サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

サマリー

簡単で迅速なサルモネラの分離法をご紹介-ビオチンとストレプトアビジン菌をコーティングすることによりマクロファージからファゴゾームを含みます。

要約

サルモネラは、人間の胃腸炎を引き起こす通性細胞内細菌です。粘膜、S.の侵略の後ネズミチフス菌迅速検出し貧するの大食細胞によって、低下するためファゴゾームと呼ばれる小胞に含まれています。Sの分離ネズミチフス菌-含むファゴゾームは、広く研究に使用されているどのようにs.感染症は、細菌の劣化を防ぐためファゴソーム成熟のプロセスを変更します。細菌を含む分離従来、ファゴゾーム ショ糖勾配遠心法によって実行されました。ただし、このプロセスは時間がかかり、専用の装置とある程度の器用さが必要です。Sの分離の簡単かつ迅速な方法は、ここで説明しました。ネズミチフス菌-ビオチン-ストレプトアビジン共役磁気ビーズの細菌をコーティングすることによりマクロファージからファゴゾームを含みます。分離ファゴゾーム アッセイ、脂質、代謝、タンパク質解析などの広い範囲のための利用可能の選択の任意のバッファーで本法で得られたファゴゾームを中断できます。要約すると、このSの分離法ネズミチフス菌の特定、効率的、迅速なファゴゾームを含む最低限の機器を必要とする、古典的なショ糖勾配超遠心分離法よりも汎用性が。

概要

マクロファージ循環専門の貪食細胞検出、巻き込む、および任意の異物侵入の細菌など微生物細胞のアポトーシスに至る末梢の組織内に存在の低下しています。一般微生物 (病原体関連分子パターンまたは PAMPs として知られている) の表面に存在する病原体特定マーカーの表面受容体を介した認識時にマクロファージを開始の細胞膜における複雑な再編囲むと病原体¹を phagocytize の順。

包まれて病原体、ファゴソームと呼ばれる細胞内小胞のマクロファージによって含まれています。エンドソーム、リソソームなど他の小胞の分裂と融合の一連、病原体を含むファゴソームは組の phagosomal コンテンツの除去に必要な蛋白質を取得します。したがって、ファゴソームの酵素の組成は、ファゴソーム成熟²として知られているこのプロセスの過程で非常に可変です。

直後に貪食、エンドソーム³融解によるファゴソーム膜を組み込む複雑な空胞 ATPase (V-atpase) ポリコームタンパク。この複合体は、ファゴソーム⁴ルーメンに細胞質からポンプのプロトンに ATP を利用しています。ファゴソームの酸性化は、⁵その他の小胞の融合イベントおよび pH 依存分解酵素⁶の偉大な数の活性化が不可欠です。別ポリコームタンパク酵素複合体ファゴソーム膜上に組み立てはすぐに NADPH オキシダーゼ (NOX) 複合体であります。複雑な NOX は、ファゴソームの内腔に分泌して包まれて微生物⁷の殺害に大幅に貢献する活性酸素種 (ROS) を生成するために NADPH を酸化させます。

成熟の最初の手順では、ファゴゾームは通常 Rab5 など v ATPase⁸V₀サブユニットと共にそれぞれの初期と後期エンドソームの Rab7 マーカーを提示します。リソソームと後期エンドソーム ファゴゾームの融合貧するの病原体のさまざまな加水分解酵素カテプシン プロテアーゼ、リパーゼ、β-ガラクトシダーゼ⁹などへの暴露で起因します。内腔の酸性化もこれらの酵素の活性化のために必要です。たとえば、アクティブな短いフォームを生成するカテプシン D の胸の谷間は pH 依存性¹⁰です。これらの酵素は、病原体が低下してマクロファージ主要組織適合遺伝子複雑な (MHC) クラス II 分子¹¹適応免疫応答をトリガーする T 細胞に提示された病原体由来のペプチドの生産を仲介します。

