μ m ナイロン メッシュ) 列に直接バッファーを転送します。
  13. バッファーが列に排水している完全に別の 3 mL の氷冷 sb を列に追加します。
  14. 別の 3 mL 洗浄手順 2.13.
  15. 15 mL コニカル収集管磁石と場所から列を削除します。
  16. 列の一番上に氷冷 SB の 5 mL を追加し、プランジャーを使用して、列からセルをすぐにフラッシュします。この手順をもう一度繰り返します。
  17. 遠心分離機の 460 x g で 5 分で集められたセル (濃縮関連テトラマー陽性細胞分画)、追加抗体の汚損に進みます。
    注: プールすべてのチューブから必要に応じて細胞を収集しました。

3. Ag 固有ヒト B 細胞・細胞のソーティングの染色

  1. 抗 CD3 抗体のカクテルが細胞ペレットを再懸濁します (最終希釈: 1:20)、CD19 (1:20)、CD14 (1:50)、CD16 (1:50)、および 7AAD (1: 1000) 2 %100 μ L の PBS の最終巻で政府短期証券。4 ° C で 30 分間インキュベートします。
  2. 10 mL の PBS を加える細胞、460 x g で 5 分間遠心、上清を除去します。この手順をもう一度繰り返します。200 μ L の PBS、70 μ m ナイロン メッシュ フィルターで細胞ペレットを再懸濁します。
  3. 1,000 イベント/秒9を超えることがなく 100 μ m ノズルと 20 psi の圧力細胞ソーター cytometer の単一セルのレベルで特定の B 細胞を並べ替えるに進みます。
    メモ: 使用されるゲートの戦略は、図 1.に示されてセルされた CD14 のゲート最初-CD16-7AAD-細胞単球、NK と死んだ細胞 (図 1には表示されていません) を除外します。その後、CD19+ B 細胞は PE と APC 関連 Ag テトラマーを二重染色細胞のゲート前に選択されました。非特異 B 細胞は (無関係な Ag テトラマーにより無染色) BV421 否定的な細胞のゲーティングによって除外されました。
  4. 8 ストリップ PCR チューブ 96 マイクロ チューブ用ラックの配置、以前に 10 μ L の 1 x PBS と RNAse 阻害剤の 10 単位記入に単一 B 細胞を収集します。-80 ° C で PCR チューブを直ちに凍結します。
    注: cytometer 楽器選択ソート マスク、収量マスク: 0、純度マスク: 32、および位相マスク: 0。 必要な場合は 96 または 384 ウェル PCR プレートに調整されるこの単一セルの預金。単一 B 細胞は、できるだけ早く冷凍する必要があり、必要な場合は、数週間のためにおけます-80 ° c。

