このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた

13.9K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/56513

⸱

2017年12月5日

 , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

この記事について

サマリー

高分解能共焦点顕微鏡を用いた解析に続いて HeLa 細胞の二重チミジン同期するためのプロトコルを提案します。このメソッドは、多数の有糸分裂、また界面機能を有する多機能性蛋白質の細胞分裂の役割の解明を可能にする S 期から同期的に進めるセルを取得するキーです。

要約

位相依存的に細胞周期の様々 な規制のイベントの研究は、細胞増殖と分裂についての明確な理解を提供します。細胞周期の特定の段階のセル人口の同期は、このような実験的努力で非常に役に立つ発見されています。比較的より少なく有毒な化学薬品処理による細胞の同期は、結果として細胞周期イベントの選択した分裂段階の特定の濃縮を得ようと研究の薬理学的阻害薬の使用上有利なすることができます。ここで、セルのさまざまな段階で同期のひと細胞周期 S 期と M 段階二重チミジン ブロックの両方を含むと染色体の整列の有糸分裂蛋白質の機能を研究するための手順をリリース プロトコルを説明します。分離。このプロトコルは、確立された界面の機能を持つ多機能タンパク質の細胞分裂の役割を研究するため非常に便利になっています。私たちのケースでは Cdt1、レプリケーション元ライセンス G1 期での重要な蛋白質の細胞分裂の役割を効果的に学ぶことができます G2/M 固有 Cdt1 が枯渇することができる場合にのみ。二重チミジンの同期を使用して特定の G2/M Cdt1 の枯渇のための詳しいプロトコルについて述べる。また、セル固定のプロトコルを説明し、チミジン リリース後高分解能共焦点顕微鏡を用いた細胞イメージングを住んでいます。メソッドは Hec1、複雑な Ndc80 のコンポーネントのように生理と摂動条件下で細胞分裂蛋白質の機能を分析し固定と生きている細胞の分裂期の細胞の大規模なサンプル サイズを取得することができるため便利分析も紹介します。

概要

細胞周期細胞は彼らのゲノムと増殖の正確な重複規制の厳しいと一時的制御イベントのシリーズを受けます。哺乳類細胞周期の間期と M 期ので構成されます。中間期の 3 つの段階 - G1、S から成っている、セル G2 のゲノムを複製し、正常な細胞周期進行1,2のために必要な成長を経る。(前期 prometaphase、中期、後期、終期) 有糸分裂と細胞質分裂から成る M 相親細胞は遺伝的に同一の 2 つの娘細胞を生成します。続いて中期プレート (中期) の整列の有糸分裂、姉妹染色分け体重複ゲノムの凝縮 (前期)、組み立て有糸分裂紡錘体 (prometaphase) の微小管による自分の体に取得されたドライブの姉妹染色分け体のに向かって分割し、反対側のスピンドルに運ばれる極 (後期) とき偏析と等しい。2 つの娘細胞は、アクチンに基づく収縮環 (終期と細胞質分裂) の活動によって物理的に分かれています。動原体染色分け体のセントロメア領域で組み立てて特殊なタンパク質の構造は、紡錘体微小管の添付ファイルをサイトとして.その主な機能は、染色体キャプチャ、配置を駆動し、染色体分離3,4の忠実性を維持するために紡錘アセンブリ チェックポイントを仲介しながら、不適切なスピンドル微小管の添付ファイルを修正することを支援することです。

セル同期の手法は、細胞周期の進行に関与する分子と構造のイベントを理解するための理想的なツールとして機能します。このアプローチは、さまざまな種類の解析、遺伝子発現のプロファイリングを含む細胞の生化学的なプロセスの解析とタンパク質の細胞内局在性の検出の特定のフェーズでセル人口を豊かに使用されています。個々 の遺伝子産物の研究のみならず遺伝子式5、miRNA 発現パターン6のマイクロ アレイ解析を含む全体のゲノムの解析を伴うアプローチ同期の哺乳類細胞を使用できます。翻訳制御7、および蛋白質の変更8のプロテオーム解析。同期は、細胞周期の進行に及ぼす影響の遺伝子発現やタンパク質ノックダウンまたはノックアウト、または化学物質の研究にも使用できます。

