方法論記事

単球と細胞外マトリックスの主要な乳癌細胞間コミュニケーションを分析抽出 (ECME)-ベースの三次元システム

DOI：

10.3791/56589

⸱

2018年1月8日

 ,  , 
1Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez, 2Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、乳癌、がん細胞同様単球とコラーゲン分解、免疫細胞の動員、セルなど成果の直接的/間接的相互作用の研究としての形態を分析する三次元培養法について述べる侵略、および炎症の癌関連のプロモーション。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞外マトリックス (ECM) に埋め込まれている正常および腫瘍性上皮細胞は密接に従って大きく正常組織の恒常性と病気の結果に影響を及ぼす造血および非造血細胞と通信します。乳がん、腫瘍関連マクロファージ (Tam)、病気の進行、転移, 再発形式に重要な役割を果たすしたがって、単球より腫瘍微小環境と腫瘍細胞との相互作用のメカニズムを理解することは、病気をコントロールすることが重要です。ここでは、我々 はひと乳癌 (BrC) 細胞およびひと単球の三次元 (3 D) 共培養システムの詳細な説明を提供します。BrC 細胞生産規制活性化の高い基底レベル、通常 T 細胞表現 (RANTES) を分泌、単球走化性因子蛋白質 1 (MCP-1)、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (G-CSF)、単球との共培養中炎症性サイトカイン インターロイキン (IL)-1 β (il-1) 及び il-8 はマトリックスメタロプロテアーゼ (MMP)-1、MMP 2、MMP 10 と濃縮しました。この腫瘍間質の微小環境推進アノイーキス mcf-10 a 3 D 腺様構造、単球のより、積極的な BrC 細胞の侵入への抵抗です。ここに示すプロトコル内腫瘍通信を勉強する経済的な代替手段を提供、腫瘍に関連する腫瘍生物学の特定の機能を問い合わせるに 3 D の細胞の in vitroシステムを提供する大きな可能性の例侵略。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腫瘍生物学は以前考えられていたよりもはるかに複雑です。がん細胞が、単なる一括制御不能な増殖細胞のより多くを示しています証拠むしろ、異なる腫瘍細胞は高い組織と腫瘍1内の階層を表示するさまざまな機能を実行するようです。腫瘍細胞は、細胞の非変形と親密なコミュニケーションも: マクロファージ、線維芽細胞、リンパ球、脂肪細胞、血管内皮細胞は、他のセルの間ですべての没頭している足場蛋白質および ECM を構成する多糖類。多数の直接的および間接的な相互作用は、トランス フォームおよび非変形細胞と疾患の結果2,3以上の強力な影響力を発揮する ECM に確立されます。BrC の特定のケースでは、Tam、4, 再発・転移のリスクを増加させる, 腫瘍の進化に重要な役割を果たすため、Tam が発見されていることを考慮した BrC 細胞のコミュニケーションを分析するが特に重要です。 ,5。

内腫瘍の相互作用とその結果を分析する、新しい 3 Dの in vitroアプローチがはるかに複雑な微小環境を提供する ECM エキスの使用に基づいて開発されているとの比較で、腫瘍生物学の現実に近い従来の単層培養細胞が増えるは、プラスチックに接続されています。ピーターセンとビッセル6提供悪性の最初のモデルと悪性の乳腺上皮細胞ラミニン豊富な基底膜上で培養した悪性の人間を差別する 3 D 脊髄構造を記述する第 1 だった乳腺上皮細胞悪性の対応。10 年後、Debnath、Muthuswamy、によって開発されたモデルとブルージュ7,8,9悪性腺房の中に危険生物学的経路を解明する貴重なツールの提供など制御不能な増殖、腺腔アノイーキス、セル抵抗の結果としての損失と障害細胞の極性形成の証拠としてタイト結合蛋白質の非局在化による大きな腺形成としてプログラムされた細胞死の種類で発生します。付着依存性細胞周囲の ECM から切り離す。Sameni モデル、Jedeszko、スローンは侵襲, 腫瘍悪性腫瘍10、11,12のもう一つの重要な特徴に関連して細胞イメージングのプロテアーゼ活性に焦点を当てています。これらのモデルは異なる蛍光焼蛋白基質と混合タンパク質行列に依存 (DQ ゼラチン、DQ コラーゲン I と DQ コラーゲン IV)、蛍光信号のコラーゲンの分解を示唆しています。3 D モデルは非変形両方の茎セルのプロパティ、セルの集計、また呼ばれる回転楕円体の腫瘍細胞を研究にも使用され、懸濁液または非対称細胞分化のメカニズムに対する尋問 ECM のようなタンパク質では培養することができます。細胞分裂、細胞間付着、細胞運動13,14。浸潤アッセイは、腫瘍の本質的な攻撃性と侵襲的プロセス15中走化性因子として機能する分子の同定をテストできるようにします。全体としては、3 D モデルは、通常、発癌性の組織形態をより密接に反映の in vitro細胞培養の手頃な多様化を表します。