4. 単一細胞 RT-PCR

  1. 直接 PCR ストリップ乾燥お風呂で 5 分の 70 ° c で凍結試料を加熱することによって細胞を溶解させます。
  2. 1 mM dNTP、25 μ G/ml oligod(T) プライマー、5 μ M ランダム hexamers、RNAse 阻害剤 20 台、逆転写酵素の 400 台を含むマスター ミックス バッファー x 2 のチューブあたり 10 μ L の追加によって転写 (RT) を逆に進むし、氷にストリップを転送します。
    注: 後細胞融解、RT する必要があります実行するすぐに RNA の劣化を避けるために。
  3. ランダム hexamers 交配、50 ° C で 1 時間インキュベートし、反応を停止する 3 分 95 ° C で培養が完了するを許可するように 5 分 25 ° C で孵化させなさい。
  4. 各変数重 (vH) とカッパ (vLκ) またはラムダ軽鎖 (vLλ) のエンコーディングの領域のネストされた PCR の拡大の 2 つのラウンドに進みます。
    注: また、RT サンプル-20 ° C で凍ってでき 1 週間続けた。
    1. PCR の最初のラウンドの 1.5 mM MgCl2、0.25 mM dNTPs、DNA ポリメラーゼの 2.5 単位、200 を含む 40 μ L の最終巻の cDNA の 3 μ L を追加外側のプライマー (プライマー シーケンスの材料の表と図 2を参照) の nM。
      注: 外側プライマー ミックスの組成物。重鎖増幅用: 4 転送プライマー (5' LVH ミックス) と 2 逆プライマー (3' CµCγ ミックス)。3 光カッパ鎖増幅用プライマーに転送 (5' LV | ミックス) と 1 逆プライマー (3' Cκ543 566)。光ラムダ チェーン増幅用プライマー (5' LVl ミックス) 前進の 7 と 1 逆プライマー (3' Cl)。
      注: プライマーは、すべての重鎖および軽鎖遺伝子5の増幅の分げつらによって設計されていた。
    2. 次のサイクリング条件を適用: 94 ° C、4 分 30 の 40 のサイクルが続く 94 ° c、30 秒 58 ° C、VH と VLκ (VLλ の 60 ° C)、および 55 で s 最終伸長の 72 ° c s ステップ 7 分の 72 ° c。
    3. 2 番目のラウンドの PCR のため 40 の最終巻の最初の増幅産物の 3 μ L を使用して含む 1.5 mM MgCl2、0.25 mM dNTPs、DNA ポリメラーゼの 2.5 単位、200 μ L 式にクローニングに制限酵素サイトを含む内部のプライマーの nMベクトル (プライマー シーケンスの材料の表と図 2を参照)。
      注: 内部プライマー ミックスの組成物。重鎖増幅用: 9 転送プライマー (5' AgeIVH ミックス) と 3 逆プライマー (3' SalIJH ミックス)。9 光カッパ鎖増幅用プライマーに転送 (5' AgeIV | ミックス) と 3 逆プライマー (3' BsiWIJκ ミックス)。光ラムダ チェーン増幅 6 転送プライマー (5' AgeIVl ミックス) と 1 逆プライマー (3' XhoICl)。
      注: プライマーは分げつら、重鎖および軽鎖遺伝子5のすべての増幅によって設計されていた。
    4. 次のサイクリング条件を適用: 94 ° C、4 分 30 の 40 のサイクルが続く 94 ° c、30 秒 58 ° C、VH と LCκ (LCλ の 60 ° C)、および 45 秒最終伸長 72 ° c s ステップ 7 分の 72 ° c。
  5. VH、vLκ および vLλ (変数の重鎖エンコード セグメントの 500 bp 製品) と可変軽鎖セグメントのエンコードの 350 bp 製品 1.5% の agarose のゲルの PCR の製品の 5 μ L 移行によって肯定的な井戸を識別します。
  6. PCR の製品の浄化のために設計された限外ろ過膜を使用して肯定的な井戸から残り残りの 35 μ L の PCR の製品を浄化します。
  7. H2o. の 60 μ L の PCR の製品を溶出します。