細胞は、細胞周期の異なった段階で同期できます。物理的、化学的、広くセル同期に使用されます。セル同期の最も重要な基準は、同期する必要があります noncytotoxic と可逆であること。潜在的な不利な細胞結果の薬理学的エージェントによってセルを同期する、ため化学依存メソッドはキー細胞周期イベントの勉強のために有利にできます。たとえば、ヒドロキシウレア、amphidicolin、ミモシン、ロバスタチン、G1/S 期の細胞の同期に使用できるが、彼らを阻害する生化学的経路の効果のために彼らは細胞周期チェックポイント機構をアクティブにし、重要なを殺すセル9,10の割合です。その一方で、「チミジン ブロック」として知られている成長媒体にチミジンを追加して DNA 複製のフィードバック阻害は特定ポイント11,12,13で細胞周期を挙げることが出来る。セルは、ノコダゾールと RO 33069,14と扱うことによって G2/m 期で同期できます。微小管重合を防ぐノコダゾールが比較的高い細胞毒性です。また、ノコダゾール逮捕細胞分裂すべりによって中間期の早期に返すことができます。二重チミジン ブロック逮捕セル G1/S 段階およびブロックからの解放後、細胞はある G2 から、有糸分裂に同期的に続行します。細胞周期細胞チミジン ブロックから解放のための通常の進行は、セル固定またはライブ イメージングによる高分解能共焦点顕微鏡の下で観察できます。セルを入力し、二重チミジン ブロックからリリース後有糸分裂に進むときに具体的に、有糸分裂蛋白質の摂動の効果を学ぶことができます。Cdt1、多機能性蛋白質、DNA 複製が G1 期でライセンスを起源に関与する有糸分裂15の中にも動原体微小管の添付ファイル必要です。有糸分裂 Cdt1 の機能を研究、レプリケーション ライセンス G1 フェーズ G2/M フェーズのみで具体的にその枯渇に影響を与えて同時に一方で、枯渇の影響を回避する手法を採用する必要があります。ここでは、固定と生細胞イメージングによる蛋白質の細胞周期の異なった段階の間に複数の機能を実行するの分裂の役割を研究する二重チミジン ブロックに基づく詳細なプロトコルを提案する.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. 二重チミジン ブロックおよび解放: 試薬の準備

  1. ダルベッコ修飾イーグル培地 (DMEM) 培 10 %fbs、ペニシリン、ストレプトマイシンと 500 mL を作る。
  2. チミジンの 100 mM の在庫は、滅菌水と因数-80 ° C でストア

2 細胞分裂の進行 (図 1 a) の固定セルイメージ投射のためのプロトコル

  1. 日 1、5 HeLa 細胞の 10 倍 ~ 2 種 (70% エタノールと紫外線照射による殺菌) カバー スリップと DMEM 培地 2 mL 6 ウェル プレートのウェルに。37 ° C、5% CO2で 24 時間加湿のインキュベーターで細胞を成長します。
  2. 1stチミジン ブロック: 2 日目、徹底的に新鮮な DMEM メディア (100 mM 在庫、2 mM 最終濃度) のチミジンの必要量を混ぜます。
  3. チミジンを含む 2 mL を追加メディア 6 ウェルの細胞をプレートし、18 時間孵化させなさい。
  4. 3 日目、培地を吸引し、2 mL の 1x PBS で 2 回細胞と新鮮な prewarmed DMEM; に一度洗う9 h ブロックから細胞を解放する新鮮な prewarmed DMEM 培地で細胞を育ちます。
  5. 2ndチミジン ブロック: チミジンを含む 2 mL を再び追加メディア (最終濃度が 2 mM) 6 ウェル プレートの各ウェル内のセルにします。
  6. さらに 18 時間孵化させなさい。
  7. 4 日目、培地を吸引し、2 mL の 1x PBS で 2 回細胞と新鮮な prewarmed DMEM を洗ってください。
  8. 一緒にそれらをミックスし、室温 20 分間インキュベート希薄 Sirna (制御と Cdt1) と血清無料で 10 分間個別に培地にトランスフェクション試薬各トランスフェクションに使用する siRNA の最終濃度が 100 nM。チミジンから洗浄されたセルに反応混合物を追加します。
  9. インキュベート細胞ブロックから解放し、4% とカバー スリップ上のセルを修復する 9-10 h の 37 ° C で室温に 20 分間 PFA
    注意: PFA は有毒である、適切な保護具を着用します。
  10. Immunostain セル、常温の 10 分の 0.5% (v/v) 洗剤イオンと 5 分の 1 × PBS で 2 回細胞を洗浄後。
    1. 1% (w/v) で一次抗体 (マウス抗 α-チューブリン抗体希釈 1:1, 000、1: 400、1: 300 で希釈した抗リン ɣ H2AX マウスで希釈ウサギ抗 Zwint1 抗体) の 50 μ L とセルを扱う続く RT で 1 h の 1x PBS で 1 %bsa (w/v) で細胞をブロックします。37 oc 以上で 1 h の 1x PBS で BSA
    2. 1x PBS で細胞を 3 回洗浄した後室温 1 時間各カバー ガラス (アレクサ 488 と 1: 250 の 1% (w/v) BSA 1x PBS で希釈でローダミン レッド) 二次抗体の 50 μ L で細胞を治療します。
    3. 2 回各 5 分の 1 × PBS のセルを洗浄した後セル DAPI を扱う (0.1µg/mL の 1x PBS で) 右で 5 分間
    4. 2 回各 5 分の 1 × PBS のセルを洗浄した後クリア顕微鏡スライド上の適切なマウント メディアにセルに直面してカバー スリップを配置します。
  11. 60 X 100 X 1.4 NA 計画アポクロマート DIC 油浸対物レンズと immunostained タンパク質の細胞が必要なイメージの品質に応じて適切なカメラを装備して逆の高分解能共焦点顕微鏡にマウントされているイメージ。
  12. 顕微鏡用ソフトウェアを用いた 0.2 μ m 厚の z スタックが適切なは、室温で画像を取得します。

