方法論記事

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

DOI：

10.3791/56600

⸱

2017年12月21日

 ,  , 
1Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA 分子の定量化を可能にする可視化手法です。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

固定細菌エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光の使用のための個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書をラベル付けアルゴリズムを述べる。smFISH では、興味の遺伝子の mRNA のコピーの数の細胞間の可変性の測定として、転写産物の細胞内局在をことができます。主な手順は、細菌の細胞培養の固定、細胞膜の透過および市販の短い蛍光標識したオリゴヌクレオチド プローブのセットとターゲットの転写産物の交配です。smFISH は、異なる蛍光マーカー間スペクトルの重なりによって課された制限と同じ細胞の複数の遺伝子の転写産物のイメージングを許可できます。下図のプロトコルが完了した後、低輝度蛍光に適したカメラと組み合わせて顕微鏡を用いた細胞が容易にイメージ化します。位相コントラスト フレームの分割細胞膜が染色から得られたセルの輪郭と共に、これらのイメージは、オープン ソースまたはカスタム作成されたソフトウェアを使用して細胞のサンプルの mRNA のコピー数の分布の計算を許可します。ここで説明したラベリング法を確率論的光再建顕微鏡 (嵐) イメージを成績証明書に適用もできます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

確率は遺伝子発現の基礎的、やむを得ない面であり、細胞多様性1、両方の成績証明書および蛋白質の2,の3レベルに上昇を与えます。明確に定義された条件の下でセル間変動の定量化は、遺伝子の発現とその制御の根底にある基本的なプロセスに、ユニークなウィンドウを提供しています。細菌における細胞多様性の 1 つの重要な源は、転写レベルで行われます。成績証明書番号は、転写、転写プロセス調節などにも確率のためだけではなくを小さな Rna と RNAases2によって異なります。定量的な方法で多様性に直接アクセスする方法の 1 つは、蛍光 smFISH のある特定の遺伝子の個々 の成績証明書を付けることです。この方法では、検出と特定の RNA の分子の細胞内局在性固定、個々 の細菌細胞4をことができます。利息5,6のトラン スクリプトに選択的に結合するように設計、蛍光標識 〜 20 拠点長のオリゴヌクレオチドのセットを持つ Mrna を交配します。複数のラベル付けにより、上記のバック グラウンド蛍光検出と個々 の mRNA 分子は、回折限界のスポットが蛍光顕微鏡7 (参照してください図 1) として表示されます。相補的なオリゴマー プローブが二次蛍光標識した記者のテクニック8を使用して検出されます共役の皮膚 (例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニン) を運ぶ mRNA 分子の分類のための他のアプローチがあります。

SmFISH に加えて成績証明書についての定量的な情報を提供する他の方法があります。北など、いくつかのしみまたは量的な PCR の大部分をプローブし従って mRNA のコピーの数も個々 の細胞内での位置を測定できます。これらのメソッドは細胞間変動の定量化に適していません。呼ばれる、細胞内の場所と同様、両方の細胞内 Rna のコピー数の定量誤差に頑健な蛍光の in situハイブリダイゼーション (MERFISH) を多重化できる最近イメージ ベースの技術を開発しました。MERFISH は、蛍光標識したオリゴヌクレオチド プローブの固定数から定義された組み合わせから成る一意のバーコードの割り当てに基づいています。これらのバーコードで読み取られ、smFISH 測定の連続ラウンド、退色と各次の交配、それにより 2 桁の9,10によってスループットの向上のラウンドします。このテクニックは、自動液体処理システムおよびプローブ セットの適切な設計を必要とします。

確率光再建顕微鏡 (嵐)11など小説の超解像技術と個々 のトラン スクリプトの複数蛍光標識の組み合わせにより、十倍の解像度で、転写産物の細胞内局在。嵐、蛍光プローブとイメージングのバッファーの適切な組み合わせは、(点滅) プローブ分子あたりの蛍光性の放出の複数のサイクルをできます。嵐は、大腸菌トランスクリプトームのイメージし、関心12の同時にすべての転写産物の分類によって rna のゲノム広い空間組織を観察にも使えます。

