方法論記事

単球と細胞外マトリックスの主要な乳癌細胞間コミュニケーションを分析抽出 (ECME)-ベースの三次元システム

DOI：

10.3791/56589

⸱

2018年1月8日

 ,  , 
1Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez, 2Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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ここでは、乳癌、がん細胞同様単球とコラーゲン分解、免疫細胞の動員、セルなど成果の直接的/間接的相互作用の研究としての形態を分析する三次元培養法について述べる侵略、および炎症の癌関連のプロモーション。

要約

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細胞外マトリックス (ECM) に埋め込まれている正常および腫瘍性上皮細胞は密接に従って大きく正常組織の恒常性と病気の結果に影響を及ぼす造血および非造血細胞と通信します。乳がん、腫瘍関連マクロファージ (Tam)、病気の進行、転移, 再発形式に重要な役割を果たすしたがって、単球より腫瘍微小環境と腫瘍細胞との相互作用のメカニズムを理解することは、病気をコントロールすることが重要です。ここでは、我々 はひと乳癌 (BrC) 細胞およびひと単球の三次元 (3 D) 共培養システムの詳細な説明を提供します。BrC 細胞生産規制活性化の高い基底レベル、通常 T 細胞表現 (RANTES) を分泌、単球走化性因子蛋白質 1 (MCP-1)、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (G-CSF)、単球との共培養中炎症性サイトカイン インターロイキン (IL)-1 β (il-1) 及び il-8 はマトリックスメタロプロテアーゼ (MMP)-1、MMP 2、MMP 10 と濃縮しました。この腫瘍間質の微小環境推進アノイーキス mcf-10 a 3 D 腺様構造、単球のより、積極的な BrC 細胞の侵入への抵抗です。ここに示すプロトコル内腫瘍通信を勉強する経済的な代替手段を提供、腫瘍に関連する腫瘍生物学の特定の機能を問い合わせるに 3 D の細胞の in vitroシステムを提供する大きな可能性の例侵略。

概要

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腫瘍生物学は以前考えられていたよりもはるかに複雑です。がん細胞が、単なる一括制御不能な増殖細胞のより多くを示しています証拠むしろ、異なる腫瘍細胞は高い組織と腫瘍1内の階層を表示するさまざまな機能を実行するようです。腫瘍細胞は、細胞の非変形と親密なコミュニケーションも: マクロファージ、線維芽細胞、リンパ球、脂肪細胞、血管内皮細胞は、他のセルの間ですべての没頭している足場蛋白質および ECM を構成する多糖類。多数の直接的および間接的な相互作用は、トランス フォームおよび非変形細胞と疾患の結果2,3以上の強力な影響力を発揮する ECM に確立されます。BrC の特定のケースでは、Tam、4, 再発・転移のリスクを増加させる, 腫瘍の進化に重要な役割を果たすため、Tam が発見されていることを考慮した BrC 細胞のコミュニケーションを分析するが特に重要です。 ,5。

内腫瘍の相互作用とその結果を分析する、新しい 3 Dの in vitroアプローチがはるかに複雑な微小環境を提供する ECM エキスの使用に基づいて開発されているとの比較で、腫瘍生物学の現実に近い従来の単層培養細胞が増....

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プロトコル

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BrC 患者から採取した Unidad de 危惧 en Virología y ある病院 Infantil ・ デ ・ メヒコ フェデリコ ・ ゴメスの組織バンクから。本研究は、科学によって承認された、倫理的なおよびバイオ セキュリティ レビュー病院 Infantil ・ デ ・ メヒコ フェデリコ ・ ゴメスのボード: Comité デ危惧、Comité ・ デ ・ Ética en 危惧、Comité ・ デ ・ Bioseguridad。すべての患者が前向きに在籍していた、研究の性質について知らされた: 参加希望者は検体採取前に書面によるインフォームド コンセントを署名し、倫理的なガイドラインとの臨床ベストプラクティスに従って扱われました。機関。参加者の身元は調査の持続期間のため匿名だった。患者は、浸潤性膵癌、組織学的グレード 2 および組織切除前にない前のネオアジュ バント療法と臨床病期 II と診断されました。患者がすべての女性高齢者平均 56.8 歳 (42 に 75 の範囲)14。

1 3次元細胞培養

  1. シード 0.1 × 106 mcf-10 a セルまたは 5% 添加 DMEM/F12 培養液中の 25 cm2培養フラスコで一次の BrC 細胞馬血清、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、100 ng/mL コレラ....