我々 は両方の人間商業 BrC 知られている積極的なポテンシャル (内腔・ トリプル ネガティブ タイプ)、プライマリの細胞ラインを使用して前述のモデル7,10,11に基づく 3 D 細胞培養システムを設計しています。BrC 患者から仔のセルです。我々 はまず非積極的な (MCF-7) または積極的な (MDA-MB-231) BrC 細胞が細胞外マトリックス抽出物 (ECME) U937 単球との共培養モデルを開発-ベースの 3 D システム直接細胞相互作用を許可します。これらの共培養は、一連のがんの積極的な行動に関わる遺伝子の転写に影響を与えたこれら 2 つの細胞系譜の間の通信を決定するために使用されました。1 つの製品、プロスタグランジン E2 (PGE2) 炎症癌の進行に於いての役割を強調表示されます見つける増産と一致するシクロオキシゲナーゼ 2 (COX-2) 成績証明書の大幅な増加が観察されました。MMP の高められたトランスクリプションが積極的な MDA MB 231 細胞共同 DQ コラーゲン IV を含む文化の U937 単球培養したときよりコラーゲン分解と相関が認められました。注記のうち、私たちの共培養したコラーゲン分解の細胞間相互作用メカニズムが必要であると仮定をサポートしていません。むしろ 2 つセル血統間の通信は分泌された分子によって調停されるようお勧めします。さらに、これらの共同培養の試金から収穫される清には13未変換 mcf-10 a の細胞によって形成された腺房を解体可溶性因子が含まれています。積極的なことが分かったし、分泌される主の BrC 細胞単球走化性分子 MCP 1、GM-CSF と RANTES の上昇します。したがって、我々 は細胞が細胞間相互作用を防ぐために細胞文化の挿入に分けられた 3 D 文化概説。これらの文化は、BrC 細胞と単球の間の間接的な通信に対処するために使用されました。これらの試金、非積極的かつ積極的な商業 BrC 細胞と初代の BrC 細胞ひと単球の 3 種類に: 商業 U937 と THP 1 セル、およびプライマリ単球 (PMs) (すべて健康なドナーの末梢血から分離しました。単球は非活性化状態で使用されていた) に使用されました。共同文化の豊かさに炎症性サイトカイン il-1 と IL-8 の濃度の増加が認められました。同様に、MMP 1、MMP-2、および MMP 10 も BrC 細胞単球共培養、およびこうして補強前調査結果14に増加したことがわかった。本稿では、プライマリの BrC 細胞分離および 3 D 培養テストのポイントによってワークフローは代表の結果と一緒に提示されます。この作品は、腫瘍生物学の特定の側面を調査する 3 D の細胞の in vitroシステムを提供する大きな可能性の良い例を構成します。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BrC 患者から採取した Unidad de 危惧 en Virología y ある病院 Infantil ・ デ ・ メヒコ フェデリコ ・ ゴメスの組織バンクから。本研究は、科学によって承認された、倫理的なおよびバイオ セキュリティ レビュー病院 Infantil ・ デ ・ メヒコ フェデリコ ・ ゴメスのボード: Comité デ危惧、Comité ・ デ ・ Ética en 危惧、Comité ・ デ ・ Bioseguridad。すべての患者が前向きに在籍していた、研究の性質について知らされた: 参加希望者は検体採取前に書面によるインフォームド コンセントを署名し、倫理的なガイドラインとの臨床ベストプラクティスに従って扱われました。機関。参加者の身元は調査の持続期間のため匿名だった。患者は、浸潤性膵癌、組織学的グレード 2 および組織切除前にない前のネオアジュ バント療法と臨床病期 II と診断されました。患者がすべての女性高齢者平均 56.8 歳 (42 に 75 の範囲)14。