したがって、ファゴソーム成熟は生得の免疫反応のため非常に重要ですし、自然免疫と適応免疫システムの腕をリンクします。病原体はファゴソーム成熟の上記プロセスを介してマクロファージによって除去を克服する戦略を進化している驚きではないです。たとえば、細胞内細菌結核菌、レジオネラ ・ ニューモフィラ防止抑制 V-atpase アセンブリとそれに伴う内腔の酸性化^{12,13 によるファゴソーム成熟}.リステリア菌や赤痢菌など他の細菌は、細胞質^14,15に脱出するファゴソーム膜の細孔形成を誘発します。その一方で、サルモネラ血清型ネズミチフス菌(S。ネズミチフス菌)そのレプリケーション¹⁶の適切な場所に変換する液胞内ファゴソームのプロパティを変更することです。この機能によって、 s.ネズミチフス菌ファゴソーム成熟の病原体を介した干渉を研究する非常に興味深いモデル。

ネズミチフス菌は通性細胞内細菌人間の胃腸炎を引き起こすです。粘膜、 s.の侵略の後ネズミチフス菌迅速検出し貧するの大食細胞によっておよびファゴゾーム¹⁷の内で含まれています。いくつかのレポートはそのs.を前述しました。ネズミチフス菌-エンドソーム、リソソームは¹⁸メーカーで示し、他の研究は、米に防いだファゴソームとリソソームの融合を発見した含んでいる phagosomeネズミチフス菌感染症¹⁹。

S.によって最初に、ファゴソーム成熟蛍光顕微鏡による感染症について調べた。細菌を含む分離技術の開発ファゴゾームはエンドソームやライソソーム マーカー ファゴソーム内容のより正確な研究を有効にします。までに、主要な細菌を含む分離使用方法ファゴゾームはショ糖ステップ グラデーション^18,20細胞レベル下の分別。ただし、このメソッドは、ファゴゾームに機械的な損傷を引き起こす可能性が、phagosomal コンポーネント (蛋白質・脂質) の安定性に影響を与えることができます、時間がかかる複数の遠心分離手順を必要です。また、それは、超遠心機の使用を必要です: は、アクセスできないすべての研究室の専門機器の一部。

最近では、新しいアプローチは、細菌を含む分離に適用されている phagosome、ビオチン化 lipopetide (Lipobiotin) と後に細菌性病原体は、ラベル付けは、ストレプトアビジン共役磁気ビーズ^{21 を使用して抽出}.磁気ビーズのストレプトアビジン共役続いて NHS ビオチンと細菌表面アミン含有高分子の分類によって相補的な方法を提案します。本法で得られたファゴゾーム エンドソームやライソソーム マーカーで濃縮され非常とアッセイ、オミックス解析タンパク質解析からの広い範囲に使用できます。さらに、ultracentrifuges などの特殊な機器は不要です。また、遠心分離手順を排除し、ファゴゾームに機械的な損傷や採用時の量が大幅に削減します。このメソッドは、グラム陽性球菌、この原稿にも含まれているなど、他の細菌を含むファゴゾームの隔離のために簡単に対応できます。要約すると、このSの分離法ネズミチフス菌-ファゴゾームを含む、シンプルでコスト効率の高い、ショ糖で古典的な分離より時間もかかります以下勾配遠心、高度のレンダリング濃縮細菌含むファゴゾーム。

プロトコル

病原性 s. の使用を含むすべての手順ネズミチフス菌 は、BSL 2 またはより高い生物学的セキュリティ レベルの施設で実施する必要があります。文化と S のコーティングネズミチフス菌として骨髄由来マクロファージ (BMDMs) の感染は、汚染を防ぐための層流フードの下で行う必要があります。S の分離ネズミチフス菌-ファゴゾームを含む任意 BSL 2 実験室ベンチで実行できます

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骨髄のマクロファージへの分化のマウスからの抽出され動物の福祉制度のガイドラインに沿って行われ、自然、ノルトライン = ヴェストファーレン州の機関によって承認されました。環境および消費者保護 [Landesamt für Natur、環ならびにノードラインヴェストファーレン州 Verbraucherschutz (LANUV);ファイル: 84 02.05.40.14.082、84 02.04.2015.A443] とケルン大学