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結果

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BrC 細胞三次元培養における形態素解析:

低・高密度 3 D 文化で育つ主の BrC 細胞の形態を 5 日間にわたって調べた。最初の 48 時間の間に、細胞は、ECME に準拠し、低密度を維持します。この時点でそれが明らかに高く評価される細胞がいくつかの 2 つ以上の長い細胞質突起を有すると明らかな細胞間の接触を示すことがなくスピンドル状の細長い形を提示します。5 日間培養後の細胞は彼らの初期の形態を維持しながら増殖。また、彼らは特定の構造組織がなければネットに似た構造を形成、ない接触阻害と積み重ねを表示されます。腺房に似た球状の構造を形作る、未変換 mcf-10 a 細胞との比較が行われました。これらの細胞は、(約 50 μ m) の均一なサイズの丸いよく区切りおよび組織構造の特徴的な形態を表示します。逆に、一次 BrC 細胞共有よく似て積極的 BrC 細胞 MDA-MB-231 (

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ディスカッション

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上皮細胞 3 D 空間構造の成長し、ECM 蛋白質との相互作用は組織の恒常性のため極めて重要です。細胞膜 (2 D) の成長の多くのがん研究に基づいているし、単分子膜が ECM に課す、細胞の特性を要約しない彼らは腫瘍の形成および進行の多くの側面を理解する重要なされているが、インスタンス:増殖、接着依存性細胞の生存、頂基底極性、ECM を改造、細胞分化などを制限します。重要なは、だけでなく、腫瘍細胞と ECM 間の相互作用は癌の進行に欠かせない、腫瘍と非腫瘍性細胞などの免疫細胞の間の通信の確立も。ここで提供されるプロトコル環境内でがん細胞と免疫細胞間の相互作用の理解の促進、ECM によって炎症性応答はこれらの相互作用によって促進される、この炎症性条件を作成する方法、肯定的なループより単球とがん細胞のより多くの侵略を育成します。

ECME を使用しての大きな利点は、様々 な実験的 3 D を実行する適切な生物学的足場モデル22を提供することです。それは、ラミニン、コラーゲン IV、entactin、ヘパラン硫酸プロテオ.......

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開示事項

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著者は、利害の衝突をしていない宣言します。

謝辞

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この作品は、CONACyT FONSEC SSA、IMSS、ISSSTE プロジェクト号 233061 エセキエル ・ m ・ フエンテス-Pananá、フォンド ・ デ ・ Apoyo 危惧、病院 Infantil ・ デ ・ メヒコ フェデリコ ・ ゴメス (プロジェクト番号 HIM-2014-053) アラカルトにサポートされていました。・ エスピノーザ サンチェス NA は、プログラム ・ デ ・ Doctorado en 芸術 Biomédicas、大学国立自治・ デ ・ メヒコ (UNAM) と CONACYT から受信した交わり 231663 から博士課程の学生です。E S NA、また社会保障 (IMSS) のメキシコ協会によって提供される財政支援を認めます。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
U937アメリカンタイプカルチャーコレクション ATCC CRL-1593.2単球性細胞株/組織球性リンパ腫 
THP-1アメリカンタイプカルチャーコレクション ATCC TIB-202単球性細胞株/急性単球性白血病 
MCF-10Aアメリカンタイプカルチャーコレクション ATCC CRL-10317非形質転換乳房細胞株
MCF-7American Type Culture Collection ATCC HTB-22乳がん細胞株
T47DAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-133乳がん細胞株
HS578TAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-126乳がん細胞株
MDA-MB-231American Type Culture Collection ATCC HTB-26乳がん細胞株
RPMI 1640 培地GIBCO BRL Life Technologies11875-093
DMEM 高グルコース GIBCO BRL Life Technologies11964-0924.5 g/L グルコース
DMEM/F12GIBCO BRL Life Technologies11039-021
抗生物質/抗真菌薬GIBCO BRL Life Technologies15240-062100 U/mL ペニシリン、100 & micro;g / mLストレプトマイシン、および0.25 µg/mL Fungizone
ウシ胎児血清GIBCO BRL Life Technologies16000-044
馬血清 GIBCO BRL Life Technologies16050114
0.05% トリプシン-EDTA 1XGIBCO BRL Life Technologies25300-062
PBS 1X (リン酸緩衝生理食塩水GIBCO BRL Life Technologies20012-027
上皮成長因子 (EGF)PeproTechAF-100-15 (1.00mg)
インスリンSIGMA-ALDRICHI1882-100MG
ヒドロコルチゾンSIGMA-ALDRICHH088-5G
コレラ毒素 ビブリオ・コレラSIGMA-ALDRICHC8052-1MG
マトリゲル Corning Inc356237Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫、細胞外マトリックス抽出物、-20°Cで保存。Cは4°で使用するまで。C
GM-CSFPeproTech300-03
MCP-1PeproTech300-04
RANTESPeproTech300-06
IL-8PeproTech200-08
IL-1βPeproTech200-01B
クリスタルバイオレットハイセル México541
パラホルムアルデヒドSIGMA-ALDRICHP6148
トランズウェル透過性サポート (インサート)Corning Inc3422直径 6.5 mm、8 & マイクロ;m細孔径/24ウェルプレート 
トランズウェル透過性サポート(インサート)Thermofisher Scientific1406206.5 mm直径、0.4 & マイクロ;m細孔径/24ウェルプレート 
単球単離キットIIヒト Miltenyi Biotec130-091-153
LSカラムMiltenyi Biotec130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate AssayEMD MilliporeHCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation)Luminex Corporation40-072
Lab-Tek チャンバースライド カバー付き (8まあ)ナルゲ・ヌンク・インターナショナル177402
ガラス底マイクロウェル 35mmペトリ ディッシュMatTek Corp.P35G-1.5-14-C

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), Suppl 1 2-7 (2016).
  2. Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
  3. Quail, D. F., Joy....

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タグ

3D ECM

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