1 3次元細胞培養

  1. シード 0.1 × 106 mcf-10 a セルまたは 5% 添加 DMEM/F12 培養液中の 25 cm2培養フラスコで一次の BrC 細胞馬血清、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、100 ng/mL コレラ毒素、0.5 μ g/mL ヒドロコルチゾン、10 μ G/mlインスリン、および 20 ng/mL 表皮成長因子 (EGF) の。シード 0.1 × 106商業 BrC 細胞, mcf-7 細胞と 75 cm2 MDA MB 231 細胞 10 %fbs、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 100 μ G/ml 添加 DMEM/F12 培養液中のフラスコの文化.5% の加湿で 37 ° C で CO2環境。
  2. 48 時間後に、10 ml 滅菌 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x のセルの単一層をすすいでください。Trypsinize 3 mL 0.05% トリプシンと 0.48 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 37 ° C で 5-10 分のためのソリューションでセル単一層Trypsinization を停止する対応する血清の 200 μ L、サプリメントなし中の 7 mL を追加します。ノイバウアー区域のセルをカウントする 10 μ L の因数を外し、ピペッティングにより細胞を再懸濁します。
  3. 8 よくチャンバー スライド システムの各ウェル、見開きの 37 ° C で 30 分間インキュベーションに続いて、純粋な ECME の 40 μ L ベース
  4. 各ウェルに配置 DMEM/F12 (なし) ステップ 1.1 のように、次の変更と補足の 400 μ L で再停止される 800 セル: プライマリ BrC 細胞および mcf-10 a 細胞、EGF と 2% の 4 ng/mL を追加 ECME;MCF 7、MDA MB 231 のみ追加 2 %ecme。
  5. 37 ° c 5% の加湿で文化を孵化させなさい CO2環境。文化メディアごとの 48 時間を交換します。
  6. レコード形態の細胞はすべての 24 h、光学顕微鏡で 15 日間の変更します。プライマリ BrC の形態を分析するには、細胞、mcf-10 a と MDA MB 231 細胞は、順序付けられた腺形成と無秩序の積極的な癌のような構造の例の良い参照セル線それぞれ。
  7. 100 X 200 X 倍率で明るいフィールド顕微鏡で細胞の画像を取得し、mcf-10 a の参照および MDA MB 231 培養細胞 (図 1) で細胞の形態を比較します。

2. 腫瘍組織から癌細胞を取得

注:取得するには、腫瘍上皮細胞はない前ネオアジュ バント療法と BrC 患者から切除の原発腫瘍から組織を使用します。壊死部分を回避し、腫瘍の 0.5 cm3の最小値に対して。

  1. 滅菌 1x PBS で腫瘍組織を洗浄し、機械的にメスで 1-2 mm の断片にそれを非集計。
  2. 室温 (RT) に従って溶液 2 mL で 2 h のキャップに 20 mL を無菌バイアルで組織をダイジェスト: 私、DMEM/F12 媒体含む 100 U/mL のペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシン 100 U/mL ヒアルロニダーゼ 1 mg/mL コラゲナーゼ種類をミックス、一定の攪拌しながら。
  3. 未消化の組織の大部分を除去するためにチュールの滅菌の部分を通って結果懸濁液をフィルター処理します。滅菌 100 μ m 孔径膜を通して細胞懸濁液をフィルター処理します。
  4. RT で 5 分間 430 x g で細胞のペレットし、滅菌 1x PBS で 2 回洗います。5% 馬血清、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、100 ng/mL コレラ毒素、0.5 μ g/mL ヒドロコルチゾン、10 μ g/mL インスリン、EGF の 20 ng/mL と F12/DMEM 培主細胞。加湿 5 %37 ° C で文化のすべての 48 の h. 維持媒体を交換 CO2環境。
  5. 隔離されたセルが上皮細胞の免疫細胞化学14標準プロトコルであることを確認します。3 つの上皮系マーカーをテスト: サイトケラチン (PanCK) のパネル ムチン 1 (Muc-1)、および上皮細胞接着分子 (EpCAM)。

