方法論記事

蛍光灯、摂取昆虫における流体吸収能力を決定するための磁気ナノ粒子

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DOI：

10.3791/56619

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2017年12月20日

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1Department of Biological Sciences, Kent State University at Stark, 2Department of Mathematical Sciences, Clemson University, 3Liquid Crystal Institute, Kent State University, 4Brookhaven National Laboratory

この記事について

サマリー

流体食性昆虫は、多孔性の表面の液体の微量を取得する能力を持っています。このプロトコルでは、直接蛍光、磁性ナノ粒子供給溶液を用いた多孔質表面から液体を摂取する昆虫の能力を決定する方法について説明します。

要約

流体食性昆虫を摂取する環境では、プール、映画、または小さな毛穴に閉じ込められた液体の様々 な。口器の構造と機能の関係を評価する液体の獲得の研究が必要とただし、流体の吸収機構の解明は歴史的構造のアーキテクチャは、実験的証拠と時々 一人旅の観察から推論されます。蝶 (鱗翅目) とハエ (双翅目) の液体の少量を使用して流体吸収能力を評価する手法を報告する.昆虫は、特定の細孔径のフィルター ペーパーから蛍光、磁性ナノ粒子と混合 20% ショ糖液が供給されます。作物 (流体を格納するために使用される内部構造) は、昆虫から削除され、共焦点顕微鏡上に配置。磁石は昆虫が水分を摂取することができるかどうかを示すナノ粒子の存在を確認するための作物で手を振った。この手法を使用して、機構の解明、広範な供給 (毛細管と液体ブリッジの形成) 多孔性の表面からを供給するとき可能性のある鱗翅目、双翅目の間で共有されます。さらに、このメソッドは液餌昆虫、病気の感染、バイオミメティックス、ナノまたはマイクロ導管を含む可能性のある他の研究で重要なを含むさまざまな機能の研究使用できます、液体の輸送には、検証が必要です。

概要

多くの昆虫のグループ (proboscises) の口器がある適応流体を供給するため、花の蜜、果実の腐敗など sap フロー (例:双翅目1、鱗翅目2膜翅目3)、木部 (半翅目4)、涙 (鱗翅目5) と血 (目, シラミ目6ノミ7、双翅目7、8半翅目、鱗翅目9)。流体を餌に昆虫の能力は生態系の健全性 (例えば受粉10)、病気伝達4,11生物2,12、および研究に関連します。収斂進化13。多彩な食料源、にもかかわらずいくつかの流体餌昆虫の中でテーマとマイクロやナノ液滴、液膜または多孔性の表面に限定されるが、液体の少量を取得する機能です。

流体食性昆虫 (すべての動物種の14,の15の 20% 以上) と様々 な食料源を餌に能力の膨大な多様性を与えられた彼らの餌を理解動作流体吸収機構の解明、多くの分野で重要であります。昆虫の口器の機能、たとえば、バイオミメティック技術、例えば少量の流体が用いられるものと同様の方法を使用しての取得などのタスクを実行できるマイクロ流体デバイスの開発の役割を果たしています。昆虫16。流体吸収メカニズムの研究における根本的な問題は、流体、昆虫のフィード方法のみを決定するが、メカニズムをサポートして実験的証拠を取得します。のみ動作を使用して (例えば、テング12,17プロービング) 流体の正常な吸収を確認しませんも、それがルートを決定するための手段を提供するため、供給のための指標が十分なこと流体の旅行昆虫を通過するとき。また、少量より流体の実験を実行する流体が制限リソース2,12自然の供給シナリオを表します。

位相コントラスト イメージング多孔性の表面12から液体の少量で蝶がどのようにフィードを評価するオオカバマダラ (オオカバマダラl.) を併用した x 線します。モナルカ蝶フード運河に小さな毛穴に閉じ込められた流体をもたらすテングに沿って毛細管を介して表皮突起 (背 legulae) の間にスペースを使用します。着信の流体は、成長し高原不安定12,18, 頭に吸引ポンプの作用で、蝶の腸を運ばれる液体の橋に崩壊食品管壁のフィルムを形成します。X 線位相コントラスト イメージング昆虫12,19,20,21内の流体の流れを可視化するための最適なツールですが、テクニックはすぐに利用できるより便利メソッドは、昆虫の能力吸収液の迅速な評価のために必要ですし、摂取します。

