方法論記事

流体の尾静脈注射を使用してマウス肝細胞の生体内で遺伝的変更の構成および誘導システム

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DOI：

10.3791/56613

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2018年2月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine II, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Pneumology, Center for Medicine, Medical Center University of Freiburg

この記事について

サマリー

トランスポゾン ベースの統合のベクトルの流体尾静脈注射によりマウス肝細胞の安定したトランスフェクション体内。長期的な単一遺伝子の発現や遺伝子や肝臓でミール shRNA の組み合わせ構成とドキシサイクリン誘導式ことができますトランスフェクション システムの実用的なプロトコルを紹介します。

要約

肝臓癌や再生、炎症、線維症の研究モデル、生体内で遺伝子発現と沈黙のための柔軟なシステムは非常に便利です。トランスポゾンによる構造の流体尾静脈注射は、成体マウスの肝細胞の遺伝的操作のための効率的な方法です。構成遺伝子発現、に加えてこのシステムは shRNA を介した遺伝子ノックダウン、含意の遺伝子の突然変異誘発に CRISPR/Cas9 システム誘導システムより高度なアプリケーションで使用できます。ここでは、transgene の発現とともにクレエ発現の組み合わせ、または選択のミール shRNA はこの技法の例として提示されます。我々 は眠れる森の美女の準備から始まってマルチ ステップの手順をカバー-トランスポゾン構築、注入とマウスの治療と肝組織の分析のための準備をしています。紹介システムは、肝細胞の複雑な遺伝的操作を達成するために信頼性の高いかつ効率的なアプローチです。具体的にはマウス系統の Cre/loxP ベースとの組み合わせで役に立つ、さまざまな肝臓病の研究ではモデルに適用することができます。

概要

慢性肝疾患は、主要な健康負担世界1を提示します。動物の研究モデルは肝臓病の研究に不可欠なツール、肝再生、肝炎症脂肪肝と肝細胞癌2複雑な質問に答えることを助けた。これらの動物モデルの相当な数は肝細胞の遺伝子の組み換えに頼る。したがって、肝細胞における遺伝子発現を操作するための効率的なツールは、参考3。遺伝子組み換えマウス系統の繁殖や肝細胞感染のウイルスのベクトルの生成などの確立された方法はいずれかの時間がかかり、港安全性の懸念、または体内肝細胞遺伝子発現の低下をもたらす4,5. 流体尾静脈注射 (HTVI) は肝臓での遺伝子機能の簡単、高速、かつコスト効率の高い尋問を可能にする肝細胞の生体内でtransfection のための代替方法です。HTVI、生理食塩水注入された動物の体重の 10% に相当する量に必要な DNA シーケンスを運ぶベクターを溶解しています。ソリューションは、5-10 の6で尾静脈にそれから注入されます。心拍出量を超える場合、生理食塩水は下大静脈から肝臓の拡大と肝細胞7の流体のトランスフェクションにつながる、肝静脈に流れます。安定的なゲノムの統合を達成するためにメソッドは、トランスポゾンを用いたベクトルで寝ている美 -トランスポゾン システムなど結合されています。このシステムは、触媒による睡眠美容 -トランスポザーゼ8,9ゲノム再結合サイトとターゲット ベクトルの再結合を仲介します。肝線維症や発癌のモデル、それが疾患モデルの特定の時点で過剰または沈黙遺伝子に望まれます。この目的のための Cre/LoxP システムやテトラサイクリン誘導性の遺伝子発現系など誘引可能な遺伝子発現のツール (テトで) 使用される10があります。