3. 細胞分裂の進行 (図 3 a) の生きているセルイメージ投射のためのプロトコル

  1. 1 日に 1.5 mL DMEM 培地で 35 mm ガラス底培養皿に mCherry H2B と GFP-α-チューブリン (少しセルの種類および蛋白質の表現に基づいて変数) を安定発現約 0.5-1 x 105 HeLa 細胞を播くし、加湿のそれらを育てる37 oC と 5% CO2で 24 h のためのインキュベーター。
  2. 1stチミジン ブロック: 2 日目、チミジンを含む 1.5 mL を加える料理 (100 mM チミジン、2 mM 最終濃度) のセルにメディア。
  3. 18 時間孵化させなさい。
  4. 3 日目、チミジンを含む培地を吸引し、2 mL の 1x PBS で 2 回と新鮮な prewarmed DMEM 三度、セルを洗浄します。
  5. 一緒にそれらをミックスし、室温 20 分間インキュベート希薄 Sirna (制御と Hec1) と 10 分ごとに個別に血清フリー培地でのトランスフェクション試薬各トランスフェクションに使用する siRNA の最終濃度が 100 nM。チミジンから洗浄されたセルに反応混合物を追加します。
  6. 1.5 mL 8 h ブロックから細胞を解放する新鮮な prewarmed DMEM 培地で細胞を成長します。
  7. 2ndチミジン ブロック: チミジンを含む 1.5 mL を追加料理のセルにメディア (2 mM 最終濃度)。
  8. さらに 18 時間孵化させなさい。
  9. 4 日目、培地を吸引し、2 mL の 1x PBS で 2 回と新鮮な prewarmed DMEM 三度、セルを洗浄します。細胞を成長し、新鮮な prewarmed ・ リーボヴィッツの (L-15) 媒体補われる 10 %fbs と 20 mM HEPES pH 7.0 8 h ブロックから細胞を解放します。
  10. 既にステージと実験の温度を安定させるためにイメージングを開始する前に少なくとも 30 分間点灯する高分解能共焦点顕微鏡で設定温度制御チャンバーに皿を置きます。
  11. セルが表示される、まで 60 × 対物と明るいフィールドにフォーカスし、手動で選択した領域に、ステージ上でふるいにかけます。
  12. 光とレーザー パワー/露出、画像集録パラメーターと選択の顕微鏡画像集録ソフトウェアを使用してテスト期間を設定します。GFP (488 励起; 385 nm 発光) と mCherry (561 nm 励起と 385 nm 発光) 画像を取得するためのフィルターを使用します。
  13. タイムラプスの実験を実行するには、別に 16 h までの期間にパルス送信される光と蛍光画像 10 分ごとを取得します。
  14. 12 1.0 μ m で区切られたソフトウェアを使用して二重チミジン ブロックからのリリース後 9 h z-飛行機の顕微鏡に適切なは、画像を取得します。
  15. 細胞分裂の進行を追跡画像を解析し、最終的にソース ソフトウェア フィジー/ImageJ で対応する映画を組み立てます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