3. 午後末梢血から細胞を分離します。

  1. 末梢血からは元気のエキス約 40 mL ボランティア、滅菌エンドトキシン フリー 1 × PBS で 1:3 の割合で血液を希釈し、密度勾配分離の対象します。
  2. 円錐管 1.077 グラム/mL の密度と polysucrose、ナトリウム diatrizoate 媒体の 2 mL を配置します。ゆっくりと慎重に希釈血液を 8 mL をオーバーレイします。765 x g 使用した遠心分離機の最も遅い加速減速速度で 30 分間遠心します。
    注:遠心分離後、トップへ下から 4 つの層が形成される: 赤血球ペレット、密度勾配媒体層、(細かい白いリングとして表示されます) 単核細胞層、およびプラズマ層。
  3. 慎重に滅菌パスツール ピペットでグラデーションから単核細胞層を取得し、3 回で洗って 1 × PBS 各時刻の遅い遠心分離後 (430、275、および 191 x g) 室温 10 分
  4. 細胞の活性化を避けるために否定的な選択のプロトコルを使用します。このようなプロトコルの例は次のとおりです。
    1. 一度バッファー洗浄液 (0.5% ウシ血清アルブミン、2 ミリメートルの EDTA 1x PBS で) と単核細胞を洗浄します。ノイバウアー チャンバー内でセルをカウントし、バッファー溶液の 1 x 107セル/30 μ L の密度にそれらを調整します。
    2. すべての 1 x 10 の7セル試薬と抗 CD3、CD7、CD16、CD19、CD56、CD123、グリコフォリン A (商業キットに含まれる) が含まれている単球ビオチン抗体カクテルの 10 μ L をブロックする FcR の 10 μ L を追加します。
    3. セルをミックスし、4 ° C で 15 分間インキュベートバッファリングされた洗浄液の追加の 30 μ L プラス 20 μ L (キットに付属); 反ビオチン マイクロ ビーズを追加します。セルを混ぜるし、4 ° C で 20 分間インキュベート
    4. セル一度バッファリングされたソリューション、RT で 5 分間 430 × g で遠心分離機し、の 1.5 mL で再懸濁します洗浄バッファー、磁気分離のためのソリューションです。
    5. 中古リンス磁気分離列に細胞懸濁液を読み込み、バッファー液 7 mL を追加します。15 mL の円錐管に単球濃縮率を収集、セルを数えるし、すぐに培養しない場合凍結 −80 ° C で 50 %fbs と 10 %dmso を添加した DMEM/F12 媒体の 2 × 106セル/1 mL の密度で単球
      注:生存することができます危険にさらされると凍結、2 ヶ月以上後球を使用しないでください。
  5. 6 %fbs、100 U/mL ペニシリンで加湿 5 %37 ° C、100 μ g/mL ストレプトマイシンと F12/DMEM 培で PMs の文化を維持 CO2環境。
  6. 活用した PMs に少なくとも 2 つの異なるドナーから独立して、異なるドナーからプーリング単球単球の活性化につながるよう実験の各セットを実行します。