D. plexippusの供給メカニズム適用他の鱗翅目に、ハエ (双翅目)、(両方のグループが多孔性の表面の液体のフィード) かどうかを決定する Lehnertら13には、ここで詳細に報告されている多孔性の表面の液体の少量を餌に昆虫の能力を評価するための手法が適用されます。ここで説明したプロトコルは接液部を使用して研究と多孔質の表面、プール供給メカニズムのアドレスなど、他の研究方法論を変更できます。また、アプリケーションは、マイクロ流体システムと材料技術など、あらゆる分野に拡張します。

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プロトコル

1. 昆虫種、ソリューションおよび供給ステーションのセットアップの準備

注: 流体吸収能力、口器形態22,23に関する以前の研究の使用のため、キャベツ蝶 (モンシロチョウL.、シロチョウ科) は代表チョウ目の種として選択されます。家 (イエバエL., イエバエ科) や青いボトル蠅 (オオクロバエ vomitoria L., クロバエ科) は、彼らは多孔性の表面の13の餌、多く観察されるために使用されます。

  1. それら人工のダイエット (材料の表を参照してください) 蛹環境室の大人として浮上するまで昆虫のサプライヤーとリアから幼虫として順序モンシロチョウは 23 ° C、18 L: 6 日長に設定。順序M。イエバエと蛹としてC. vomitoriaとモンシロチョウと同じ環境条件でリアのそれら。彼らは供給実験前蛹から出てくる後は、チョウ類成虫、ハエを給紙されません。
  2. 20% ショ糖液 (コントロール) と流体吸収をテストする 20% ショ糖ナノ粒子溶液を準備します。蛍光磁性ナノ粒子を追加することによってナノ粒子溶液を準備 (鉄酸化物ポリアクリル酸コーティング、約 20 nm 径の) 20% ショ糖液 (1 Mg/ml と dH2O ナノ粒子と 20% スクロースを24ソリューションには、1:1)。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 1 x ソリューションの準備 (10 x dH2O、pH 7.4 で 1 倍に希釈)、解剖に使われます。
  3. 手動式マニピュレーターのクランプと別の餌ステージ (平らなプラットフォーム) で構成される供給ステーションの設定 (図 1)。摂食の段階に凹面のスライドを配置、毛穴サイズ直径 1、5、8、11、20、30、41、または 60 μ m、膜フィルターの孔のサイズ径ナイロン ネット フィルターまたは供給実験の近くに 10 μ m。

2. 餌のプロトコル

  1. 昆虫の体、足と翼を折りたたんだティッシュ ペーパーにラップします。虫の位置を頭と口器のみが公開されます。昆虫、昆虫摂食の段階 (図 1) 上記の中断は、マニピュレーターをクランプによってまとめられる 2 つの顕微鏡のスライド間の翼に配置します。
  2. 凹面のスライドの中央に 20% ショ糖溶液のマイクロ ピペットで 20% ショ糖ナノ粒子液 30 μ L の液滴を管理します。ナノ粒子溶液の液滴とフィルター紙の中心が揃うように、凹面のスライドに特定の細孔径の単一のフィルター紙を置きます。液滴とろ紙の間お問い合わせは満ちる気孔 (図 1)、フィルター紙に沿って広がっているソリューションの結果します。
    注: フィルター ペーパーは、昆虫がフィード フィルター紙の上にナノ粒子が存在する可能性を最小限に抑えるため、周りの他の方法ではなく、液滴の上部に配置されます。
  3. 口器の遠位領域のみの摂食の段階 (図 1) 接液部のフィルター ペーパーを連絡することができるように、マニピュレーターを持つ昆虫を配置します。虫ピンを使用してフィルター紙の上に口器を拡張し、45 のフィードに昆虫を許可する s。
  4. フィルター ペーパーの表面に存在するかもしれない液体の膜にする昆虫のチャンスを最小限に抑えるために口器の位置 (すなわちスライドの平らな部分に触れているろ紙の部分と接触しているので。、スライドの凹の部分の上に直接ではなく)。虫餌に興味を表現していない、口器は餌の時間の期間のろ過紙、虫ピンに保持することができます。