上記のレビューすべての単一細胞方法は固定細胞の転写物をイメージングに基づいています。それ故に、彼らは細胞内での転写産物の動力学的性質に関する情報を提供しません。生きているセル13成績証明書に従う、Mrna を結合部位の配列への興味の遺伝子の融合によるラベルことができます。これらの後者は、バクテリオファージ MS2 のコート蛋白質、緑色蛍光タンパク質 (GFP)10,14,15などの蛍光タンパク質を融合したなどの RNA 結合蛋白質によって認識されます。

ここで大腸菌で特に蛍光標識 DNA プローブ、smFISH 実験で使用するためのセットを個々 の mRNAs をラベリングの手法について述べる。さらに、マイナーな修正と嵐測定用同じラベル付けスキームが紹介します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. プローブの設計

注: このプロトコルは、すでに fluorophores が付いているタグ付き市販オリゴヌクレオチド プローブを使用します。プローブは、ターゲットに相補的な特定のシーケンスのセットで構成されます mRNA、各プローブの単一蛍光分子に活用されています。また、5,16を他の場所で説明されているようにプローブ、蛍光マーカーを付けることが可能です。

  1. アルジュン ラージュ (Oudenaarden 研究所、マサチューセッツ工科大学・ ヴァン); によって開発されたプローブ デザイナー16アルゴリズムを用いた設計 smFISH プローブこの原稿で使用される smFISH プローブのシーケンスは、材料の表に記載されています。
    注: 最小検出可能なシグナルのセットでプローブ数は 30 ~ です。正確な数は、非常に短い転写産物を測定した場合に特に興味の遺伝子によると異なる場合があります。
  2. 光セットアップに合った染料を選択 (材料の表を参照)。
    注: Cy3 染料または写真漂白剤に感受性の低い光学同等の色素強くお勧めします。デュアル ラベルの候補は cy5 の組合せまたは光学同等 (材料の表を参照) を染めます。ラベル付けされた mRNA の嵐イメージングのための適切な染料は蛍光性の放出の複数のサイクルのための能力によって特徴付けられます。いくつかの smFISH の染料を使用することができます嵐画像 (材料の表を参照)。同じセルに異なる遺伝子に対応する 2 つ (以上) の議事録をイメージするには、染料のほとんど、あるいは全く重複しているスペクトルに共役オリゴヌクレオチド プローブを選択するべきです。

2. 試薬の準備

注: フィルター処理されたピペット チップ、チューブなどの消耗品の RNase フリーによる RNAse フリー サンプルを保つために、あらゆる作業環境を清潔に保つことが重要です。ヌクレアーゼ フリー ターゲット コピーの劣化を避けるためには、次のセル固定使用すべての試薬がある必要があります (材料の表参照) またはジエチルピロカーボネート (DEPC)-扱われ、滅菌します。