4. 3 D を確立する共培養します。

  1. 間接的な相互作用と 3 D の共培養
    注:     0.4 μ m 孔サイズの膜によるポリカーボネート細胞培養インサート 24 ウェル平底培養皿でこれらのアッセイを実行します。この試金清とセルの両方は、実験の終わりに取得できます。
    1. 10% 添加 RPMI 1640 培地 10 mL に 2 x 106 U937 と THP 1 球を養う FBS、1% 抗生物質/抗真菌薬、加湿 5 %37 ° C で (以前に示されたステップ 3.5) として補われた DMEM/F12 の培地で新鮮な PMs を養うと CO2環境。
    2. 4 x 105球 1 mL/もその対応する媒体をプレート (2 %ecme、2% を添加した U937 と THP 1 球か 2 %ecme、6% FBS PMs のため政府短期証券)。
    3. 各ウェルに挿入を配置し、対応する中 4 × 105 BrC 細胞懸濁液 0.9 mL を追加 (補われる商業細胞または 5 %fbs 馬初代 BrC 細胞の血清の 2 %ecme と 2%)。メディア総数の半分にすべての 48 h を取り付けます。
    4. 5% の加湿で 37 ° C で 5 日間の CO2環境と培養上清を回復します。その後の分析を実行する場合、trypsinization によってセルを取得します。
    5. それぞれのメディアの個々 の細胞培養のコントロールが含まれます。
  2. 直接のやり取りを 3 D の共培養
    1. BrC 細胞と単球細胞培養 mRNA および蛋白質の表現の分析のための培養後各細胞系譜の独立した並べ替えを許可する前に異なる蛍光色素でラベルを付けます。生きている細胞の細胞膜を自由に通過するクマリンおよびローダミンの市販の誘導体を使用します。分類のための一般的なプロトコルは次のとおりです。
      1. 興味 (2 × 106 25 cm2培養用フラスコ細胞) の BrC セルの単一層を準備し、標準培地に置き換えます (1:2, 000 標準基本培地に蛍光色素の蛍光色素の十分に予め温めておいた実用的なソリューションなく任意の補足)。5% の加湿で 37 ° C で 30 分間インキュベート CO2環境。色素溶液を吸引し、十分で軽くすすぎ 1 × PBS。PBS を吸引し、標準培地を追加します。
      2. 37 ° C で 5 ~ 10 分の 0.05% トリプシンと 0.48 mM EDTA 溶液 2 mL でセル単一層を trypsinize します。Trypsinization を停止する政府短期証券を 200 μ l 添加し、サプリメントなし特派員の中の 7 mL を追加します。ピペッティングにより細胞を再懸濁します。ノイバウアー区域のセルをカウントする 10 μ L の因数を取る。セルをカウント後培養プロトコルを続行します。
      3. RT で 5 分間 430 x g で細胞のペレット (これを実行最初単球が懸濁液で育つので)。上澄みを廃棄し、優しく蛍光色素 (サプリメントなし標準基本培地に蛍光色素の 1:2, 000) に予め温めておいた作業溶液 3 mL と細胞を再懸濁します。5% の加湿で 37 ° C で 30 分間インキュベート CO2環境。
      4. セルを再びペレット、仕分け作業液を捨て、5-7 mL の 1x PBS で優しく再懸濁します。もう一度ペレット、PBS を破棄し、5-7 mL 標準培地に細胞を再懸濁します。ノイバウアー区域のセルをカウントする細胞を懸濁液の 10 μ L の因数を取る。セルをカウント後培養プロトコルを続行します。
    2. 共培養を次のように設定:: 4 よくチャンバー スライド システムの各ウェルにも層を形成する井戸の底で十分な ECME を広めます。5 × 105標識 BrC 細胞/ウェルを含む単一細胞懸濁液 20 μ L をプレートします。
    3. 37 ° C で培養の 15-20 分を追加 2.5 x 10 の停止後5ラベル 80 μ L 測定中の単球 (60% を添加した ECME)。
    4. 37 ° C で 15-20 分を固める ECME を許可します。
    5. BrC 細胞と単球培の 1:1 の混合の 1 つの mL を追加します。
    6. 37 ° c 5% の加湿で共培養を孵化させなさい CO2環境 24 h、48 h または異なる時点での変化を追跡する 5 日間。
    7. 文化から細胞を回復する ECM 蛋白質を低下させます。吸引し媒体を破棄、0.1% トリプシン 1 × PBS と 0.25 %edta の 0.5 mL を追加し、37 ° C で 3 時間インキュベートインキュベーション後、追加 0.5 mL の 1x PBS で 10% の FBS、トリプシンを中和し、単一細胞懸濁液を取得する精力的にピペッティングにより細胞を再懸濁します。
    8. RT で 5 分間 765 x g で細胞のペレット、上澄みを廃棄し、5 mL の 1x PBS で 10% に細胞を再懸濁します FBS。この手順をもう一度繰り返します。
    9. 適切な計測器と (FACS) を並べ替え蛍光活性化細胞の細胞懸濁液を対象します。確実に最終的な人口の少なくとも 95% 純粋な)。
    10. 並べ替え後、滅菌 1 × PBS、ペレット (常温 5 分 430 x g) で細胞を洗浄し、滅菌 1 × PBS に再懸濁します。RNA の隔離または蛋白質の分析のための特定のプロトコルによると、細胞を処理できます。
    11. 各アッセイを含む各個々 の細胞系譜の 3 D 培養コントロールの 3 回繰り返します。
  3. コラーゲンの劣化を評価するために 3 D の共培養の直接相互作用
    1. ステップ 4.2、IV 型コラーゲン、ECME にかに付け 32.5 μ g/mL の追加の追加の手順に従って、3 D 細胞共培養を確立します。コラーゲン IV、ECME の最終濃度は、0.5% です。シャーレは、35 mm coverslip の文化を育てます。
    2. ECME ペトリ皿の底に 40 μ L の層を広げます。37 ° C で凝固する ECME を許可します。
    3. 媒体の 10 μ L の 105 BrC 細胞 x 2.5 を追加し、セルを落ち着くようにします。
    4. 40 μ L アッセイ培 (DQ コラーゲン IV ラベル ECME の 60%) で単球5 U937 10 × 1.25 の懸濁液を追加します。
    5. 37 ° C で 15-20 分を固める ECME を許可します。
    6. BrC 細胞と単球培の 1:1 の混合の 2 mL を追加します。
    7. 5% の加湿で 37 ° C で 5 日間共培養を孵化させなさい CO2環境。文化メディアごとの 48 時間を交換します。
    8. 共焦点走査型顕微鏡に蛍光性の放出を分析し、文化の 50 μ m2あたり (IOD) 内蔵の光学密度を測定します。IODs を比較、個々 の文化と文化時間 0 で (図 2)。

5. 3 D から培養上清の分析は間接的な相互作用と共培養します。

  1. 培養 5 日後上下両院の三次元共培養の下のコンパートメントおよび個々 の 3次元培養コントロールから培養上清を回復します。ピペッティングでよくそれぞれの上清をミックスします。因数、およびストア − 20 ° C まで使用 (最大 1 ヶ月) で上清。
    注:ストレージは 1 ヶ月以上になる場合 −80 ° C で培養上清をしてください。
  2. 多重アッセイ プラットフォーム、酵素抗体法 (ELISA)、または製造元の推奨手順に従うビーズを用いたイムノアッセイと培養上清を分析します。
    注:清の西部のしみの分析または濃縮サイズ蛋白ザイモグラフィー解析16,17を実行するを取得する特定の孔フィルターを通して集中もできます。また、培養上清メディアとして使用エアコンその他の実験のため下記のとおり。エアコンのメディアは 5 日文化 (図 3) から通常得られます。

