Method Article

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

DOI:

10.3791/56600

⸱

December 21st, 2017

 ,  , 
1Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA 分子の定量化を可能にする可視化手法です。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

固定細菌エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光の使用のための個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書をラベル付けアルゴリズムを述べる。smFISH では、興味の遺伝子の mRNA のコピーの数の細胞間の可変性の測定として、転写産物の細胞内局在をことができます。主な手順は、細菌の細胞培養の固定、細胞膜の透過および市販の短い蛍光標識したオリゴヌクレオチド プローブのセットとターゲットの転写産物の交配です。smFISH は、異なる蛍光マーカー間スペクトルの重なりによって課された制限と同じ細胞の複数の遺伝子の転写産物のイメージングを許可できます。下図のプロトコルが完了した後、低輝度蛍光に適したカメラと組み合わせて顕微鏡を用いた細胞が容易にイメージ化します。位相コントラスト フレームの分割細胞膜が染色から得られたセルの輪郭と共に、これらのイメージは、オープン ソースまたはカスタム作成されたソフトウェアを使用して細胞のサンプルの mRNA のコピー数の分布の計算を許可します。ここで説明したラベリング法を確率論的光再建顕微鏡 (嵐) イメージを成績証明書に適用もできます。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

確率は遺伝子発現の基礎的、やむを得ない面であり、細胞多様性1、両方の成績証明書および蛋白質の2,の3レベルに上昇を与えます。明確に定義された条件の下でセル間変動の定量化は、遺伝子の発現とその制御の根底にある基本的なプロセスに、ユニークなウィンドウを提供しています。細菌における細胞多様性の 1 つの重要な源は、転写レベルで行われます。成績証明書番号は、転写、転写プロセス調節などにも確率のためだけではなくを小さな Rna と RNAases2によって異なります。定量的な方法で多様性に直接アクセスする方法の 1 つは、蛍光 smFISH のある特定の遺伝子の個々 の成績証明書を付けることです。この方法では、検出と特定の RNA の分子の細胞内局在性固定、個々 の細菌細胞4をことができます。利息5,6のトラン スクリプトに選択的に結合するように設計、蛍光標識 〜 20 拠点長のオリゴヌクレオチドのセットを持つ Mrna を交配します。複数のラベル付けにより、上記のバック グラウンド蛍光検出と個々 の mRNA 分子は、回折限界のスポットが蛍光顕微鏡

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. プローブの設計

注: このプロトコルは、すでに fluorophores が付いているタグ付き市販オリゴヌクレオチド プローブを使用します。プローブは、ターゲットに相補的な特定のシーケンスのセットで構成されます mRNA、各プローブの単一蛍光分子に活用されています。また、5,16を他の場所で説明されているようにプローブ、蛍光マーカーを付けることが可能です。

  1. アルジュン ラージュ (Oudenaarden 研究所、マサチューセッツ工科大学・ ヴァン); によって開発されたプローブ デザイナー16アルゴリズムを用いた設計 smFISH プローブこの原稿で使用される smFISH プローブのシーケンスは、材料の表に記載されています。
    注: 最小検出可能なシグナルのセットでプローブ数は 30 ~ です。正確な数は、非常に短い転写産物を測定した場合に特に興味の遺伝子によると異なる場合があります。
  2. 光セットアップに合った染料を選択 (材料の表を参照)。
    注: Cy3 染料または写真漂白剤に感受性の低い光学同等の色素強くお勧めします。デュアル ラベルの候補は cy5 の組合せまたは光学同等 (材料の表を参照) を染めます。ラベル付けされた mRNA の嵐イメージング....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SmFISH大腸菌の細胞の galK と sodB の転写物の測定を行った。成績証明書は、単一蛍光分子に共役されて各プローブ ターゲット シーケンスに補足特定のシーケンスのセットで交配させられた (資料の表を参照)。蛍光・位相コントラスト画像 MG1655 野生型の大腸菌の菌株 (WT) または JW0740 (慶應義塾コレクション)19 galK 削除ひずみ (ΔgalK) は、D-フコースは、図 1 aおよび1 bに示すように 2 mM にさらされました。セルは、D-フコースへの暴露後少なくとも 3 時間を修正しました。図 1A (top) でパネル表示セルの輪郭が細胞外 D フコース濃度変数への応答におけるgalK誘導レベルを表す、フォーカスには高さに対応する 13 のうち 1 つのフレームです。.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