ここでは、眠れるトランスポゾン ベースのシステムの HTVI を使用してマウス肝細胞の生体内でtransfection のためプロトコルについて述べる。タモキシフェン依存 Cre リコンビナーゼ (クレエ) 発現とを組み合わせてより高度なベクトル システムについて述べる肝特異プロモーターの制御下導入遺伝子の安定した、構成式のプロトコルに加えて、発現遺伝子のマイクロ Rna に適応した shRNA (ミール shRNA)、呼ばれる pTC テト システム11。このベクター システムの誘引可能な遺伝子またはテトラサイクリン発現のミール Shrna は過剰クローニング システム、新しいベクトル12の迅速かつ簡単の生成を許可するバックボーン ベクターにクローン作成します。このビデオ ベースのガイドには、遺伝子/ミール-shRNA 発現を達成するために適切なベクトル、注入およびマウスの治療の準備と最終的に肝組織の分析のための準備について説明します。このプロトコルで説明する方法は、式に Cre/loxP を介したマウス システムの組み合わせまたは肝臓病の研究に広く適用可能なシステムを作り、好みのあらゆる遺伝子のノックダウンを有効に設計されました。

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プロトコル

すべての動物実験管理と実験動物の使用のためのガイドラインに従って行われ、(Regierung ・ フォン ・ インゴルシュタット、ミュンヘン、ドイツとスタンフォード施設動物ケアおよび使用委員会の責任がある権限によって承認されました。スタンフォード、カリフォルニア州、米国)。(ステップ 4 で 1) のクローニングのためのすべてのプラスミドの一覧は、別表 S1 で提供されます。

1. 構成遺伝子発現の Transgene のクローニング

  1. 遺伝子増幅13,14のためのプライマーを設計します。
  2. 前方のプライマーの 5' 末端にパーチ (TTAATTAA) のための制限のサイトを追加します。逆のプライマーの 5' 末端にアスキー (GGCGCGCC) または FseI (GGCCGGCC) の制限のサイトを追加します。
  3. 目的遺伝子14のために最適化された条件を用いた PCR による遺伝子を増幅します。市販 DNA 精製キットを使用して浄化します。
    注: アニール時間手順 1.1 で設計したプライマーによって異なります。、伸長時間構造の長さによって異なります。たとえば、伸長時間の 1,000 bp 長さ使用 60 s の構造。
  4. 遺伝子とそれぞれの制限核酸 (ステップ 1.2 参照) と 37 ° C で 50 μ L の総ボリュームのバッファー構成遺伝子発現15のベクトルを一晩ダイジェストします。たとえば、ダイジェスト 5 単位パーチの構成体と 5 台 FseI 適切な場合 (手順 1.2 を参照してください)。
  5. ゲルは、消化されたベクトルと製造元の指示に従って商業ゲル抽出キットを使用しての挿入を浄化します。100 のベクトルの ng と 65 ° C で 10 分間 400 U T4 リガーゼ 14 ° C 16 h. 熱で不活化を使用しての挿入の 100-1,000 ng の標準的な結紮を行います。
  6. 標準的な熱衝撃プロトコル16を使用して有能な細菌を変換します。
  7. 寒天プレート プレート含む 100 μ g/mL アンピシリンに。30 ° C 24 時間で孵化させなさい。
  8. シングル コロニーをピックアップ、製造元の指示に従って商業 miniprep のキットを使用してプラスミッド DNA を浄化したサンガー シーケンス17シーケンスの確認 (配列のプライマー: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3')。
  9. 肯定的なマキシのコロニー プラスミド DNA の増幅をスケールおよび製造元の指示に従ってエンドトキシン プラスミド調製キット18を使用して浄化を使用します。
  10. 構造は注射の準備ができて、このように手順 5 に進みます。