有糸分裂の進行と細胞内微小管の安定性に関する研究は二重チミジン ブロックからリリース後固定
Cdt1 は G1 期に DNA の複製の起源のライセンスに関与しています。それは S 期は劣化が、G2/m 期で再蓄積します。有糸分裂におけるその役割を研究、内因性 Cdt1 を使用して最も適したセル同期方式の二重チミジン ブロック15G/M 段階で具体的には枯渇する必要があります。細胞は、細胞は、S 相し、その時点でまた Cdt1 関数が必要です、G1 での複製の起源のライセンスが長い完了したとき 2ndチミジン ブロックからリリース後すぐに Sirna を導入させた。SiCdt1 トランスフェクションと二重チミジン ブロック リリースの 9 時間後 Cdt1 の枯渇は、(図 1 b) に西部のしみが付くことによって検証されました。セル 9 h 二重チミジン ブロックからリリース コントロールと Cdt1 si...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

二重チミジン同期の最も重要な利点は、染色体の整列、バイポーラの解析もでき、一斉に有糸分裂を入力これらの細胞の多くは短時間の窓の分裂期細胞の増加し、サンプル サイズを提供すること主軸形成と染色体分配のエネルギー効率の向上。

多くの規定する蛋白質複合体とシグナル伝達経路有糸分裂を通して通常進行を確保するために専念しているし、このプロセスの規制緩和が腫瘍形成につながった可能性があります。安定 mCherry H2B と GFP チューブリンを表現し、ほとんど制御の細胞がくちばし (図 3 b) 後約 60 分以内で後期に染色体を分離する二重チミジン ブロック番組からリリースされた HeLa 細胞の細胞イメージングを住んでいます。その一方で、Hec1 関数はほとんどの細胞が続く後期発症またはアポトーシス (図 3) ずれている染色体と長い間分裂期にとどまることを示しますと摂動された HeLa 細胞の細胞イメージングを住んでいます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は、彼らが競合する財務持分を有してないことを宣言します。

謝辞

MCherry ヒストン H2B と GFP-α-チューブリンを安定発現 HeLa 細胞を共有するため東北大学の田中幸三に感謝しております。この作品は、DV (R00CA178188) に NCI の助成金、ノースウェスタン大学からスタートアップ資金にサポートされていました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEM (1x)Life Technologies11965-0924°Cで保管。C
DPBS (1x)Life Technologies14190-1444°Cで保管。C・
リーボヴィッツs (1x) L-15 mediumLife Technologies21083-0274 °Cで保管。C
血清還元培地(Opti-MEM)Life Technologies319-85-0704°Cで保管。C
ペニシリンおよびストレプトマイシンLife Technologies15070-063 (連鎖球菌ペン)1:1,000 希釈
Dharmafect2GE DharmaconT-2002-024 °C で保存;C
ThymidineMP Biomedicals LLC103056無菌蒸留水に溶解
Cdt1 siRNALife TechnologiesRef 10
Hec1 siRNALife TechnologiesRef 13
HeLa細胞 GFP-H2B
HeLa細胞 GFP-&α;-tubulinとmCherry H2B を発現東北の田中耕三博士からの寛大な贈り物大学, 日本
ホルムアルデヒド溶液Sigma-Aldrich CorporationF8775毒性、要注意
DAPISigma-Aldrich CorporationD9542毒性、要注意
Mouse anti-α-tubulinSanta Cruz BiotechnologySc322931:1,000 希釈
Rabbit ant-Zwint1BethylA300-781A1:400 希釈
マウス抗リン酸化-ガンマ;H2AX (Ser139)Upstate Biotechnology05-626, clone JBW3011:300 dilution
Alexa 488Jackson ImmunoResearch1:250 dilution
Rodamine Red-XJackson ImmunoResearch1:250 dilution
BioLite 6 well multidishThermo Fisher Scientific130184
35 mm ガラス底皿MatTek CorporationP35GCOL-1.5-14-C
ニコン エクリプス TiE 倒立顕微鏡ニコンインスツルメンツ
共焦点用スピニングディスク横川CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD カメラAndoriXon Ultra EMCCD
4 波長レーザーAgilent Technologies
顕微鏡用インキュベーションシステム東海ヒットTIZB
NIS-elementsソフトウェアニコンインスツルメンツ
するHeLa細胞

参考文献

  1. Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
  2. Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
  3. Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
  4. Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5(2017).
  5. Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
  6. Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
  7. Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
  8. Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
  9. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
  10. Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
  11. Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
  12. Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
  13. Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
  14. Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
  15. Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
  16. Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
  17. Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
  18. Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
  19. Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819(2017).
  20. Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
  21. Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

Cdt1 Hec1
有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。