3. 解剖

  1. 昆虫の体をカバーする十分な解決策があるので、50 ミリメートル時計ガラスに PBS のソリューションを配置します。時計ガラス、万国実体写真の横にある装置 (春マイクロはさみ、昆虫ピン、鉗子を切り裂く細かい点を解剖) を解剖位置と昆虫の下に配置します。
  2. 授乳後ティッシュ ペーパーから昆虫を削除し、翼を閉じた状態でそれを保持します。春の微小解剖はさみで頭、足、および昆虫の翼を取り外し、時計ガラス (図 2) PBS 溶液で昆虫を置きます。
  3. 必要な場合は、解剖前に昆虫を麻酔します。腹部遠位近傍キューティクルによって昆虫を保持するために鉗子を使用します。支配的な手で胸部に達するまで後端から始まる、腹部の側面に沿って前方方向でキューティクルをカットするのにはさみを解離性春マイクロを使用します。表皮だけをカットし、(図 2) が破損している昆虫の中の消化管ではないことを確保するための特別な注意を取る。
  4. 消化管内部 (図 2) を明らかにする腹部を開く解剖はさみでキューティクルの追加カットを作る。昆虫ピンの支援を受けて腹部キューティクル、脂肪体と他の構造を削除し、時計ガラスの胸部と消化管だけを残して後の処分のため時計のガラスの外にそれらを再配置します。
    注: 解剖胸部と腹部の合流点近くに位置する嚢のような構造 (消化管の延長) である作物が表示されます。
  5. 作物が公開されていない場合は、作物を明らかにするまで、はさみで胸郭に追加切開を確認します。作物が表示、時計ガラス (図 2) で作物と消化管だけを残して昆虫の残りの部分を切り取る。
    注: 鱗翅目昆虫の作物はほぼ透明で流体がないかどうかと、展開を認識することは困難かもしれない性質または解剖中切ってかどうかセロファンのような。
  6. その後画像 (図 2) の coverslip (24 mm × 24 mm) の上に作物を配置するのに鉗子を切り裂く細かい点を使用します。

4. 摂取されたナノ粒子の定量

  1. 位置、細かい点を解剖鉗子使用して coverslip の作物は作物の破裂を防ぐために注意します。20 倍の倍率で画像を倒立顕微鏡で CY3 チャネル (または位相) を使用します。乾燥からそれを防ぐために郭清後すぐに作物をイメージします。
  2. 顕微鏡の動作段階の制御ではない手で電磁攪拌バー (41.3 mm の長さと直径 8 mm) を保持します。
前後それぞれモーション約 1 秒 (図 2) では、作物 (作物から約 10 mm 距離) の近くに来たり、電磁攪拌棒を振る。
  • 電磁攪拌棒が振られる間は、ナノ粒子の作物を検査します。ほぼ透明な作物内でナノ粒子の動きのための顕微鏡の接眼レンズをのぞきながら、前後営業ステージをゆっくりと移動します。ナノ粒子が作物である場合肯定的な給餌を示す彼らは応答と波磁気と一体で攪拌棒 (図 2)。

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    結果

    液餌昆虫の中で流体吸収能力のパターンの研究には、餌が発生したときの決意が必要です。ここで説明したプロトコルを使用して、鱗翅目、双翅目の13の間制限の細孔サイズ仮説をテストしています。制限の細孔サイズ仮説は、細孔径が供給管12の直径より小さい場合は、液体充填孔から液餌昆虫を与えることができない状態します。毛穴で液体を保つ毛管圧力を克服するために、行動する吸引ポンプの液体の表面を提供するために、多孔質の表面から受信した流体は高原不安定18を介して安定の液体ブリッジを形成しなければなりません。(図 3) の異なるサイズの導管を給餌昆虫は、そこから彼らはフィードすることができます最小孔径が異なると予測されています。