6. 主 BrC 細胞からの上清が腺形成や腺構造の効果の評価

  1. 8 よくチェンバー スライドの各ウェル システム ECME の 40 μ L ベースを拡大し、37 ° C で 30 分間を固めること
  2. シード 800 mcf-10 a 細胞/ウェルで 1.2 の手順に記載されている補足の DMEM/F12 培養液 400 μ L。
  3. 人間の組換えの il-1 の 20 ng/mL の調節されたメディアまたは補われた DMEM/F12 培 400 μ L を追加します。
  4. 場所 35 mm のペトリ皿を含むガラス シャーレにチェンバー スライド 2 mL の湿度環境を作成する PBS でいっぱい。
  5. メディア/清すべて 48 h を交換してください。
  6. 腺房形成すべての 24 h のため記録 14 日光学顕微鏡で。
  7. 14 日間培養後染色の 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 100 の濃度で 100 μ L と腺細胞の核を観察する 1 × PBS で nM。一定の攪拌で RT で 25 分間インキュベートします。蛍光染色のための特定のメディアをマウントを準備したマウントで一定攪拌するたびに 5 分の 1x PBS で 3 回をすすぎます。透明光沢シールし、維持 4 ° C で光から保護
  8. 腺管構造 (図 4a, B, C) の異なる深さで横断スタックの画像を取って顕微鏡で、房を分析します。
  9. 適切なプロトコルを汚すと腺細胞蛋白質を視覚化します。例えば、E-カドヘリンは、細胞接着、細胞極性および/または内腔形成18 (図 4D) を評価するために染まっていた。

7. 移行を試金します。

注:U937 の移動分析を実行し、THP-1、新鮮な PMs ポリカーボネートを使用して 24 ウェル平底培養皿の細胞文化 8 μ m 孔サイズの膜挿入。以前積極的 BrC 細胞の個々 の 3 D 文化で高濃度に分泌ケモカイン GM-CSF、MCP-1 と RANTES が検出されたことが示された.それはそのこれらのサイトカインが; 原発のサイトに単球を誘致する重要な提案だったこれは、走化性因子としてサイトカインを使用して移行の試金のテストされました。

  1. 文化 U937、THP-1、または新鮮な PMs 4.1.1 の手順に記載されています。
  2. 膜の水和物への血清なし RPMI 1640 の 200 μ L で一度各挿入をすすいでください。
  3. 37 ° C で 1 h の重合に ECME が冷たい ECME の 50 μ L でそれを埋める、24 ウェル平底文化板のインサートを配置でき
  4. プレートの上部のコンパートメントに RPMI FBS なしの 180 μ L を追加します。衆院の GM-CSF のいずれかの 100 ng/mL 添加 RPMI 800 μ L バブルなしで追加 MCP-1、または走化性因子として RANTES。ネガティブ コントロールとしてサイトカインなしメディアを使用します。ケモカイン勾配を確立する 37 ° C で 30 分間インキュベートします。
  5. 生殖不能の管、2 回洗浄後の各型の場所 1.5 x 105 1 × PBS と 430 x g で RPMI FBS なしのルートを再懸濁します単球 20 μ L で 5 分間遠心の 1 ml に置いて挿入、し (上部室の最終巻は 200 μ L) 細胞懸濁液を非常に慎重に均質化します。
  6. 5% の加湿で 37 ° C で 24 時間の進行状況セル移行が可能 CO2環境。
    注:単球は非付着性、渡り鳥セル通常下部コンパートメントのメディアになります。
  7. ドライブベイ カバーを取り外す、メディアを取り出すし、2、4、6、およびノイバウアーの商工会議所または流れの cytometer; を使用して 24 h でセルをカウント一方、メディアで細胞が見つからない場合に特には、デジタル カメラでの挿入の下の部分の画像を取得します。(100 倍) で 3 つのランダムなフィールドからセルの平均数は、分析 (図 5) に使用されます。

8. 浸潤アッセイ

注:8 μ m 孔サイズの膜によるポリカーボネート細胞培養インサート 24 ウェル平底培養皿の BrC 細胞浸潤アッセイを実行します。私たちの元の研究のイリノイ 8 は BrC セル/単球の三次元共培養上清の濃縮サイトカインの一つだった。このサイトカインが BrC 細胞の浸潤に参加していたかどうかを調べた。