当研究室で smFISH メソッド2を使用してE. 大腸菌細胞の異なる遺伝子のコピー数で測定しました。簡単に言えば、この手順は次の手順で構成されています: セル固定、プローブの浸透を可能に膜の透過プローブの交配、そして標準的な蛍光顕微鏡を用いたイメージングのサンプルします。この手順は、いくつかの変更6,7,16以前に発行されたものに基づいています。その smFISH はオリゴヌクレオチド プローブの数が背景7の上にも横になっている信号を達成するために 48-72 の範囲である必要があります以前報告されています。私たちは、この番号は興味、光のセットアップ、および特定の実験条件の遺伝子シーケンスに応じて、実際には小さく20ことを示しています。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、(バッハ) にイスラエル科学技術振興財団助成金 514415 と (バッハ) に BSF NSF (MCB) グラント 2016707 によって支えられました。ジークフリートとイルマ ウルマン (バッハ) 教授の椅子はまた認めたからサポートします。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
デキストラン硫酸ナトリウム塩Sigma-AldrichD8906
純エタノール、99.5%、ACS 試薬、絶対Mallinckrodt Baker - Avantor8025.25
ジエチルピロカーボネート (DEPC)Sigma-AldrichD5758
RNase-free 20X SSCLife Technologies/AmbionAM9763
RNase-free 10X PBSLife Technologies/AmbionAM9625
TE バッファー (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, 分子生物学用Sigma-Aldrich93283
ヌクレアーゼフリー水Thermo Fisher Scientific10977035
分子生物学用ホルムアルデヒド溶液, 36.5-38% 水中Sigma-AldrichF8775
脱イオンホルムアミド, ヌクレアーゼフリーThermo Fisher Scientific/AmbionAM9342
大腸菌tRNA(リボ核酸、大腸菌由来xx型転写)Sigma-AldrichR1753-500UN
UltraPure BSA (50mg/ml)サーモフィッシャーサイエンティフィック/アンビオンAM2616
バナジル-リボヌクレオシド複合体、VRC、200 mMニューイングランドバイオラボS1402S
ポリ-L-リジンSigmaP4707
システアミンと酸素Sigma-Aldrich30070
アスペルギルス・ニジェールのグルコースオキシダーゼ、VII型、50KUシグマ・アルドリッチG2133
カタラーゼシグマ・アルドリッチC40
D-グルコースシグマ・アルドリッチG8270
D-フコースシグマ・アルドリッチF8150
Vybrant DiO細胞標識溶液テクノロジーV2286
アガロース、低融点試薬Sigma-AldrichA9414
接着シリコーンアイソレーター 直径24-2mm×深さ1.8mm JTR24R-A2-2.0Grace Bio-LabsJTR24R-A2-2.0<スパン> 666208
D-リジンコーティングガラス底 ガラス底培養皿マットテック株式会社P35GC-1.5-14-C
スーパーライフニトリルパウダーフリー検査用手袋スーパーマックスTC-N-9889
ブランド滅菌インキュベーターテープSigma-AldrichBR61750
微量遠心チューブ (1.8 ml)Axygen - Corning Life SciencesMCT-175C
Falcon 丸底ポリプロピレンチューブ (14 ml)BD Biosciences352059
円錐底遠心分離ポリプロピレンチューブ (50 ml)Corning430828
Serological pipettes (Corning 5 ml)Corning Life Sciences4051
Serological pipettes (Corning 10 ml)Corning Life Sciences4488
Serological pipettes (Corning 25 ml)Corning Life Sciences4251
分光光度計キュベットSarstedt67.742
RNaseフリーピペットチップ 0.2 - 20 μlFroggaBioFT20
RNaseフリーピペットチップ 10 - 200 μlAxigene/corningTF-200
RNaseフリーピペットチップ 100 - 1000 μlFroggaBioFT1000
RNaseフリーピペットチップ 100 - 1000 μlソレンソン14200
シリンジ ディスポジ 10 mL ニードル G-21ベクトン ディキンソン、バイオサイエンスBD-309643
Minisart 0.2 um シリンジ フィルターザルトリウス16534 K
ニコン機器顕微鏡 タイプ A 浸漬油 A、8ccニコンMXA20233
顕微鏡スライド 76 x26、3 インチ x 1 インチ x 1mmサーモフィッシャーサイエンティフィック421-004ET
#0 カバースリップスライド 24x60サーモフィッシャーサイエンティフィック/メンツェルBNBB024060A0
オービタルシェーカーM.R.CTOU-50
ホットブロックM.R.C
VortexFried Electric CompanyG-560-E
マイクロ遠心分離機エッペンドルフ5427R
遠心分離機エッペンドルフ5810R
携帯用Pipet援助 XP2、ピペット コントローラードラモンド サイエンティフィック カンパニー4-000-501-I
OD600 細菌の成長速度のための分光光度計 DiluPhotometerMidsciOD600-10
iXon X3 EMCCD カメラAndorDU-897E-CS0-#BV