2. 誘引可能な遺伝子発現の Transgene のクローニング

  1. 遺伝子増幅13,14のためのプライマーを設計します。
  2. 前方のプライマーの 5' 末端に SacI (GAGCTC)、SpeI (ACTAGT)、または KpnI (GGTACC) の制限のサイトを追加します。逆のプライマーの 5' 末端にノッティ (GCGGCCGC) または XhoI (CTCGAG) の制限のサイトを追加します。
  3. 目的遺伝子14のために最適化された条件を用いた PCR による遺伝子を増幅します。商業 DNA 精製キットを使用して浄化します。
  4. 精製の遺伝子やエントリ ベクトルの 4 μ g を消化 (pEN_TTmcs-ベクトル材料の表を参照してください)19個別に適切な制限核酸 (手順 2.2 参照) と 37 ° C 一晩で 50 μ L の総ボリュームのバッファー。
  5. ゲルは、消化されたベクトルと製造元の指示に従って商業ゲル抽出キットを使用しての挿入を浄化します。100 ng のベクトルの 65 ° C で 10 分間 400 U T4 リガーゼ 14 ° C 16 h. 熱で不活化を使用しての挿入の 100-1,000 ng と標準的な結紮を行います。
  6. 標準的な熱衝撃プロトコル16を使用して有能な細菌を変換します。
  7. 寒天プレート プレート含む 15 μ G/ml ゲンタマイシンに。16 h の 37 ° C で孵化させなさい。
  8. シングル コロニーをピックアップ、プラスミド DNA を浄化したシーケンス17 pCEP 前方プライマーを用いた挿入の確認: 5' 3' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG。
    注: 単一のコロニーに PCR はプライマー pCEP 前方で事前に精製することがなく実行できます、pCEP を逆に (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3')。この手順は、肯定的なコロニーの事前選択の役に立つことができます。
  9. 手順 4 に進みます。

3. クローニング誘引可能な遺伝子ノックダウンのミール shRNA の

  1. クローニング プロトコル19pSLIK によるとミール shRNA オリゴヌクレオチドをデザインします。アニールしオリゴヌクレオチドの浄化し、希釈 1:20 ddH2o.
  2. 3 h 50 ° C で 5 U BfuAI のエントリ ベクトルのダイジェスト 3 μ g には、20 分の 65 ° C で反応し不活性化します。
    注: 緑色蛍光タンパク質 (GFP) の共発現が必要な場合それ以外の場合、エントリ ベクトルとして使用 pEN_TTGmiRc19は pEN_TTmiRc219を使用します。
  3. ゲルはステップ 2.5 のように消化のベクトルを浄化します。100 の標準的な結紮を実行ベクトルの ng、1 μ L の精製し、shRNA オリゴヌクレオチド (ステップ 3.1) を希釈 1 h. 熱は室温においてリガーゼ 400 U T4 を使用して 10 分の 65 ° C で不活化します。
  4. 標準的な熱衝撃プロトコル16を使用して有能な細菌を変換します。
  5. 寒天プレート プレート含む 15 μ G/ml ゲンタマイシンに。16 h の 37 ° C で孵化させなさい。
  6. シングル コロニーをピックアップ、プラスミド DNA を浄化したサンガー シーケンス17挿入の確認 (配列のプライマー: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3')。
  7. 手順 4 に進みます。

4. 過剰注入用の準備ができてのクローンを生成するためのクローニング

  1. (ステップ 2 またはステップ 3) からエントリ ベクトルのミックス 150 ng と 150 ng の pTC のテト ベクター20。
  2. 8 μ L の総ボリュームに TE バッファーを追加 (pH = 8)。
  3. 転送 LR clonase 酵素ミックス II (材料表参照) 氷に孵化させなさい 2 分渦の 2 回。
  4. 反応に LR clonase 酵素ミックス II の 2 μ L を追加し、25 ° C 1 時間インキュベートします。
  5. プロテイナーゼ K 溶液 1 μ L の追加によって反作用を停止します。37 ° c 10 分間インキュベートします。
  6. 過剰のクローニングの 2 μ L で有能な細菌混合標準熱衝撃プロトコル16を使用して Stbl3 を変換します。
  7. 寒天プレート プレート含む 100 μ g/mL アンピシリンに。30 ° C 24 時間で孵化させなさい。
  8. シングル コロニーをピックアップ、製造元の指示に従ってエンドトキシン プラスミド調製キット18を使用してプラスミッド DNA を浄化、サンガー シーケンス17 (配列のプライマー 5' ベクトルの整合性を確認AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3')。
  9. 構造は注射の準備、手順 5 に進みます。

