有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた

Mohammed A. Amin; Dileep Varma

doi:10.3791/56513

Method Article

有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた

DOI:

10.3791/56513

⸱

December 5th, 2017

Mohammed A. Amin¹ , Dileep Varma¹

¹Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

Summary

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高分解能共焦点顕微鏡を用いた解析に続いて HeLa 細胞の二重チミジン同期するためのプロトコルを提案します。このメソッドは、多数の有糸分裂、また界面機能を有する多機能性蛋白質の細胞分裂の役割の解明を可能にする S 期から同期的に進めるセルを取得するキーです。

Abstract

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位相依存的に細胞周期の様々な規制のイベントの研究は、細胞増殖と分裂についての明確な理解を提供します。細胞周期の特定の段階のセル人口の同期は、このような実験的努力で非常に役に立つ発見されています。比較的より少なく有毒な化学薬品処理による細胞の同期は、結果として細胞周期イベントの選択した分裂段階の特定の濃縮を得ようと研究の薬理学的阻害薬の使用上有利なすることができます。ここで、セルのさまざまな段階で同期のひと細胞周期 S 期と M 段階二重チミジンブロックの両方を含むと染色体の整列の有糸分裂蛋白質の機能を研究するための手順をリリースプロトコルを説明します。分離。このプロトコルは、確立された界面の機能を持つ多機能タンパク質の細胞分裂の役割を研究するため非常に便利になっています。私たちのケースでは Cdt1、レプリケーション元ライセンス G1 期での重要な蛋白質の細胞分裂の役割を効果的に学ぶことができます G2/M 固有 Cdt1 が枯渇することができる場合にのみ。二重チミジンの同期を使用して特定の G2/M Cdt1 の枯渇のための詳しいプロトコルについて述べる。また、セル固定のプロトコルを説明し、チミジンリリース後高分解能共焦点顕微鏡を用いた細胞イメージングを住んでいます。メソッドは Hec1、複雑な Ndc80 のコンポーネントのように生理と摂動条件下で細胞分裂蛋白質の機能を分析し固定と生きている細胞の分裂期の細胞の大規模なサンプルサイズを取得することができるため便利分析も紹介します。

Introduction

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細胞周期細胞は彼らのゲノムと増殖の正確な重複規制の厳しいと一時的制御イベントのシリーズを受けます。哺乳類細胞周期の間期と M 期ので構成されます。中間期の 3 つの段階 - G1、S から成っている、セル G2 のゲノムを複製し、正常な細胞周期進行¹^,²のために必要な成長を経る。(前期 prometaphase、中期、後期、終期) 有糸分裂と細胞質分裂から成る M 相親細胞は遺伝的に同一の 2 つの娘細胞を生成します。続いて中期プレート (中期) の整列の有糸分裂、姉妹染色分け体重複ゲノムの凝縮 (前期)、組み立て有糸分裂紡錘体 (prometaphase) の微小管による自分の体に取得されたドライブの姉妹染色分け体のに向かって分割し、反対側のスピンドルに運ばれる極 (後期) とき偏析と等しい。2 つの娘細胞は、アクチンに基づく収縮環 (終期と細胞質分裂) の活動によって物理的に分かれています。動原体染色分け体のセントロメア領域で組み立てて特殊なタンパク質の構造は、紡錘体微小管の添付ファイルをサイトとして.その主な機能は、染色体キャプチャ、配置を駆動し、染色体分離³^,⁴の忠実性を維持するために紡錘アセンブリチェックポイントを仲介しながら、不適切なスピンドル微小管の添付ファイルを修正することを支援す....

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Protocol

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1. 二重チミジンブロックおよび解放: 試薬の準備

ダルベッコ修飾イーグル培地 (DMEM) 培 10 %fbs、ペニシリン、ストレプトマイシンと 500 mL を作る。
チミジンの 100 mM の在庫は、滅菌水と因数-80 ° C でストア

2 細胞分裂の進行 (図 1 a) の固定セルイメージ投射のためのプロトコル

日 1、⁵ HeLa 細胞の 10 倍 ~ 2 種 (70% エタノールと紫外線照射による殺菌) カバースリップと DMEM 培地 2 mL 6 ウェルプレートのウェルに。37 ° C、5% CO₂で 24 時間加湿のインキュベーターで細胞を成長します。
1^stチミジンブロック: 2 日目、徹底的に新鮮な DMEM メディア (100 mM 在庫、2 mM 最終濃度) のチミジンの必要量を混ぜます。
チミジンを含む 2 mL を追加メディア 6 ウェルの細胞をプレートし、18 時間孵化させなさい。
3 日目、培地を吸引し、2 mL の 1x PBS で 2 回細胞と新鮮な prewarmed DMEM; に一度洗う9 h ブロックから細胞を解放する新鮮な prewarmed DMEM 培地で細胞を....