  1. SmFISH 用のバッファー
    1. RNase フリー 1 × PBS (リン酸緩衝生理食塩水, 0.01 M のリン酸バッファー濃度 (pH 7.4) 0.154 M の塩化ナトリウム濃度とソリューション) を準備します。RNase フリー 10 x PBS を希釈 (材料の表参照) ヌクレアーゼ フリー水 (材料の表を参照)、1:10 で v/v の比。
      1. また準備 DEPC 処理 1 × PBS。
    2. RNase フリーの準備 2 x SSC (生理食塩水ナトリウム クエン酸バッファー (pH 7.0) クエン酸ナトリウム 0.03 M で 0.3 M の NaCl)。RNase フリー希釈 20 x SSC (材料の表を参照)、1:10 でヌクレアーゼ フリー水で v/v の比。
      1. また、DEPC 処理 2 を準備 x SSC。
  2. オリゴヌクレオチド プローブ原液。
    1. 25 μ M のプローブ株式を作成する TE バッファー (10 mM トリス-HCl は、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) の 200 μ L の乾燥したオリゴヌクレオチド プローブ ブレンドを再溶解で上下にピペッティングし渦と遠心分離機を簡単に混ぜる。
    2. 凍結しを貯蔵液チューブの固定の解除を避けるためには、単一の実験的実行で使用する予定の残高に対応する原液のいくつかの因数を作る。原液-20 ° C で以下を保存し、光から保護します。
      注: 5 nmol のプローブ セットは、最大 250 のハイブリダイゼーション反応を提供できます。
  3. (スキナーら次の交配バッファー7 ):
    1. ヌクレアーゼ フリー水を 5 mL を 50 mL ポリプロピレン円錐底部チューブに追加します。デキストラン硫酸の 1 g を水に加えるし、積極的なボルテックスによって解散。(30 分程度) に泡が消えるまでは、軌道のシェーカーの内容をミックスします。
    2. ソリューション 3,530 μ L の脱イオン ホルムアミド、エシェリヒア属大腸菌の tRNA の 10 mg の 20 x SSC 1 mL、200 mM リボヌクレオシド バナジル錯体の 100 μ L、50 Mg/ml BSA の 40 μ L に追加します。DEPC 処理水やヌクレアーゼ フリー水の添加により 10 mL に最終巻を持参し、渦までソリューションが均質。
      メモ: ソリューションの雪解けから凍結を避けるために、単一の実験的実行で使用する予定の残高に対応する原液のいくつかの因数をください。-20 ° C で原液を保存します。必ずボトルを開封前に暖かい室温のホルムアミドをしましょう。背景を減らすためは、最適なホルムアミド濃度 (10-40 %v/v 比) を調整することをお勧めします。
      注意:警告!ホルムアミド、毒性や催奇形物質知られています。目や皮膚、吸入または摂取との接触を避けてください。実験用の上着と手袋を着用しながらヒューム フードの下でそれを処理します。
    3. ソリューションを滅菌するには、0.22 μ m フィルターを通過します。因数で維持し、1 年間に-20 ° C で保管します。
  4. 1 × PBS に 37% ホルムアルデヒド (v/v) を追加することによって固定バッファー (1 × PBS で 4.6% ホルムアルデヒド) を準備 (2.1.1 参照) 1:8 v/v 比と渦で。
    注意: 警告!ホルムアルデヒドは非常に有毒な既知の発癌物質。実験用の上着と手袋を着用しながらヒューム フードの下でそれを処理します。
  5. SmFISH の洗浄バッファーを準備 (2 の 20% ホルムアミド x SSC) 脱ホルムアミドを 2 に追加することによって x SSC (2.1.2 参照) 1:4 v/v 比と渦。
  6. 5 mM システアミンと酸素スカベン ジャー (グルコース 10% (w/v)、56 nM カタラーゼ、7 μ M グルコースオキシダーゼ) バッファーを洗浄するを追加することによって smFISH の画像バッファーを準備 (20% ホルムアミド 2 x SSC)
  7. 嵐のためのバッファー
    1. ヌクレアーゼ フリー水にトリス塩酸 50 mM と 10 mM の NaCl を追加する A のバッファーを準備します。
      注: 店は年のための RT。
    2. ヌクレアーゼ フリー水にブドウ糖 50 mM 10%、10 mM の NaCl、トリス-HCl w/v を追加することによってバッファー B を準備します。
      前年まで 4 ° c 注: ストア。
    3. MEA バッファーを準備するには、1 mL のバッファー A (1 M 溶液になります) で 77 mg システアミンを溶解します。
      注意: それが 1 ヶ月 4 ° C で保存することができます。
    4. 8,440 AU (任意の単位) ブドウ糖酸化酵素を追加することによって Gloxy バッファーを準備し、1 ml 70,200 AU カタラーゼ バッファー a.
      注: 50 x 貯蔵液は、1 ヶ月の 4 ° C で格納できます。
    5. MEA バッファーと Gloxy バッファー B. x 1 の 50 ミリメートルを追加することによって嵐の画像バッファーを準備します。
      注: 嵐の画像バッファーは 5 mM システアミン、酸素スカベン ジャー (7 μ M グルコースオキシダーゼと 56 nM カタラーゼ) で 50 mM の 10 mm NaCl、トリスと ph 8.0 10% ブドウ糖で構成します。イメージングの直前準備、格納および常温約 2 時間使用できます。