5. 発現クローニング

  1. 挿入を準備します。
    注意: ダイジェスト 60 μ L 各精製 PCR の製品の適切な制限酵素バッファーを含んでいる 100 μ L の最終巻。
    1. VH PCR の製品、上井の 50 台、50 台・ サリを追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート
    2. VLλ PCR の製品、上井の 50 台、XhoI、50 台を追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート
    3. VLκ PCR の製品、上井の 50 単位を追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート96 PCR 膜を用いたダイジェストを浄化、BsiWI、50 単位を追加して BsiWI 制限酵素バッファーの 100 μ L の最終巻で 60 μ L の溶出液 60 μ L H2O をダイジェストで溶出、55 ° C で 1 時間インキュベート
    4. 15 分で 80 ° C に加熱することにより酵素を不活性化します。
  2. ベクトルを表現する準備
    注: vH PCR の製品が一定の重鎖特異的な IgG1 の Cγ1 を含む発現ベクター (HCγ1) に複製されます。vLκ PCR の製品は、Cκ 定数の軽鎖を含む発現ベクター (LCκ) に複製されます。vLλ PCR の製品は、Cλ 定数の軽鎖を含む発現ベクター (LCλ) に複製されます。
    1. 次の消化力に従います。
      1. 式のミックス 1 μ g 上井 10 台、制限バッファー、製造元の推奨の 20 μ L の総ボリュームで SalI エンドヌクレアーゼの 10 台の HCγ1 をベクターし、37 ° C で 1 時間インキュベート
      2. 上井制限酵素バッファー制限の 20 μ L の総ボリュームの 10 単位を発現ベクター LCκ のミックス 1 μ g は、メーカーの推奨し、37 ° C で 1 時間インキュベートBsiWI 制限の酵素、10 単位を追加し、55 ° C で 1 時間インキュベート
      3. 上井 10 台、バッファー制限の 20 μ L の総ボリュームの XhoI エンドヌクレアーゼの 10 台と発現ベクター LCλ のミックス 1 μ g は、製造元の推奨し、37 ° C で 1 時間インキュベート
    2. 制限酵素を不活化する 10 分の 65 ° C でそれぞれ消化の混合物を加熱します。
    3. 2 μ L で消化液の PCR の製品の 5 μ L の結紮を実行 (100 ng) の 1 ユニット T4 DNA リガーゼの 4 ° C で一晩培養による DNA リガーゼ バッファー x 1 の 20 μ L の容量に対応する線形表現のベクトル
      注: また、結紮実行は 4 ° C で 3 h
  3. クローン作成
    1. 自家製 electrocompetent TOP10エシェリヒア属大腸菌(セクション 1.8.4-1.8.8 分子生物学の現在のプロトコル) の 45 μ L に 20 μ L 結紮混合物の Electroporate 1 μ L。すぐに 2 X YT 媒体を 500 μ l 添加し、YT アンピシリン プレート × 2 に変換拡散細菌で 37 ° C で 30 分間湯せんで孵化させなさい。37 ° C で一晩インキュベートします。
    2. 変換ごとに 8 つのコロニー PCR による画面します。
      1. 氷の上次のように反応のプレミックスを設定: 45 μ L の PCR のバッファー、MgCl2 (25 mM) の 12 μ L、(それぞれのストック含む 10 の mM) からの dNTPs の 4 μ L、前方プライマー (在庫 10 μ M) ベクトル シーケンス (プライマー Ab vec 感覚) に交配させることの 10 μ L x 5、と逆プライマー (在庫 10 μ M) 一定の重いまたは軽い鎖領域をターゲットの 10 μ L (プライマー シーケンスの材料表を参照してください)。200 μ L H2o. の最終的なボリュームを構成します。4 μ L の DNA ポリメラーゼの酵素 (5 U/μ L) を追加します。
      2. 氷の上の 8 ストリップ PCR チューブごと反応プレミックスの 25 μ L を配布します。
      3. 生殖不能のつまようじを使用して、個々 のコロニーをピックアップします。レプリケート プレートを構成し、PCR の反作用の管にそれをつける 2 x TY アンピシリン プレート上につまようじを連勝します。
      4. 次のサイクリング条件スクリーニング PCR を行う: 94 ° C 10 分の 30 の 25 サイクル順 94 ° c、30 秒 55 ° c、s と 50 s 72 ° C で
      5. 1.5% の agarose のゲルの PCR の製品の 5 μ L 移行によって肯定的な細菌を識別します。
        注: 陽性コロニー PCR の製品の約 850 を与える重鎖ベクトルと 600 bp 軽鎖ベクトル bp。
    3. LB 培地 2 mL にレプリケートのプレートから 4 つの肯定的なコロニーを接種して 200 rpm で振とうしながら 37 ° C で一晩インキュベートします。
    4. 製造元によって示されるプラスミド精製キットを使用して液体の文化からプラスミドを抽出します。
    5. サンガーによる可変ドメインの正しい挿入を確認 Ab vec 感覚プライマーとプラスミドのシーケンスします。
      注: (エンコード HC および対応する LC) 正しい挿入プラスミドは cotransfected 293A 分泌細胞にします。小さなスケール生産モノクローナル抗体の特異性は ELISA によって試金します。その後、該当する場合、大規模な生産が実行されます。