    それぞれの種に対して制限の細孔径は、ろ紙

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    ディスカッション

    昆虫の口器機能は形態学からみた歴史的に (e.g、鱗翅目のテング機能関連飲むわら25,26);。ただし、実験的証拠が組み込まれた最近の研究は、昆虫の口器と構造機能関係2,12,13の複雑さの私達の理解のパラダイム シフトで起因しました。,22,27. レーザー アブレーション断層レントゲン写真撮影 (図 3)、マイクロ コンピューター断層撮影 (マイクロ CT)28日、共焦点顕微鏡22電子顕微鏡による

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    開示事項

    著者が明らかに何もありません。

    謝辞

    この作品は国立科学財団 (NSF) によってサポートされていた許可なし。IOS 1354956。博士アンドリュー d. ウォーレン (鱗翅目、生物多様性、フロリダ州フロリダ大学自然史博物館・ マクガイア センター) 蝶の画像を使用する許可を感謝します。

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    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    20%スクロース溶液ドミノシュガーシュガー dH2O
    リン酸緩衝生理食塩水(PBS)シグマアルドリッチP549310倍濃度をdH2Oで1倍に希釈した昆虫解剖用
    シングルうつ病凹面スライドAmScopeBS-C6スライドは、給餌ステージのセットアップ
    濾紙EMDミリポアNY6004700(60&マイクロ;m)昆虫の餌付け用の多孔質表面を生成するために必要なナイロンネットフィルターとアイソポアフィルター
    濾紙EMDミリポアNY4104700(41µm)昆虫の餌付けのための多孔質表面を作り出すのに必要なナイロン網フィルターおよびisoporeフィルター
    EMDミリポアNY3004700 (30 & micro;m)昆虫の供給のための多孔質表面を作り出すのに必要なナイロン網フィルターおよびisoporeフィルター
    フィルターEMDミリポアNY2004700 (20 µm)昆虫の供給のための多孔質表面を作り出すのに必要なナイロン網フィルターおよびアイソポアフィルター
    EMDミリポアNY1104700 (11 & micro;m)昆虫の供給のための多孔質の表面を作り出すのに必要なナイロン網フィルターおよびisoporeフィルター
    フィルターEMDミリポアTCTP04700(10 µm)昆虫供給用の多孔質表面を生成するために必要なナイロンネットフィルターとアイソポアフィルター
    濾紙EMDミリポアTETP04700(8&マイクロ;m)昆虫供給用の多孔質表面を生成するために必要なナイロンネットフィルターとアイソポアフィルター
    濾紙EMDミリポアTMTP04700(5µm)昆虫供給用の多孔質表面を生成するために必要なナイロンネットフィルターとイソポアフィルター
    濾紙EMDミリポアRTTP04700(1µm)昆虫の摂食のための多孔質表面を生成するために必要なナイロンネットフィルターとアイソポアフィルター
    アイリスマイクロ解剖ハサミカロライナバイオサプライカンパニー623555 解剖に使用されるハサミ
    昆虫ピンBioquip 製品1208B1解剖および摂食試験中に使用されるピン
    極細点解剖鉗子カロライナバイオロジカルサプライカンパニー624684解剖装置
    ライカ M205 C ステレオスコープライカ マイクロシステムズM205 C解剖用ステレオスコープ
    倒立共焦点顕微鏡オリンパスIX81磁性ナノ粒子の検出に用いる蛍光顕微鏡
    フィッシャーブランドPTFE ディスポーザブル スターバー フィッシャーサイエンティフィックS68067ナノ粒子の検出に用いるマグネット
    キムテックサイエンスKimwipesKimberly-Clark Professional34155給餌試験中に昆虫を固定するために使用される組織
    イエバエ (Musca domestica) 実験用昆虫Mantisplace.com
    ブルーボトルフライ (Calliphora vomitoria) 実験用昆虫Mantisplace.com
    キャベツ蝶 (Pieris rapae) 幼虫カロライナバイオロジカルサプライカンパニー144102実験用昆虫
    フィンピペットF1 ThermoFisher Scientific4641080Nマイクロピペット 分注用
    Finntip 250 ピペットチップThermoFisher Scientific9400250マイクロピペットチップ
    顕微鏡 ガラスカバースライド (=カバースリップ) (24 x 24 mm)AmScopeCS-S24-100カバースリップ 昆虫の作物を共焦点顕微鏡で観察するための
    に必要ですフィルターフィルター フィルター フィルターフィルター

    参考文献

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