3. サンプル固定

  1. (例えば、大腸菌の細菌のセルを成長します。
大腸菌 MG1655) 260 rpm および 37 ° C で一晩伊南軌道シェーカーを選択 (例えばLB 培地) の成長媒体で
注: プローブの非特異的結合によるバック グラウンドを決定するには、興味の遺伝子が削除されたひずみの測定を実行する (で図 1と Δ のsodBの Δ のgalkを参照してください同様の手順図 2)。
  • 新鮮な培地で一晩培養 1: 100 を希釈し、分光光度計の値が 0.2 - までのすべての ~ 1 h 単位の光学濃度 (OD600) 0.4;4 mL 文化は十分なはずです。
    注: 選択した顕微鏡に位相差、微分干渉コントラスト機能を持たない場合大腸菌外膜がでラベル付けできます 2 μ M の親油性蛍光マーカー (材料の表を参照) に追加する必要があります、細菌懸濁液固定17前に 20 分。固定し、さらに治療には、以下のよう実行されます。ラベル プローブ セットとスペクトルの重複を最小限に抑えるための異なる発光スペクトルを有する蛍光マーカーを選択するには、注意が必要です。
  • 4 ° C で 4,500 g で 5 分間遠心分離によるペレット細胞すべてのチューブから上澄みを削除します。
  • 各管に 1 mL の 1x PBS を追加し、セルに集計を最小限に抑えるためにペレットを再懸濁します。優しく固定バッファーおよび渦の 4 mL を加えます。
  • 24 の ° C で 30 分間 260 rpm で軌道シェーカーのサンプルをインキュベートします。
  • 10 分、1,000 g、4 ° C の遠心分離によって細胞をペレット上清を除去します。1 mL の 1x PBS を追加します。
  • (材料の表参照) 1.8 μ L 円錐形底マイクロ遠心チューブに懸濁液を転送し、手順 3.6 回。

    • 4. サンプル透過

    1. 非常に慎重に上清を除去します。必要に応じて、ペレットの外のすべての液体を除去する少量のピペットを使用します。
    2. 300 μ L の DEPC 処理水やヌクレアーゼ フリー水で再懸濁します。350 μ L 高品位無水エタノール (99%) を追加、チューブを反転して軽く混ぜます。エタノールとミックス再び、最終的なエタノール濃度 70% (v/v 比) に到達するための別の 350 μ L を追加します。
      注意: 警告!エタノールは可燃性です。
    3. 室温 (RT) で 1 時間 20 rpm でチューブの回転子とサンプルを回転または、4 ° C で一晩します。サンプルは、1 週間 4 ° C で保存されるかもしれない。

    5. 交配

    1. 7 分, 750 x g, 4 ° C の遠心分離によって細胞をペレットします。上清を除去します。
    2. 1 mL 20% 洗浄バッファーのサンプルへと休暇が数分、またはペレットを完全に溶解するピペットの立っている追加します。
    3. 750 x g、4 ° C での 7 分間の遠心分離によって細胞をペレット
    4. 非常に軽くピペッティングによる上清を削除します。ペレットの外のすべての液体を削除する必要がある場合は、少量ピペットを使用します。
    5. オリゴヌクレオチド プローブ セットに原液交配バッファー因数にして最終的なオリゴヌクレオチド濃度が 250 を追加 nM。渦精力的に。
      注: 同一のセルに一度に 2 つ以上の異なるターゲット Mrna のラベルを 1 つできます。交配バッファーに両方のターゲットのプローブ セットを追加します。(例えば、Cy3 および cy5 の組合せ) のスペクトル重複を最小限に抑える別の発光スペクトルを有する染料を選択するには、注意が必要です。嵐イメージング用サンプルが嵐 (例えば材料のテーブルで) 適切な染付共役設定オリゴヌクレオチド プローブとハイブリダイズがいることを確認します。
    6. (ソリューションはかなり粘性) の泡の生成を回避しながらのオリゴヌクレオチド プローブを含む 50 μ L 交配バッファーのサンプル (ステップ 5.4 を参照してください) を中断します。
    7. 暗闇の中で 30 ° C でホット ブロックのサンプルを一晩残します。
      注: 次に、サンプルが格納される 4 ° C で最大 6 ヶ月間