5. 流体尾静脈注射用ソリューションを準備します。

注: 構成、誘引可能な遺伝子発現コンストラクトの調製は、ステップ 1、2、3、および 4 で説明されます。

  1. 0.9% 生理食塩水を注入の準備 (ない使用 PBS を行う)。マウスの体重の約 10% に対応するボリュームを使用します。例: 体重 20 g のマウス、2 mL の溶液を準備します。
  2. (1.8 または 4.8、ステップをそれぞれ参照) エンドトキシン プラスミド精製キット18を使用して精製した注射ベクトルを準備します。
  3. 10 μ g またはベクター構築の眠れるエンドトキシン フリーの 15 μ g を追加 (ステップ 1 使用 10 μ g からからステップ 4 使用 15 μ g、それぞれ)、エンドトキシン フリー pc HSB521滅菌生理食塩水の mL あたり 1 μ g。
  4. 4 ° C で 4 h までのストア ソリューション凍結しないでください。

6. 流体の尾静脈注射を実行します。

  1. 尾静脈注射 (商業または 50 mL の円錐管尾、呼吸のための穴から準備)、落を使用します。ティッシュ ペーパーで管の底を入力します。
  2. 注入の 20-25 g の重さの約 8-10 週齢のマウスを使用します。
  3. 注入する前にマウスの重さし、体重によると注入量を準備 (体重の 10% に相当するステップ 5.1 を参照)。注射と必要なボリュームでいっぱいの 27 G 針で滅菌 3 mL シリンジを準備します。
  4. 落にマウスを配置します。ティッシュ ペーパーの量を調整する (手順 6.1 参照) 呼吸に十分なスペースが、運動のためだけに最小限のスペースを残して。
  5. マウスは定期的に呼吸することを確認します。
  6. 暖かい 30-60 の赤外線ランプを使用して慎重に尻尾は過熱の兆候を監視します。
  7. アルコール綿で尻尾をきれいに。
  8. 尾のベースに近い 2 つの外側尾静脈のいずれかにほぼ水平に針を挿入します。
    注: 正常に配置されると、少量の血液が針のコーンに流れる可能性があります。その変位および/または静脈の損傷発生する針の任意の追加の動きを積極的に吸引することはお勧めしません。
  9. 総容積を 8-10 s 内で尾静脈に注入します。
  10. すぐに、落から、マウスを削除します。圧縮噴射傷の少なくとも 30 秒または任意の出血がおさまるまで。
  11. 別のケージにマウスを配置します。マウスは、プロシージャ (約 30-60 分) から回復している、かつては、その元のケージに戻るマウスを転送します。次の 24 時間のために定期的にマウスをチェックします。
    注: マウスの軽度の鎮静は 2 h までの注入後に日常的に観察します。
  12. (すなわちステップ 7) の実験の前に、非統合のベクトルのクリアランスのための 10-15 日を待ちます。

7. タモキシフェンと Transfected クレエの誘導

注意: タモキシフェンは、有害な癌、不妊治療に損傷を与えます。安全データ シートを参照してください。

  1. 連続 3 日間腹腔内タモキシフェン注射を計画します。
  2. 1 日に 40 μ L エタノールにタモキシフェン 10 mg を溶解します。タモキシフェンが溶けるまでは、数回の 55 ° c で 10 分間渦孵化させなさい。
  3. 960 μ L コーン油を追加します。55 ° C で 5 分間インキュベートします。渦透明な溶液を得るために数回。
  4. 27 G 針で 1 mL インスリン注射器でソリューションを準備します。
  5. 首筋慎重に親指と 2 番目の指マウスの首をつかんでマウス尾手のベースと 4 番目と 5 番目の指の間を固定します。
  6. 腹部の左下腹部に腹腔内ソリューションの 0.1 mL (= タモキシフェンの 1 mg) を挿入します。
  7. 2 と 3 の日に注射を繰り返します。

8. 遺伝子テトラサイクリンまたは shRNA 発現の誘導

注意: ドキシサイクリンは、有害な可能性があります。安全データ シートを参照してください。

注: タイプと実験の期間に応じてドキシサイクリンで指定できます (ステップ 8.1) の飲料水やチョウ (ステップ 8.2)