6. モノクローナル抗体の生産

  1. 特異性をチェックするための小規模な生産
    1. 200 μ L のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% における細胞のトランスフェクション、種 15,000 人間の萌芽期の腎臓 293A 前日 (HEK 293A) 短期国債/ウェルの 96 ウェル プレートで。37 ° C で CO2インキュベーター (5% CO2) で一晩インキュベートします。
    2. 293A 10% を含む DMEM 培地で細胞を cotransfect FBS トランスフェクション試薬として線形ポリエチレンイミン誘導体を使用しています。
      メモ: は、トリプリケートで遺伝子導入を行います。次のプロトコルは、底が平らな 96 ウェル プレートのウェル 1 個です。
      1. 150 mM の NaCl を 10 μ l 添加に 0.5 μ L の DNA トランスフェクション試薬を希釈します。0.125 μ g の vH と vL 表現するベクトルの 0.125 μ g を 150 mM の NaCl の 10 μ L に希釈します。渦各希釈 10 s。
      2. 10 μ L に 10 μ L の DNA の解決の DNA トランスフェクション試薬の希釈を追加します。渦 15 s と室温で 15 分間インキュベートします。293A 細胞 drop-wise 20 μ L ミックスを追加し、ミックス プレートを軽く旋回します。
    3. 無血清培地で 5 日間および培養細胞をトランスフェクション後中 16 h を交換してください。
      注: は、血清 Igs 産生される抗体の汚染を避けるために、無血清培地を使用します。
    4. 5 分 460 × g で遠心分離によって細胞および残骸を排除します。
    5. マルチ チャンネル ピペットで吸引により培養上清を収穫し、V 底 96年ウェル プレートに転送。
    6. 一晩で再構成しなさい ELISA/コーティングのウェルあたり 100 μ L 4 ° C コート関連する Ag は、96 ウェル ELISA プレートで 2 μ G/ml の最終的な集中で 1 x をバッファーします。9の例を参照してください。
    7. 37 ° C で 2 時間 10% FBS DMEM 培地でブロック井戸
    8. 6.1.5 のステップから transfected 293A 細胞の培養上清の 50 μ L を追加し、室温 2 時間インキュベート
    9. 1 μ G/ml で西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 酵素抗ひと IgG Ab 共役の 100 μ L を追加し、室温で 1 時間インキュベートします。50 μ L の発色基質 (TMB) を追加し、20 分間インキュベートします。
    10. 450 の光学密度を読む nm の分光光度計です。
      注: 特定の抗体 ELISA の試金によって明らかにさらに大規模で生産することができます、精製タンパク質で人間の igg 抗体の親和性を示す列。
  2. 大規模な生産および特定の抗体の浄化
    1. 25 mL の 10% を DMEM を含む 175 cm2フラスコに細胞のトランスフェクション、シード 6 x 106ひと胎児腎臓 293A 前日 (HEK 293A) FBS。37 ° C で CO2インキュベーター (5% CO2) で一晩インキュベートします。
      注: セル 70% 合流トランスフェクションするときをする必要があります。
    2. 293A 10% を含む DMEM 培地で細胞を cotransfect FBS トランスフェクション試薬として線形ポリエチレンイミン誘導体を使用しています。
      1. 150 mM の NaCl の 450 μ L に 50 μ L の DNA トランスフェクション試薬を希釈します。10 μ g の vH と vL 表現するベクトルの 10 μ g を 150 mM の NaCl の 500 μ L に希釈します。渦 10 s 各希釈。
      2. DNA 溶液を希釈した DNA トランスフェクション試薬を追加します。渦 15 s と室温で 15 分間インキュベートします。Drop-wise 細胞に 1 mL ミックスを加え、フラスコを軽く旋回で混ぜます。
    3. 無血清培地で 5 日間および培養細胞をトランスフェクション後中 16 h を交換してください。
    4. 25 mL ピペットで吸引によって収穫中。
    5. 5 分 460 × g で遠心分離によって細胞および残骸を排除します。
    6. 4 ° C でのタンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システムに蛋白質 A をコーティングした 1 mL カラムを使用して抗体を浄化します。
      1. タンパク質に 20 mM リン酸バッファー (pH 7) セファローズ列を平衡します。
      2. 6.2.5 1.22 μ m フィルター 0.45 μ m のフィルターを使用してから細胞培養液をフィルター処理します。
      3. 列にフィルターが適用された媒体を読み込みます。
      4. 20 mM リン酸緩衝液 (7) で洗うし、0.1 M クエン酸バッファー (pH 3.5) を溶出します。
      5. 280 の光学密度を読む nm 吸光度とすぐに中和 1 M トリス緩衝液 (9) 分数のタンパク質を含みます。
    7. 3.5 K の分子量 PBS バッファー (pH 7.4) に対するカットオフのカセットの 4 ° C で一晩浄化された Ab を dialyze します。
    8. 製造元によって示されるとして、サイズ排除クロマトグラフィーによる 0.2 μ m のろ過とコントロールの純度によって殺菌しなさい。

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結果

このプロジェクトでは、ペプチド Pp65495を認識する人間の Mab の世代に健康なドナーから PBMC から始まって主要な組織適合性の複雑なクラスによって (Pp65、ヒトサイトメガロから) 提示私 (MHC-私) 分子 HLA A * 0201 (HLA-A2)。これらの Mab を区別このコンプレックスと同じ MHC に読み込まれる他のペプチドを表す複合体-私の分子。