    6. 洗濯

    1. 各サンプル画像を 1 つの新しい遠心管を使用します。1 mL 洗浄バッファーを追加します。
    2. 洗浄バッファーとミックス/渦を含む新しいチューブにハイブリダイズしたサンプルから 10-15 μ L を追加します。
    3. 7 分間の遠心分離、4 ° C で 750 x g 細胞をペレットします。上清を除去します。
      注: を背景を減らすためには、30 ° C で 1 時間インキュベートします。
    4. 洗って 2 回以上 (1 mL 洗浄バッファーで再懸濁します、遠心分離機およびペレットを削除) します。
    5. 25 μ L の洗浄バッファーの再懸濁します。
      注: 1 つの光退色を低減するために追加できます洗浄バッファー清掃システム (2.6) 単一分子蛍光実験6で色素の安定性を改善するために酸素。

    7. イメージング用試料の調製

    注: セルは蛍光・位相差顕微鏡の下で適切なイメージングを可能にするために固定する必要があります。次のメソッドは、ビューの別のフィールドを別の焦点面で視覚化されるサンプルを準備する使用できます。

    1. Agarose のゲルの準備
      1. 150 mg アガロースを 10 mL 2 x SSC バッファーに追加します。2 を追加しないでくださいそれか、アガロース、x SSC は正しく分解しません。
      2. 電子レンジ 10-15 s たびに大きな気泡が形成し始めるまで。脇を設定すると、数分間冷却します。
      3. スライドの中央のまま公開されているので、スライドに分けるシリコン フレームを配置します。
      4. スライドの中央に 10 mm 幅 (1-2 mm 厚) 剛体円環を置き、封止するのため、ゲルの少量を入金します。強化するために数分を待ちます。
      5. 高いドーム形状を形成するまでより多くのゲルを追加します。(高級ピンセットまたはその他のメソッドを使用して) リングを削除して、セキュリティを強化する 10 分を待ちます。
      6. ゲルとシール #0 coverslip スライドの上の洗浄の細菌セル (6.5 参照) の ~ 10 μ L を入金します。
    2. SmFISH の商工会議所のサンプル準備
      1. 別の方法として (手順 7.1) にポリ D リジン コーティング ガラス下部使い捨てプラスチック シャーレに洗った細菌細胞 (6.5 参照) を固定化したイメージ用サンプルを準備します。
      2. 常温で一晩表面に対する細胞の接着できるように可視化する前に、暗闇の中でサンプルをインキュベートします。可視化の前に洗浄バッファーで 1 回洗浄 (. 5);smFISH (2.6) の洗浄 buffer(2.5) またはイメージング バッファーと濡れているサンプルを保ちます。
    3. 嵐のため商工会議所サンプル準備
      1. ポリ D リジン コーティング ガラス下部使い捨てプラスチック シャーレにイメージングのための嵐のためのサンプルを準備します。
      2. 常温では、暗闇の中のサンプルを一晩インキュベートします。SmFISH (2.5); の洗浄バッファーで可視化洗浄を一度前に嵐 (2.7.5) の画像バッファーを追加します。