  1. 75 cm2フラスコで BrC 細胞を展開します。MDA-MB-231 として、株 HS578T、T47D MCF 7 手順で説明した 1.2 (しかし ECME なし) と一次 BrC 細胞ステップ 2.4 で説明されているよう。
  2. 一度各ポリカーボネート 8 μ m 孔膜の細胞培養媒体 (テスト細胞ラインに使用される媒体依存) 血清なしの 200 μ L で挿入を洗う膜の水和物へ。
  3. 37 ° C で 1 h の重合に ECME が冷たい ECME (1:4 希釈 ECME:cold 中 FBS なし) の 50 μ L で、挿入を入力、24 ウェル平底文化板のインサートを配置でき
  4. ECME は、重合、FBS せずそれぞれの携帯メディアの 180 μ L を追加します。挿入のスリットを通して FBS なし 800 μ L のメディアを追加します。IL 8 勾配を確立する 37 ° C で 30 分間インキュベートします。
    注:メディアに泡が生じないようにしてください。使用するメディアは FBS なしが 100 ng/mL で IL 8 走化性因子、またはネガティブ コントロールとして、FBS のない純粋なメディアとして。
  5. 6 × 10 の合計5各セルラインのセルを次のように: 取得します。
    1. 培養上清を破棄、10 mL の 1x PBS で 1 回洗浄し、セルをデタッチする 37 ° C で 2 分 0.05% トリプシン/0.48 mM EDTA の 2 mL を追加します。トリプシン反応を停止し、ピペッティングで精力的に再懸濁します補われた媒体の 4 つの mL を追加します。
  6. ノイバウアー区域のセルをカウントする細胞懸濁液の分注 10 μ L を取る。6 × 105細胞を含む細胞懸濁液の量を取る。RT で 5 分間 430 × g で遠心分離機、上澄みを廃棄し、1 mL の 1x PBS のセルをすすいでください。もう一度すすぎを繰り返します。
  7. FBS せずそれぞれのメディアの 20 μ L のセルと FBS せずそれぞれのメディアの 180 μ L を含む挿入の場所を再懸濁します。慎重にピペッティングにより細胞懸濁液をホモジナイズしてください。
  8. 5% の加湿で 37 ° C で 48 時間進行する細胞侵入を許可する CO2環境。
  9. 48 時間後カバーを取り外します、上澄みを廃棄し、リンス 200 μ L の 1x PBS で一度は非常に慎重に挿入します。綿の先端アプリケータと PBS の超過分を削除します。
    注:セルがあるこの場合に侵襲的な細胞が通常挿入の反対側に接続されて付着。
  10. 1 mL を含む 24 ウェル平底培養プレートのウェルにインサートを配置することによって、セルを修正/RT。 その後で 15 分の 4% パラホルムアルデヒドのよくリンス 1x PBS で一度挿入。
  11. よく綿棒削除すべての ECME 膜の上からと、慎重に右の 45 分の 0.2% クリスタル バイオレットによる 1 × PBS よく/1 mL を含む 24 ウェル平底培養プレートのインサートを配置することによって、細胞を染色します。、移行しなかったセルを含む、非常に慎重に排除することを避けるために蒸留水ですすぎ固定侵襲的な細胞。
  12. 倒立顕微鏡下で挿入の下側を観察することによって侵入のセルをカウントします。(100 倍) で 3 つのランダムなフィールドからセルの平均数が使用されます。セルがクラスターとして侵攻しているし、個別にカウントしにくい場合は、デジタル カメラで (100 倍) で 3 つのランダムなフィールドからイメージを取得します。画像解析のためのソフトウェアを使用して画像を分析し、細胞浸潤 (図 6) を定量化する IOD を使用します。

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結果

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BrC 細胞三次元培養における形態素解析:

低・高密度 3 D 文化で育つ主の BrC 細胞の形態を 5 日間にわたって調べた。最初の 48 時間の間に、細胞は、ECME に準拠し、低密度を維持します。この時点でそれが明らかに高く評価される細胞がいくつかの 2 つ以上の長い細胞質突起を有すると明らかな細胞間の接触を示すことがなくスピンドル状の細長い形を提示します。5 日間培養後の細胞は彼らの初期の形態を維持しながら増殖。また、彼らは特定の構造組織がなければネットに似た構造を形成、ない接触阻害と積み重ねを表示されます。腺房に似た球状の構造を形作る、未変換 mcf-10 a 細胞との比較が行われました。これらの細胞は、(約 50 μ m) の均一なサイズの丸いよく区切りおよび組織構造の特徴的な形態を表示します。逆に、一次 BrC 細胞共有よく似て積極的 BrC 細胞 MDA-MB-231 (