PBMC は、HLA A2 Pp65 PE、HLA-A2/Pp65-APC、HLA A2/MelA2 BV421 テトラマー上記プロトコルで説明したようと染色.PE と APC テトラマー陽性細胞の免疫細胞濃縮後、溶出細胞は追加モノクローナル抗体で染色しました。流れ cytometry セルソーターの磁気濃縮細胞が実行可能な CD14 のゲート最初-CD16-CD3-CD19+

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ディスカッション

提案プロトコルは血で循環 Ag 特定の B 細胞から直接人間の抗体の生成のための強力な方法です。それは 3 つの重要な側面を組み合わせた: (i)、四量体関連磁気濃縮、まれな Ag-結合 B 細胞の前のヴィヴォ分離ができるの使用(cytometry 流れによって、BCR に関する必要な Ag; を発現する B 細胞のみを分離する 3 つの異なる蛍光色素で標識 3 つの Ag テトラマー (2 つの関連するものと無関係なものを 1 つ) を使用して ii) のゲートの戦略(iii) RT-PCR 単一セルのレベルで人間の細胞の Cdna の発現によって対応する組み換え mAb Cdna の再建。

以前の研究は、1 つまたは 2 つの蛍光関連抗原を使用して分離された B セル6,7,8から Mab の並べ替えおよびそれ以降の生産の前に人間の B 細胞をラベルする.関節リウマチ患者の ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