    8。トラン スクリプトの可視化

    1. 電動ステージを搭載した広視野蛍光顕微鏡で細胞をイメージ (材料の表を参照)。
      注: 嵐変更、染料の蛍光性の放出の複数のサイクルのことができるラベルの付いたセルを使用します。3 D 超解像イメージング システムを使用してサンプルの画像 (例えば材料の表を参照してください)。
    2. 使用 (推奨)、60-100 N.A x >; メタルハライド ランプや水銀などの強い光源との 1.3 油浸漬位相コントラスト対物レンズLED ベースの光のソースがおすすめ。
    3. 使用標準的な冷却 CCD カメラ、理想的な速度よりは低光レベルのイメージング (16 μ m ピクセル サイズでカメラを使用) ために最適化 (材料の表を参照)。
      注: 使用冷却 EMCCD (電子電荷結合素子を乗算) のカメラ CCD カメラ特に単一分子の検出を防ぐ熱ノイズを低減する必要があります。
    4. 選ばれた fluorophores の適切なフィルターを使用するを設定します。
    5. セルの境界を確認正しく、段階の対照の光学、または外側の細胞膜の蛍光ラベル化による各サンプルの別の視野の画像を取得します。すべてのチャネルのための異なる焦点面 (z) で画像を取得 (通常 13 スライスで区切って 250 nm が取られる)。
      注: 顕微鏡とフィルター セットのモーターを備えられた段階は商業によって制御されるべき (材料の表参照) またはシーケンス内の画像のスタックをキャプチャすることが社内のソフトウェア。

    9. データの分析

    1. 画像のスタックをデータ解析に適した形式に変換します。
    2. ターゲットのコピー数を見積もる mRNA 他の現在利用可能なプロトコルのように離散 'スポット' をカウントではなく細胞内蛍光巣の合計強度から。
    3. オープン ソース ・ ソフトウェア18またはカスタム プログラムで画像解析を実行します。データ画像や分析の詳細は、スキナーらを参照してください。7

    アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    結果

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    SmFISH大腸菌の細胞の galK と sodB の転写物の測定を行った。成績証明書は、単一蛍光分子に共役されて各プローブ ターゲット シーケンスに補足特定のシーケンスのセットで交配させられた (資料の表を参照)。蛍光・位相コントラスト画像 MG1655 野生型の大腸菌の菌株 (WT) または JW0740 (慶應義塾コレクション)19 galK 削除ひずみ (ΔgalK) は、D-フコースは、図 1 aおよび1 bに示すように 2 mM にさらされました。セルは、D-フコースへの暴露後少なくとも 3 時間を修正しました。図 1A (top) でパネル表示セルの輪郭が細胞外 D フコース濃度変数への応答におけるgalK誘導レベルを表す、フォーカスには高さに対応する 13 のうち 1 つのフレームです。...

    アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    ディスカッション

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    当研究室で smFISH メソッド2を使用してE. 大腸菌細胞の異なる遺伝子のコピー数で測定しました。簡単に言えば、この手順は次の手順で構成されています: セル固定、プローブの浸透を可能に膜の透過プローブの交配、そして標準的な蛍光顕微鏡を用いたイメージングのサンプルします。この手順は、いくつかの変更6,7,16以前に発行されたものに基づいています。その smFISH はオリゴヌクレオチド プローブの数が背景7の上にも横になっている信号を達成するために 48-72 の範囲である必要があります以前報告されています。私たちは、この番号は興味、光のセットアップ、および特定の実験条件の遺伝子シーケンスに応じて、実際には小さく20ことを示しています。

    アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    開示事項

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    著者が明らかに何もありません。

    謝辞

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    この作品は、(バッハ) にイスラエル科学技術振興財団助成金 514415 と (バッハ) に BSF NSF (MCB) グラント 2016707 によって支えられました。ジークフリートとイルマ ウルマン (バッハ) 教授の椅子はまた認めたからサポートします。

    アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    デキストラン硫酸ナトリウム塩Sigma-AldrichD8906
    純エタノール、99.5%、ACS 試薬、絶対Mallinckrodt Baker - Avantor8025.25
    ジエチルピロカーボネート (DEPC)Sigma-AldrichD5758
    RNase-free 20X SSCLife Technologies/AmbionAM9763
    RNase-free 10X PBSLife Technologies/AmbionAM9625
    TE バッファー (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, 分子生物学用Sigma-Aldrich93283
    ヌクレアーゼフリー水Thermo Fisher Scientific10977035
    分子生物学用ホルムアルデヒド溶液, 36.5-38% 水中Sigma-AldrichF8775
    脱イオンホルムアミド, ヌクレアーゼフリーThermo Fisher Scientific/AmbionAM9342
    大腸菌tRNA(リボ核酸、大腸菌由来xx型転写)Sigma-AldrichR1753-500UN
    UltraPure BSA (50mg/ml)サーモフィッシャーサイエンティフィック/アンビオンAM2616
    バナジル-リボヌクレオシド複合体、VRC、200 mMニューイングランドバイオラボS1402S
    ポリ-L-リジンSigmaP4707
    システアミンと酸素Sigma-Aldrich30070
    アスペルギルス・ニジェールのグルコースオキシダーゼ、VII型、50KUシグマ・アルドリッチG2133
    カタラーゼシグマ・アルドリッチC40
    D-グルコースシグマ・アルドリッチG8270
    D-フコースシグマ・アルドリッチF8150
    Vybrant DiO細胞標識溶液テクノロジーV2286
    アガロース、低融点試薬Sigma-AldrichA9414
    接着シリコーンアイソレーター 直径24-2mm×深さ1.8mm JTR24R-A2-2.0Grace Bio-LabsJTR24R-A2-2.0<スパン> 666208
    D-リジンコーティングガラス底 ガラス底培養皿マットテック株式会社P35GC-1.5-14-C
    スーパーライフニトリルパウダーフリー検査用手袋スーパーマックスTC-N-9889
    ブランド滅菌インキュベーターテープSigma-AldrichBR61750
    微量遠心チューブ (1.8 ml)Axygen - Corning Life SciencesMCT-175C
    Falcon 丸底ポリプロピレンチューブ (14 ml)BD Biosciences352059
    円錐底遠心分離ポリプロピレンチューブ (50 ml)Corning430828
    Serological pipettes (Corning 5 ml)Corning Life Sciences4051
    Serological pipettes (Corning 10 ml)Corning Life Sciences4488
    Serological pipettes (Corning 25 ml)Corning Life Sciences4251
    分光光度計キュベットSarstedt67.742
    RNaseフリーピペットチップ 0.2 - 20 μlFroggaBioFT20
    RNaseフリーピペットチップ 10 - 200 μlAxigene/corningTF-200
    RNaseフリーピペットチップ 100 - 1000 μlFroggaBioFT1000
    RNaseフリーピペットチップ 100 - 1000 μlソレンソン14200
    シリンジ ディスポジ 10 mL ニードル G-21ベクトン ディキンソン、バイオサイエンスBD-309643
    Minisart 0.2 um シリンジ フィルターザルトリウス16534 K
    ニコン機器顕微鏡 タイプ A 浸漬油 A、8ccニコンMXA20233
    顕微鏡スライド 76 x26、3 インチ x 1 インチ x 1mmサーモフィッシャーサイエンティフィック421-004ET
    #0 カバースリップスライド 24x60サーモフィッシャーサイエンティフィック/メンツェルBNBB024060A0
    オービタルシェーカーM.R.CTOU-50
    ホットブロックM.R.C
    VortexFried Electric CompanyG-560-E
    マイクロ遠心分離機エッペンドルフ5427R
    遠心分離機エッペンドルフ5810R
    携帯用Pipet援助 XP2、ピペット コントローラードラモンド サイエンティフィック カンパニー4-000-501-I
    OD600 細菌の成長速度のための分光光度計 DiluPhotometerMidsciOD600-10
    iXon X3 EMCCD カメラAndorDU-897E-CS0-#BV
    Eclipse Ti 顕微鏡NikonMEA53100
    CFI プランアポクロマート DM 100X オイル対物レンズ ラムダ PH-3 N.A 1.45 WD 0.13ニコンMRD31905
    フィルターセット (TRITC/CY3): EX - ET545/30X;EM - ET620/60M;BS-T570LPニコン49005
    フィルターセット(CY5):EX-ET640 / 30X;EM - ET690/50M;BS - T660PNikon49009
    Nis-elements AR自動保存ソフトウェアNikonMQS31000
    STORM顕微鏡VutaraSR-200
    NA 1.2 水浸 対物レンズ >Olympus
    SRX画像取得および分析ソフトウェアVutara
    Evolve 512 EMCCDカメラフォトメトリクス
    Stellaris®FISHプローブ、CAL Fluorによるカスタムアッセイ®赤590染料Biosearch Technologies IncSMF-1083-5
    Probe Sequence for galK mRNA:
    gtgttttttctttcagactc
    tagccaaatgcgttggcaaa
    ctgaatggtgtgagtggcag
    caccaatcaaattcacgcgg
    acgaaaccgtcgttgtagtc
    tgataatcaatcgcgcaggg
    gtggtgcacaactgatcacg
    acgcgaactttacggtcatc
    gctgttttcataatcggct
    gcatcgagggaaaactcgtc
    gttttcatgtgcgacaatgg
    cacgccacgaacgtagttag
    ttacgcagttgcagatgttt
    tccagtgaagcggaagaact
    tgctgcaatacggttccgac
    gtccagcggcagatgataaa
    agcctacaaactggttttct
    gcggaaattagctgatccat
    aaggcatgatctttcttgcc