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ディスカッション

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上皮細胞 3 D 空間構造の成長し、ECM 蛋白質との相互作用は組織の恒常性のため極めて重要です。細胞膜 (2 D) の成長の多くのがん研究に基づいているし、単分子膜が ECM に課す、細胞の特性を要約しない彼らは腫瘍の形成および進行の多くの側面を理解する重要なされているが、インスタンス:増殖、接着依存性細胞の生存、頂基底極性、ECM を改造、細胞分化などを制限します。重要なは、だけでなく、腫瘍細胞と ECM 間の相互作用は癌の進行に欠かせない、腫瘍と非腫瘍性細胞などの免疫細胞の間の通信の確立も。ここで提供されるプロトコル環境内でがん細胞と免疫細胞間の相互作用の理解の促進、ECM によって炎症性応答はこれらの相互作用によって促進される、この炎症性条件を作成する方法、肯定的なループより単球とがん細胞のより多くの侵略を育成します。

ECME を使用しての大きな利点は、様々 な実験的 3 D を実行する適切な生物学的足場モデル22を提供することです。それは、ラミニン、コラーゲン IV、entactin、ヘパラン硫酸プロテオ...

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開示事項

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著者は、利害の衝突をしていない宣言します。

謝辞

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この作品は、CONACyT FONSEC SSA、IMSS、ISSSTE プロジェクト号 233061 エセキエル ・ m ・ フエンテス-Pananá、フォンド ・ デ ・ Apoyo 危惧、病院 Infantil ・ デ ・ メヒコ フェデリコ ・ ゴメス (プロジェクト番号 HIM-2014-053) アラカルトにサポートされていました。・ エスピノーザ サンチェス NA は、プログラム ・ デ ・ Doctorado en 芸術 Biomédicas、大学国立自治・ デ ・ メヒコ (UNAM) と CONACYT から受信した交わり 231663 から博士課程の学生です。E S NA、また社会保障 (IMSS) のメキシコ協会によって提供される財政支援を認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
U937アメリカンタイプカルチャーコレクション ATCC CRL-1593.2単球性細胞株/組織球性リンパ腫 
THP-1アメリカンタイプカルチャーコレクション ATCC TIB-202単球性細胞株/急性単球性白血病 
MCF-10Aアメリカンタイプカルチャーコレクション ATCC CRL-10317非形質転換乳房細胞株
MCF-7American Type Culture Collection ATCC HTB-22乳がん細胞株
T47DAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-133乳がん細胞株
HS578TAmerican Type Culture Collection ATCC HTB-126乳がん細胞株
MDA-MB-231American Type Culture Collection ATCC HTB-26乳がん細胞株
RPMI 1640 培地GIBCO BRL Life Technologies11875-093
DMEM 高グルコース GIBCO BRL Life Technologies11964-0924.5 g/L グルコース
DMEM/F12GIBCO BRL Life Technologies11039-021
抗生物質/抗真菌薬GIBCO BRL Life Technologies15240-062100 U/mL ペニシリン、100 & micro;g / mLストレプトマイシン、および0.25 µg/mL Fungizone
ウシ胎児血清GIBCO BRL Life Technologies16000-044
馬血清 GIBCO BRL Life Technologies16050114
0.05% トリプシン-EDTA 1XGIBCO BRL Life Technologies25300-062
PBS 1X (リン酸緩衝生理食塩水GIBCO BRL Life Technologies20012-027
上皮成長因子 (EGF)PeproTechAF-100-15 (1.00mg)
インスリンSIGMA-ALDRICHI1882-100MG
ヒドロコルチゾンSIGMA-ALDRICHH088-5G
コレラ毒素 ビブリオ・コレラSIGMA-ALDRICHC8052-1MG
マトリゲル Corning Inc356237Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫、細胞外マトリックス抽出物、-20°Cで保存。Cは4°で使用するまで。C
GM-CSFPeproTech300-03
MCP-1PeproTech300-04
RANTESPeproTech300-06
IL-8PeproTech200-08
IL-1βPeproTech200-01B
クリスタルバイオレットハイセル México541
パラホルムアルデヒドSIGMA-ALDRICHP6148
トランズウェル透過性サポート (インサート)Corning Inc3422直径 6.5 mm、8 & マイクロ;m細孔径/24ウェルプレート 
トランズウェル透過性サポート(インサート)Thermofisher Scientific1406206.5 mm直径、0.4 & マイクロ;m細孔径/24ウェルプレート 
単球単離キットIIヒト Miltenyi Biotec130-091-153
LSカラムMiltenyi Biotec130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate AssayEMD MilliporeHCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation)Luminex Corporation40-072
Lab-Tek チャンバースライド カバー付き (8まあ)ナルゲ・ヌンク・インターナショナル177402
ガラス底マイクロウェル 35mmペトリ ディッシュMatTek Corp.P35G-1.5-14-C

参考文献

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3D ECM

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