Eclipse Ti 顕微鏡NikonMEA53100
CFI プランアポクロマート DM 100X オイル対物レンズ ラムダ PH-3 N.A 1.45 WD 0.13ニコンMRD31905
フィルターセット (TRITC/CY3): EX - ET545/30X;EM - ET620/60M;BS-T570LPニコン49005
フィルターセット(CY5):EX-ET640 / 30X;EM - ET690/50M;BS - T660PNikon49009
Nis-elements AR自動保存ソフトウェアNikonMQS31000
STORM顕微鏡VutaraSR-200
NA 1.2 水浸 対物レンズ >Olympus
SRX画像取得および分析ソフトウェアVutara
Evolve 512 EMCCDカメラフォトメトリクス
Stellaris®FISHプローブ、CAL Fluorによるカスタムアッセイ®赤590染料Biosearch Technologies IncSMF-1083-5
Probe Sequence for galK mRNA:
gtgttttttctttcagactc
tagccaaatgcgttggcaaa
ctgaatggtgtgagtggcag
caccaatcaaattcacgcgg
acgaaaccgtcgttgtagtc
tgataatcaatcgcgcaggg
gtggtgcacaactgatcacg
acgcgaactttacggtcatc
gctgttttcataatcggct
gcatcgagggaaaactcgtc
gttttcatgtgcgacaatgg
cacgccacgaacgtagttag
ttacgcagttgcagatgttt
tccagtgaagcggaagaact
tgctgcaatacggttccgac
gtccagcggcagatgataaa
agcctacaaactggttttct
gcggaaattagctgatccat
aaggcatgatctttcttgcc
cagtgagcggcaatcgatca
tgggcatggaaactgctttg
gatgatggacacagccacac
gggtacttgaagttactg
gtgttgtattcgctgccaac
ggtttcgcactgttcacgac
tggctgctggaagaaacgcg
ttcaatggtgacatcacgca
ggcgtttctcgtcagtatat
atacgtttcaggtcgccttg
tgagactccgccatcaactc
gaaatcatcgcgcatgcatgagg
caatttgcggcacggtgatt
ttgacgatttctaccagagt
acctttgtcgccaatcacag
ggatcagcgcgacgatacag
atattgttcagcgacagctt
gtctctttaatacctgtttt
ctccttgtgatggtttacaa
ステラリス®FISHプローブ、クエーザーフルオッソによるカスタムアッセイ®Red 670 DyeBiosearch Technologies IncSMF-1083-5
Probe Sequence for sodB mRNA:
gtgttttttctttcagactc
tagccaaatgcgtgttggcaaa
ctgaatggtgtgagtggcag
caccaatcaaattcacgcgg
acgaaaccgtcgttgtagtc
tgataatcaatcgcgcaggg
gtggtgcacaactgatcacg
acgcgaactttacggtcatc
gctgttttcataatcggct
gcatcgagggaaaactcgtc
gttttcatgtgcgacaatgg
cacgccacgaacgtagttag
ttacgcagttgcagatgttt
tccagtgaagcggaagaact
tgctgcaatacggttccgac
gtccagcggcagatgataaa
agcctacaaactggttttct
gcggaaattagctgatccat
aaggcatgatctttcttgcc
cagtgagcggcaatcgatca
tgggcatggaaactgctttg
gatgatggacacagccacac
gggtacttgaagttactg
gtgttgtattcgctgccaac
ggtttcgcactgttcacgac
tggctgctggaagaaacgcg
ttcaatggtgacatcacgca
ggcgtttctcgtcagtatat
atacgtttcaggtcgccttg
tgagactccgccatcaactc
gaaatcatcgcgcatgcatgagg
caatttgcggcacggtgatt
ttgacgatttctaccagagt
acctttgtcgccaatcacag
ggatcagcgcgacgatacag
atattgttcagcgacagctt
gtctctttaatacctgtttt
ctccttgtgatggtttacaa
寿命ポリ tgaccgttaagcgcgatttg catgcgcaacaccaaccgttgaac tgaccgttaagcgcgatttg catgcgcaacaccaaccgttgaac

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).
  2. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single molecule FISHE coli mRNA labelingvisualizationFluorescent oligonucleotide probesBacterial cell fixationPermeabilization protocolHybridization bufferAgarose gel mountingFluorescence microscopySTORM imaging

Related Articles