専門的な技術支援ありがとうフローサイトメトリー施設"CytoCell"(SFR 健康、Biogenouest、ナント)。彼らのテクニカル サポートもすべてのスタッフが組換えタンパク質の生産 (P2R) とプラットフォームの影響 (INSERM 1232、SFR 健康、Biogenouest、ナント) にありがちましょう。原稿の建設的なコメント、エマニュエル Scotet とリチャード ・ ブレスナックに感謝します。この仕事財政的に、IHU セスタス プロジェクトで、フランス国立研究機関 (ANR) (ANR-10-IBHU-005) を管理する «Investissements d'Avenir» フランス政府プログラムによって資金を供給によって支えられました。IHU セスタス プロジェクトはナントとペイ ・ ド ・ ラ ・ ロワール地方でもサポートされます。この作品は、将来プログラム ANR-11-LABX-0016-01 の投資を通して国立研究機関によってサポートされて LabEX 囲碁プログラムのコンテキストで実現しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
HEK 293A 細胞株サーモフィッシャー scientificR70507
DMEM (1X) ダルベッコ Modified Eagle MediumGibco by life technologies21969-035(+) 4,5g/L D-グルコース
0,11g/L ピルビン酸ナトリウム
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)Gibco by life technologies31870-025
ウシ血清アルブミン (BSA)PAAK45-001
Nutridoma-SPRoche11011375001100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4AmbionAM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8Invitrogen by Life Technologies15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)Dominique DutscherS1810-500
Ficoll - リンパ球の分離中EuroBioCMSMSL01-01密度 1,0777+/-0,001
ストレプトアビジン R-フィコエリトリン抱合体Invitrogen by Life TechnologiesS21388初級グレード 1mg/ml 5mM アジド
ナトリウム ストレプトアビジン、アロフィコシアニン抱合体Invitrogen by thermoFisher scientificS323621mg/ml
2mM アジド プレミアムグレード
ブリリアントバイオレット 421 ストレプトアビジンバイオレジェンド405225濃度:0,5mg / ml
抗PE共役磁気MicroビーズMiltenyi Biotec130-048-801
反APC共役磁気MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855
MidiMACsまたはQuadroMACSセパローターMiltenyi Biotec130-042-302 / 130-090-976
LSカラムMiltenyi Biotec130-042-401
CD3 BV510 BD horizonBD Pharmingen / BD Biosciences563109使用希釈 1:20
CD19 FITCBD Pharmingen / BD Biosciences345788使用希釈 1:20
CD14 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences561116使用希釈 1:50
CD16 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences338440使用希釈 1:50
7AADBD Pharmingen / BD Biosciences51-68981E (559925)Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter CytometerBD Biosciences
8-strip PCR tubesAxygen321-10-061
Racks for 96 microtubesDominique Dutscher45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)Invitrogen by thermoFisher scientific10777-019数量:5000U (40U/ul)
蒸留水 Dnase/RNase FreeGibco10977-035
Oligod(T)18 mRNA PrimerNew England BioLabsS1316S5.0 A260unit
ランダム六量体Invitrogen by thermoFisher scientificN8080127数量 : 50uM, 5nmoles
上付き文字 III 逆転写酵素Invitrogen by thermoFisher scientific18080-044数量:10000U(200U / ul)
GoTaq G2 Flexi DNAポリメラーゼPromegaM7805
dNTPセット、分子生物学グレードThermo ScientificR01824 * 100umol
5LVH1EurofinsACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		PCRの最初のラウンド - 重鎖の増幅 - アウタープライマー - フォワードPrmers
5LVH3EurofinsAAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		PCRの第1ラウンド - 重鎖の増幅 - アウタープライマー - フォワードPrmers
5LVL4_6EurofinsCCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		PCRの最初のラウンド - 重鎖の増幅 - アウタープライマー - フォワードPrmers
5LVH5EurofinsCAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		PCRの第1ラウンド - 重鎖の増幅 - アウタープライマー - フォワードPrmers
3HuIgG_const_antiEurofinsTCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		PCRの初ラウンド - 重鎖の増幅 - アウタープライマー - ヒトIgのリバースプライマー - 細菌PCRスクリーニング
3CuCH1ユーロフィンGGGAATTCTCACA
GGAGACGA		PCRの初ラウンド - 重鎖の増幅 - アウタープライマー - ヒトIgのリバースプライマー
5AgeIVH1_5_7EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		PCRの2回目のラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー - フォワードプライマー
5AgeIVH3EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAGG		PCRの2回目のラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー - フォワードプライマー
5AgeIVH3_23EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		PCRの第2ラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー - フォワードプライマー
5AgeIVH4EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAG		PCRの第2ラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー - フォワードプライマー
5AgeIVH4_34EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		PCRの2ラウンド目 - 重鎖の増幅 - インナープライマー - フォワードプライマー
5AgeIVH1_18EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		PCRの2回目 - 重鎖の増幅 - インナープライマー -フォワードプライマー
5AgeIVH1_24EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		PCRの2回目 - 重鎖の増幅 - インナープライマー -
ユーロフィンCTGCAACCGGTGTACATTCT
5AgeIVH3__9_30_33GAAGTGCAGCTGGTGGAG		PCRの2回目のラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー -フォワードプライマー
5AgeIVH6_1EurofinsCTGCAACCGGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		PCRの2回目のラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー 3SalIJH1_2_4_5
EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAGA		PCRの第2ラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー - リバースプライマー
3SalIJH3EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		PCRの第2ラウンド - 重鎖の増幅 - インナープライマー - リバースプライマー
3SalIJH6EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		PCRの2ラウンド目 - 重鎖の増幅 - インナープライマー - リバースプライマー
5'LVk1_2ユーロフィンATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		PCRの第1ラウンド - 軽鎖の増幅 k - アウタープライマー -フォワードプライマー
5'LVk3ユーロフィンCTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		PCRの第1ラウンド - 軽鎖の増幅 k - アウタープライマー - フォワードプライマー
5'LVk4ユーロフィンATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTCTG		PCRの最初のラウンド - 軽鎖の増幅 k - アウタープライマー -フォワードプライマー
3'Ck543_566EurofinsGTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		PCRの最初のラウンド - 軽鎖の増幅 k - アウタープライマー - リバースプライマー - バクテリアPCRスクリーニング
5'AgeIVk1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		PCRの第2ラウンド - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー - フォワードプライマー