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Results

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有糸分裂の進行と細胞内微小管の安定性に関する研究は二重チミジンブロックからリリース後固定
Cdt1 は G1 期に DNA の複製の起源のライセンスに関与しています。それは S 期は劣化が、G2/m 期で再蓄積します。有糸分裂におけるその役割を研究、内因性 Cdt1 を使用して最も適したセル同期方式の二重チミジンブロック¹⁵G/M 段階で具体的には枯渇する必要があります。細胞は、細胞は、S 相し、その時点でまた Cdt1 関数が必要です、G1 での複製の起源のライセンスが長い完了したとき 2^ndチミジンブロックからリリース後すぐに Sirna を導入させた。SiCdt1 トランスフェクションと二重チミジンブロックリリースの 9 時間後 Cdt1 の枯渇は、(図 1 b) に西部のしみが付くことによって検証されました。セル 9 h 二重チミジンブロックからリリースコントロールと Cdt1 si.......

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Discussion

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二重チミジン同期の最も重要な利点は、染色体の整列、バイポーラの解析もでき、一斉に有糸分裂を入力これらの細胞の多くは短時間の窓の分裂期細胞の増加し、サンプルサイズを提供すること主軸形成と染色体分配のエネルギー効率の向上。

多くの規定する蛋白質複合体とシグナル伝達経路有糸分裂を通して通常進行を確保するために専念しているし、このプロセスの規制緩和が腫瘍形成につながった可能性があります。安定 mCherry H2B と GFP チューブリンを表現し、ほとんど制御の細胞がくちばし (図 3 b) 後約 60 分以内で後期に染色体を分離する二重チミジンブロック番組からリリースされた HeLa 細胞の細胞イメージングを住んでいます。その一方で、Hec1 関数はほとんどの細胞が続く後期発症またはアポトーシス (図 3) ずれている染色体と長い間分裂期にとどまることを示しますと摂動された HeLa 細胞の細胞イメージングを住んでいます。

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Disclosures

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著者は、彼らが競合する財務持分を有してないことを宣言します。

Acknowledgements

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MCherry ヒストン H2B と GFP-α-チューブリンを安定発現 HeLa 細胞を共有するため東北大学の田中幸三に感謝しております。この作品は、DV (R00CA178188) に NCI の助成金、ノースウェスタン大学からスタートアップ資金にサポートされていました。

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	4°Cで保管。C
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	4°Cで保管。C・
リーボヴィッツs (1x) L-15 medium	Life Technologies	21083-027	4 °Cで保管。C
血清還元培地(Opti-MEM)	Life Technologies	319-85-070	4°Cで保管。C
ペニシリンおよびストレプトマイシン	Life Technologies	15070-063 (連鎖球菌ペン)	1:1,000 希釈
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	4 °C で保存;C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	無菌蒸留水に溶解
Cdt1 siRNA	Life Technologies		Ref 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		Ref 13
HeLa細胞 GFP-H2B
HeLa細胞 GFP-&α;-tubulinとmCherry H2B を発現	東北の田中耕三博士からの寛大な贈り物大学, 日本
ホルムアルデヒド溶液	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	毒性、要注意
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	毒性、要注意
Mouse anti-α-tubulin	Santa Cruz Biotechnology	Sc32293	1:1,000 希釈
Rabbit ant-Zwint1	Bethyl	A300-781A	1:400 希釈
マウス抗リン酸化-ガンマ;H2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, clone JBW301	1:300 dilution
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilution
Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 dilution
BioLite 6 well multidish	Thermo Fisher Scientific	130184
35 mm ガラス底皿	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
ニコンエクリプス TiE 倒立顕微鏡	ニコンインスツルメンツ
共焦点用スピニングディスク	横川	CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD カメラ	Andor	iXon Ultra EMCCD
4 波長レーザー	Agilent Technologies
顕微鏡用インキュベーションシステム	東海ヒット	TIZB
NIS-elementsソフトウェア	ニコンインスツルメンツ

するHeLa細胞

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
Puck, T. T., Steffen, J.

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有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた

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