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1 養殖 s

1. Inoculate s.。ネズミチフス菌(SL1344 株) 細菌のループを使ってブレインハートインフュー ジョン (BHI) 5 mL に単一の細菌のコロニーから
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2. 揺れで一晩 37 ° c の定温器の細菌懸濁液をインキュベートします
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3. 次の日に 19 mL 三角フラスコに BHI ブイヨンの細菌懸濁液の 1 mL に転送し、, 振動インキュベーターで 37 ° C で
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4. 監視 s.600 の光学濃度 (OD) を測定することによって成長を ネズミチフス菌 nm (外径 ₆₀₀) 分光光度計。測定すべき約 30 分ごとに
5. とき外径 ₆₀₀ 1.0 に達する、インキュベーターと 50 mL のチューブに転送から細菌懸濁液を取り外します。4 細菌 15 分 5,400 × g で遠心分離機 ° C
6. 上清を除去し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 10 mL で再懸濁します
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7. 4 ° C で 15 分間 5,400 × g で遠心します。
8. 上澄みを除去し、4.9 mL の滅菌 PBS 中の細菌を再懸濁します
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2。NHS ビオチン/ストレプトアビジン化磁気ビーズの サルモネラ のコーティング

ソリューション (NHS ビオチンはジメチルスルホキシド、DMSO に溶解) 細菌懸濁液に作りたてのリンク

1. 10 mg/mL の追加の 100 μ L ビオチン前の手順で準備します。たとえば、滅菌 DMSO 0.5 mL に NHS ビオチン 5 mg を希釈します。上下に数回ピペッティングにより正しくミックス
。
2. 5 1.5 mL チューブにミックスを分割します
。
3. 350 rpm で一定の揺れで、サーモに室温 (RT) で 2 時間加温します
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4. RT で 10 分間 15,000 × g でチューブを遠心し、上澄みを廃棄します
。
5. 1 mL の滅菌 PBS、15,000 × g で RT で 10 分間遠心で再懸濁します、上澄みを廃棄します
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6. 余分なビオチン ソリューションのリンクを完全に削除する手順 2.5 を 2 回繰り返します
。
7. 最後の洗浄後に、1 mL の滅菌 PBS でペレットを再懸濁します
。
8. 1.5 mL チューブに 10 mg/mL 磁気ビーズのストレプトアビジン共役溶液 100 μ L を転送し 5 分間磁気ラックにそれを残す
9. ピペットで溶媒を除去、磁気ラックからストレプトアビジン - 共役磁気ビーズ ソリューションを取るし、2.7 準備したビオチン コーティング細菌懸濁液の 1 mL でそれを再懸濁します
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10. 350 rpm で一定の揺れで、サーモに RT で 1 時間加温します
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11. 磁気ラック ソリューションを配置; 5 分待つし、ピペットと壁に付着した細菌を削除 (レッテルをチューブでそれを保つ " 非コーティング細菌 ")。マグネットに接触して管の壁に付着した分数はビオチン/ストレプトアビジン コーティング細菌
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12. 磁気ラックからラベル付きの細菌を含むチューブを削除し、1 mL の滅菌 PBS に再懸濁します
。
13. 磁気のラックに再びそれを置き、5 分待つし、ピペットを使用して PBS を削除します
。
14. ストレプトアビジン共役磁気ビーズでコーティングされていないすべての細菌を除去する手順 2.13 と 2.14 2 回以上を繰り返します
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15. 最後の洗浄後、コーティング細菌を 500 μ L の滅菌 PBS に再懸濁し、ラベルとして管 " 菌をコーティング ".
16. カウント コロニー形成単位 (cfu) 両方の " 非コーティング細菌 " と " 菌をコーティング " BHI 寒天培地プレート上のシリアル希薄をめっきによってソリューション。約 2 × 10 ⁸ cfu/mL のコーティングされた細菌は、外径 ₆₀₀ 1.0 の初期の細菌懸濁液 20 mL から取得されます。マクロファージに感染する次の日に使用する 4 ° C でコーティングした細菌懸濁液を維持します
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3。BDMDs の感染

1. ビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズの細菌のコーティングと同じ日にプレート完全に差別化された BMDMs ²² 皿あたり 5 x 10 の ⁶ セルの密度で 6 cm 料理
。
2. 次の日 4時 5 分 15,000 × g でコーティングされた細菌懸濁液を遠心分離機 ° C
3. 上澄みを除去し、10 x 10 ⁶ cfu/mL の濃度 10% 牛胎児血清 (FBS) ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 培で再懸濁します
。 10、感染 (MOI) の多様性でマクロファージに感染する
4. は、BMDMs からメディアを取り出して、準備コーティング細菌懸濁液 5 mL を加えます。すべてのセル型や分離のファゴゾームの実験目的のため最適な MOI の評価がある
。
5. 貪食を同期する 10 分間常温加温します
。
6. 貪食を開始する 30 分間 5% CO ₂ インキュベーターで 37 ° C に加温します。他のセルタイプが細菌の内面化を確保するため異なるインキュベーション時間を必要があります
。
7. 料理から細菌を含む培地を外し、非内面の細菌を除去する RPMI でセルを 3 回洗浄します
。
8. 任意の非貧する細菌を殺すために 10 %fbs および 50 μ G/ml のゲンタマイシンを含む RPMI の 10 mL を最後に追加します
。
9. では、目的の時点までの 5% CO ₂ と 37 ° C で感染した BMDMs 孵化させなさい。目的の時点は、分析の目的と使用する携帯型細菌によると実験的に決定する必要があります。S の初期エンドソーム-ファゴソーム融合事象の研究ネズミチフス菌感染 BMDMs 30 分インキュベーションをお勧めします。後の事象の分析、2 時間または 4 時間後ファゴゾームを抽出できます。S と大食細胞の長期培養24 時間を超えてネズミチフス菌はマクロファージの死の結果します。ファゴソーム抽出可能性がありますおそらくビオチン分子の劣化につながる前に細胞内感染症を拡張します。ただし、24 時間まで見られなかったコーティング細菌でビオチンの損失

4。S の分離ネズミチフス菌-ファゴゾームを含む

1. 準備必要ファゴソームのボリューム分離バッファー (50 mM 管、50 ミリメートル MgCl ₂, 5 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 pH.7) ジチオトレイトール (DTT) を最終濃度 1 mM、サイトカラシン B 決勝に追加することによって10 μ M、プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤の製造元の推奨どおり濃度
   。 注: DTT、サイトカラシン B を加えなければなりませんファゴソーム分離バッファー A に常に直前に使用します。サイトカラシン B 破壊細胞骨格、細胞膜の破壊を促進する
。
2. 希望の時間にポイントし、感染細胞からメディアを取り出して、右に温めた滅菌 PBS で洗浄
3. Phagosom の追加 750 μ Le 分離は一皿 A バッファーに格納し、氷の上の 20 分を孵化させなさい。分離バッファー A のボリュームを比例して調整する必要があります別のセル番号を使用するときです
。
4. (50 mM のパイプ、pH.7、50 mM MgCl ₂、グリコールエーテルジアミン四酢酸 5 mM、220 mM、マンニトールと 68 mM ショ糖) ファゴソーム分離バッファー B の追加 250 μ L。ロック プレート皿の完全な表面をバッファーに届くように。分離バッファー B のボリュームを比例して調整必要があります別のセル番号を使用している場合
。
5. そっとゴム警官を使用して削ってお皿からセルを削除し、中古冷蔵 1.5 mL チューブに転送します
。
6. は、26 G 針、少なくとも 15 回 1 mL 注射器を使用して (1 つの吸引プラス 1 回の細胞懸濁液の数の 1 つ放出) を細胞懸濁液を通過します。これは BMDMs のゾル性細胞質のコンテンツをリリースするのに十分です。針通過の数は、細胞の種類ごとに最適化する必要が
。
7. 磁気ラックに細胞懸濁液、5 分を待ちます。磁石に粒子がコーティング-s. を含むファゴゾームです。ネズミチフス菌。懸濁液には細胞成分の残りの部分が含まれています
。
8. というレッテルを 1.5 mL チューブに懸濁液を転送 " 細胞質 ".
9. 磁気ラックから隔離されたファゴゾームとチューブを削除し、それらを 1 mL の滅菌 PBS に再懸濁します
。
10. 磁気ラックにファゴソーム サスペンションを置き、5 分待つし、PBS を削除します
。
11. 4.9 と 4.10 分離 米 を洗う手順を繰り返ネズミチフス菌-ファゴゾームを含むします
。
12. は最後に PBS を削除し、必要なバッファー; たとえば、タンパク質解析のための radioimmunoprecipitation 検定法 (RIPA) バッファー、ファゴゾームを再懸濁します。細胞の初期量と感染の慣性モーメントによって、このプロトコルを次のサンプルあたり約 50-200 μ g のタンパク質を取得します
。