5'AgeIVk1_9_1–13EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		PCR第2ラウンド - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー -フォワードプライマー
5'AgeIVk1D_43_1_8ユーロフィンCTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		PCR第2ラウンド - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー - フォワードプライマー
5'AgeIVk2ユーロフィンCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCACAC		第2ラウンド - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー -フォワードプライマー
5'AgeIVk2_28_2_30ユーロフィンCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		PCR第2ラウンド - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー -フォワードプライマー
5'AgeVk3_11_3D_11ユーロフィンTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC		PCRの2回目 - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー -フォワードプライマー
5'AgeVk3_15_3D_15EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		PCRの2回目 - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー -フォワードプライマー
5'AgeVk3_20_3D_20EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTGTTGACCAGTCT		PCRの2回目 - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー - フォワードプライマー
5'AgeVk4_1ユーロフィンCTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		PCRの2回目 - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー -フォワードプライマー
3'BsiWIJk1_2_4ユーロフィンGCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		PCRの2回目 - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー - フォワードプライマー
3'BsiWIJk3EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		PCR第2ラウンド - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー -フォワードプライマー
3'BsiWIJk5EurofinsGCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTGTC		PCR第2ラウンド - 軽鎖の増幅 k - インナープライマー - フォワードプライマー
5'LVl1EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		PCRの最初のラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - アウタープライマー -フォワードプライマー
5'LVl2EurofinsGGTCCTGGGCCCCA
GTCTGCCCTG		PCRの最初のラウンド - 軽鎖とラムダの増幅 - アウタープライマー -フォワードプライマー
5'LVl3EurofinsGCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		PCRの最初のラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - アウタープライマー -フォワードプライマー
5'LVl4_5EurofinsGGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		PCRの初ラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - アウタープライマー -フォワードプライマー
5'LVl6EurofinsGTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		PCRの初ラウンド - 軽鎖とラムダの増幅 - アウタープライマー - フォワードプライマー
5'LVl7EurofinsGGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		PCRの最初のラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - アウタープライマー -フォワードプライマー
5LVl8EurofinsGAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		PCRの最初のラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - アウタープライマー -フォワードプライマー
3'ClEurofinsCACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		PCRの最初のラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - アウタープライマー -フォワードプライマー
5'AgeIVl1EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		PCRの2回目 - 軽鎖とラムダの増幅; - インナープライマー -フォワードプライマー
5'AgeIVl2EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		PCRの2回目 - 軽鎖とラムダの増幅; - インナープライマー - フォワードプライマー
5'AgeIVl3EurofinsCTGCTACCACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		PCRの2回目 - 軽鎖とラムダの増幅; - インナープライマー -フォワードプライマー
5'AgeIVl4_5EurofinsCTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		PCRの2回目 - 軽鎖とラムダの増幅 - インナープライマー -フォワードプライマー
5'AgeIVl6EurofinsCTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		PCRの第2ラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - インナープライマー -フォワードプライマー
5'AgeIVl8ユーロフィンCTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		PCRの第2ラウンド - 軽鎖とラムダの増幅; - インナープライマー -フォワードプライマー
3'XhoIClユーロフィンCTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		PCRの2回目 - 軽鎖とラムダの増幅。- インナープライマー -リバースプライマー - バクテリアPCRスクリーニング
Ab-vec-senseEurofinsGCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		バクテリアPCRスクリーニング
QA Agarose-TM, Molecular Biology GradeMP BioAGAH0500
NucleoFast 96 PCR PlateMacherey Nagel743.100.100
Enzyme Age I HFNew England BiolabsR3552L20000U/ml
Enzyme SalI HFNew England BiolabsR3138L20000U/ml
Enzyme Xho INew England BiolabsR0146L20000U/ml
Enzyme BSIWINew England BiolabsR0553L10000U/ml
HCg1 (Genbank受託番号 FJ475055)
LCk (Genbank受託番号 FJ475056)
LCl (Genbank受託番号FJ517647
サーモフィッシャーサイエンティフィック社製 15224.017100U (1U/ul)
2X YT 培地シグマ アルドリッチY1003-500ML
アンピシリンシグマ アルドリッチ10835242001
LB (ルリア・ベルタニ) ブロス (レノックス)シグマ アルドリッチL3022-250G
ヌクレオスピンプラスミド DNA、RNA およびタンパク質精製Macherey Nagel740588.250
Jet PEI DNAトランスフェクション試薬PolyPlus101-40
フラットボトム96ウェルプレートファルコン353072
Vボトム96ウェルプレートNunc/Thermofisher055142
Nunc easy 175 cm2 フラスコNunc/Thermofisher12-562-000
ELISA/ELISPOTコーティング緩衝液eBiosciences00-0044-59
Nunc maxisorp 平底 96 ウェル ELISA プレートNunc/Thermofisher44-2404-21高タンパク質結合
抗ヒト IgG Ab 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)BD Pharmingen / BD Biosciences55788
TMB 基質BD Biosciences555214
ストレプトアビジンシグマS0677
1 mL-HiTrap protein A HP カラムGE Healthcare17-0402-01
ÄKTA FPLCGE Healthcare18190026
Superdex 200 10/300 GL カラムGE Healthcare17517501
NGC Quest 10 Plus クロマトグラフィーシステムBioRad7880003

参考文献

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  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
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  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
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  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
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再版と許可

訂正


Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

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