  1. 短期的には実験のため (< 10 日) 次のプロトコルを使用して飲料水を介してドキシサイクリンを管理します。
    1. 水道水 100 mL に 5 g のショ糖を分解します。オートクレーブ。
    2. 100 mg を 5 mL のショ糖液 (ステップ 8.1.1) 15 mL コニカル チューブにドキシサイクリン hyclate を溶解します。
    3. 10 mL 注射器、滅菌フィルター 0.2 μ m のフィルターを通してソリューションを使用しています。8.1.1 準備したショ糖液に追加します。
    4. マウスに飲料水としてドキシサイクリン ショ糖液を供給します。ソリューションが細菌増殖 (置換、遅くとも 3 日後に明確な解決策) を示す曇りになると毎日と置換を確認してください。
  2. 長期実験のため (> 10 日間) または代謝の変化に敏感な実験使用商業ドキシサイクリン チョウ (例えば、ドキシサイクリン Hyclate チョウ 0.625 g/kg) 脱水および/またはショ糖による扱われた動物の肝臓の変化を避けるために。

9. マウス肝の免疫染色による解析のための準備

注意: パラホルムアルデヒドは有害な可能性があります。安全データ シートを参照してください。

注: マウスは分析する場合 timepoint は、実験によって異なります。十分な遺伝子または shRNA 発現誘導を確保するためドキシサイクリン治療も 3 日後肝組織を分析することをお勧めします。

  1. 1 mL シリンジ 1 ml 4% パラホルムアルデヒド溶液 (PFA) の 27 G 針付きを準備します。
  2. 承認された動物プロトコルに従って適切な方法でマウスを安楽死させます。
    注: 安楽死の方法として適切なガイドラインは、機関によって異なることがあります。
  3. 解剖はさみと解剖学的鉗子を使用して、慎重に肝臓を公開する正中開腹と腹腔内を開きます。小腸を門脈と下大静脈 (IVC) 公開を右に移動します。
  4. 用意された注射器の針を挿入 (手順 9.1 参照) 下大静脈および門脈のカットに。自動蛍光赤色の血液細胞 (免疫蛍光染色を行う場合が望ましい) を外し、肝組織を灌流する下大静脈に PFA の 1 mL をゆっくりと挿入します。
  5. 肝臓を取り出します。水で洗い、4 %pfa 溶液 5-10 mL に転送。
  6. パラフィン切片の 36-48 組織のため修正組織は脱水やパラフィン包埋のため準備ができています。
  7. 凍結切片の苦境の 4% にティッシュ 1 h の PFA。
    1. に対する凍害保護作用、10% ショ糖溶液に転送します。60 分間インキュベートします。
    2. 20% ショ糖液に転送します。60 分間インキュベートします。
    3. 30% ショ糖液に転送します。12-16 h. 埋め込む埋め込み凍結切片の化合物をインキュベートし、-20 ° C の凍結

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結果

流体尾静脈注射によってトランスフェクションの有効性:単一の注入による力学トランスフェクションがマウスの肝細胞の割合は変数、注入量、注入時間、注入された DNA の量と注入された構築6、サイズなど複数のパラメーターに依存します。 22,23。また、トランスフェクション効率はより大きな血管径として正弦波が面積が全体的な圧力の減少につながる大きな動物では一般的に低い。トランスフェクション効率を視覚化するには、クレエ トランスポゾン コンストラクトの HTVI は、クレエ コンストラクトのタモキシフェンを介した活性化に続いてRosa26mTmGレポーターの遺伝子をかくまっているマウスで行われました。低注入量や長期注入にかかる時間だけいくつか transfected 肝細胞全体の肝が、最適な噴射条件となる高いトランスフェクシ...

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ディスカッション

流体尾静脈注射で肝細胞のトランスフェクションとなっている確立された手法、導入以来 15 年以上も前6。噴射量は心拍出量を超えるし、肝臓の7肝細胞25,26の 40% まで約 10-20%, いくつかのケースでのトランスフェクションにつながる正弦波に下大静脈から流れます。成功したトランスフェクションの予測因子は、注入時間22,23あたりの噴射量です。したがって、(図 1 a、左パネル) 低トランスフェクション効率は通常手順7の中に射出速度を維持するために失敗します。ただし、最適な手法でもトランスフェクション効率 HTVI によって達成することができます残りますアデノ ウイルスやアデノ随伴ウイルスほぼ 100