結果

細菌を含む分離このプロトコルによってファゴゾーム細菌の最初のステップとしてビオチン化が必要です。我々 したがって、 s.の有効性を評価ビオチン標識に感染した BMDMs の共焦点顕微鏡解析によるネズミチフス菌ビオチン化 mCherry-S。ネズミチフス菌Cy5 ストレプトアビジンが付いた。簡単に、BMDMs は、mCherry-Sとこのプロトコルで説明されているように感染していた。ネズミチフス菌ビオチン標識したストレプトアビジン共役磁気ビーズをインキュベートないが。37 ° C で 30 分後、セルは温かみのある PBS で洗浄され右固定で 20 分に立寄られた PBS で広範な洗浄の 4% のホルムアルデヒドで固定します。セルが、グリセリン RT。 感染した BMDMs で 5 分間 PBS でトリトン次いで, Cy5 ストレプトアビジン 4 ° C で 20 分間 3%広範な洗浄後共焦点顕微鏡 (図 1...

ディスカッション

新しいSの分離法ネズミチフス菌-ここで説明はファゴゾームを含むビオチンとストレプトアビジン共役磁気ビーズ細菌をコーティングします。細胞膜の穏やかな中断の後、磁気ラックを使用して細菌を含むファゴゾームできます簡単に抽出しました。示す細菌の炎症を誘発する病原体の能力を維持宿主細胞の貪食のプロパティは変更されません。このメソッドによって得られるファゴゾームが細菌やエンドソーム/リソソームで濃縮され重要なは、マーカーとゾル性細胞質汚染を欠いています。

このメソッドは、ショ糖勾配分離を採用しています伝統的なファゴソーム分離方法に比べていくつかの利点を示します。それは複数の遠心分離手順、研究者より少ない時間でより多くのサンプルを処理し、洗浄手順の数を簡単に増やすことによって純粋ファゴソーム サンプルを取得時間がかかる排除します。このプロトコルの使用には、超遠心法など、専門的かつ敏感な機器の必要があります。高速遠心分離が小胞の特性を変更でき、このプロトコルで回避は最終的な収量²²に、削減します。我々 が実証も

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
EZ-Link NHS ビオチン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	20217
FluidMag ストレプトアビジン	ケミセル	4205
PIPES	カールロス	9156.2
MgCl2	カールロス	A537.4
EGTA	カールロス	3054.3
ショ糖	カールロス	4621.1
マンニトール	カールロス	4175.1
DTT	シグマ	43816
停止プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	1861280
サイトカラシン B	シグマ	C6762
DYNAL または DynaMag マグネット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12321D
SmartSpec 3000分光光度計	Bio-Rad	170-2501
バクテリアループ (10µl)	Sarstedt	86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344	ライプニッツ研究所 DSMZ-ドイツの微生物と細胞培養
RPMI	Biochrom	FG1415
PBS	Biochrom	L1825
Cy5-ストレプトアビジン	Invitrogen	SA1011
抗β-アクチン抗体	サンタクルス	バイオテクノロジーsc-47778
抗mCherry抗体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PA5-34974
抗Rab5抗体	サンタクルーズ	バイオテクノロジーsc-46692
Rab7抗体	クルーズ	バイオテクノロジーsc-10764
v-ATPase(V0)抗体	サンタクルーズ	バイオテクノロジーsc-28801
抗v-ATPアーゼ(V1)抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-20943
抗カテプシンD抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-6486
anti-Tomm20抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-17764
抗カルネキシン抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-46669
抗GAPDH抗体	Santa Cruz Biotechnology	SC-20357