    cagtgagcggcaatcgatca
    tgggcatggaaactgctttg
    gatgatggacacagccacac
    gggtacttgaagttactg
    gtgttgtattcgctgccaac
    ggtttcgcactgttcacgac
    tggctgctggaagaaacgcg
    ttcaatggtgacatcacgca
    ggcgtttctcgtcagtatat
    atacgtttcaggtcgccttg
    tgagactccgccatcaactc
    gaaatcatcgcgcatgcatgagg
    caatttgcggcacggtgatt
    ttgacgatttctaccagagt
    acctttgtcgccaatcacag
    ggatcagcgcgacgatacag
    atattgttcagcgacagctt
    gtctctttaatacctgtttt
    ctccttgtgatggtttacaa
    ステラリス®FISHプローブ、クエーザーフルオッソによるカスタムアッセイ®Red 670 DyeBiosearch Technologies IncSMF-1083-5
    Probe Sequence for sodB mRNA:
    gtgttttttctttcagactc
    tagccaaatgcgtgttggcaaa
    ctgaatggtgtgagtggcag
    caccaatcaaattcacgcgg
    acgaaaccgtcgttgtagtc
    tgataatcaatcgcgcaggg
    gtggtgcacaactgatcacg
    acgcgaactttacggtcatc
    gctgttttcataatcggct
    gcatcgagggaaaactcgtc
    gttttcatgtgcgacaatgg
    cacgccacgaacgtagttag
    ttacgcagttgcagatgttt
    tccagtgaagcggaagaact
    tgctgcaatacggttccgac
    gtccagcggcagatgataaa
    agcctacaaactggttttct
    gcggaaattagctgatccat
    aaggcatgatctttcttgcc
    cagtgagcggcaatcgatca
    tgggcatggaaactgctttg
    gatgatggacacagccacac
    gggtacttgaagttactg
    gtgttgtattcgctgccaac
    ggtttcgcactgttcacgac
    tggctgctggaagaaacgcg
    ttcaatggtgacatcacgca
    ggcgtttctcgtcagtatat
    atacgtttcaggtcgccttg
    tgagactccgccatcaactc
    gaaatcatcgcgcatgcatgagg
    caatttgcggcacggtgatt
    ttgacgatttctaccagagt
    acctttgtcgccaatcacag
    ggatcagcgcgacgatacag
    atattgttcagcgacagctt
    gtctctttaatacctgtttt
    ctccttgtgatggtttacaa
    寿命ポリ tgaccgttaagcgcgatttg catgcgcaacaccaaccgttgaac tgaccgttaagcgcgatttg catgcgcaacaccaaccgttgaac

    参考文献

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).
    2. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
    3. Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
    4. van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523(2016).
    5. Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
    6. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
    7. Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
    8. Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628(2014).
    9. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
    10. van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
    11. Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
    12. Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
    13. Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
    14. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
    15. Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
    16. So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
    17. Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
    18. Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
    19. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8(2006).
    20. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
    21. Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).

    アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    再版と許可

    このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

    許可をリクエスト

    タグ

    Single molecule FISHE coli mRNA labelingvisualizationFluorescent oligonucleotide probesBacterial cell fixationPermeabilization protocolHybridization bufferAgarose gel mountingFluorescence microscopySTORM imaging

    関連記事