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開示事項

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謝辞

この作品は、ドイツの Krebshilfe、ドイツ (許可番号 111289 UE に)、子供の健康 (アーネスト ・ アメリア ガロ恵まれて員 - CTSA 許可番号 UL1 RR025744 UE) ルシール パッカード財団によって支えられました。博士マーク a. ケイありがとうベクトル構造と実験的アドバイスや Dr ジュリアン セージ マウスの実験をサポートします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo Fisher#SM1331DNA ladder for electrophoresis
Tissue-Tek O.C.T.Sakura4583クライオ切片の埋め込み
Biozym LE アガローBiozym840004
エチジウムブロマイドSigma-AldrichE7637-1G
D(+)-サッカローカール・ロス4621.1ドキシシリン溶液の甘味料化用
アンピシリン ナトリウム塩AppliChemA0839,0010アンプ耐性クローン
LB Agar (Luria/Miller)Carl RothX969.1
LB Broth (Luria/Miller)Carl RothX968.1
S.O.C. MediumThermo Fischer15544034
Gentamicin sulfateAppliChemA1492,0001ゲンタマイシン耐性クローンの選択用
Roti-Histofix 4 %Fa. RothP087.6パラホルムアルデヒド溶液
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mixinvitrogen/ThermoFisher11791-020contains LR-clonase Enzyme Mix II and proteinase K
DB3.1 Competent CellsThermo Fisher11782-018
Stbl3 Chemically Competent E. coliThermo FisherC737303
Name会社カタログ番号コメント
Restriction Enzymes
PacINew England BioLabsR0547S
AscINew England BioLabsR0558S
FseINew England BioLabsR0588S
SacIニューイングランド バイオラボR0156S
SpeIニューイングランド バイオラボR0133S
KpnIニューイングランド バイオラボR0142S
NotIニューイングランド バイオラボR0189S
XhoIニューイングランド バイオラボR0146S
BfuAIニューイングランド バイオラボR0701S
名前会社カタログ番号コメント
キット
QIAquickゲル抽出キットQiagen28704
NucleoSpinゲルおよびPCRクリーンアップMacherey&からのDNA抽出用ナーゲル740609.10
NucleoBond PC20Macherey &ナーゲル740571プラスミド抽出(ミニ調製)
NucleoBond PC500Macherey &Nagel740574Plasmid extraction (Maxi prep)
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseThermo FisherF530S
Name企業名カタログ番号コメント
<>strong>Materials for Mouse Experiments
Injekt シリンジ F 1 mlブラウン9166017V腹腔内注射用
Omnifix Luer 3 mlブラウン4616025V静脈内注射用
ステリカン カニューレ 24Gブラウン4657675
ステリカン カニューレ 27Gブラウン4657705
タモキシフェンSigma-AldrichT5648-1GCreER 活性化用
コーン油Sigma-AldrichC8267-500MLタモキシフェン注射用キャリア
ドキシサイクリンヒクレートAppliChemA2951,0025テトラサイクリン依存性発現の活性化
Injekt 10 ml シリンジブラウン4606108V
フィルトロプール S 0.2ザルスタット831,826,001ドキシサイクリン
NaCl 0,9%ブラウンのろ過用3200905静脈注射用キャリア
ファルコンコニカルチューブ 50mlコーニングライフサイエンス352095
赤外線ランプ該当なし該当なし 該当なし尾の加温用
IVISパーキン・エルマー124262 In vivoイメージングシステム
名称会社名カタログ番号コメント
strong>Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.
pTCn/aVector for constitutive gene expression, ref. 15
pEN_TTmcsAddgene #25755Entry Vector for inducible gene expression, 文献 19
pEN_TTGmiRc2Addgene #25753Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19
pEN_TTmiRc2Addgene #25752Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, 参考文献 19
pTC ApoE-TetAddgene #85578Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11
pTC-CMV-TetAddgene #85577CMV promotorによる誘導性遺伝子またはmiR-shRNA発現の発現ベクター, 文献 11
ス ス の選択用ゲル マウス

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