電気生理学測定の電気中立運送者の活動を研究への応用

サマリー

本稿では、プロトン電極やパッチク メソッドのプロトン輸送システムのアクティビティを計測への応用について説明します。これらのメソッドは、一般的に中等度の感度、時間分解能が不足して細胞内環境制御などのプロトン輸送活性を研究する使用される技術のいくつかの制限を克服します。

要約

細胞膜中のイオン輸送は細胞の生存に不可欠な細胞内外のイオン濃度の微調整を保証します。これらの転送機構は、専門にされた蛋白質の活動によって仲介されます。具体的には、pH の動態は、原形質膜プロトン (H⁺) 押出シ ステ ム、ナ⁺などによって制御される細かく/H⁺交換 (NHE) 蛋白質家族。NHE の調節機構を研究するための広範な努力にもかかわらず NHE 族の生物物理・分子の性質の私達の現在の理解は、NHE 活動を効果的に測定する方法の限られた供給のためは十分ではないです。.本稿では、我々 は H⁺を使用-全体セル中に電極パッチ クランプ記録 NHE 誘起 H⁺フラックスを測定します。提案した通常のいくつかの制限を克服するためにこのアプローチは、放射性の取り込みなど蛍光膜定性、NHE の利用状況を測定するためのメソッドを使用します。記述法を用いた NHE 活性の測定により、細胞内の H⁺濃度のより効率的なコントロールと時間分解能高感度。H⁺-電極がトランスポーター活性細胞膜近くにイオン勾配を作成するという事実に基づいています。H⁺-への移行と繰り返し、振動方法で細胞膜から離れた電極記録電圧差 h⁺に依存しています。一方、H⁺-H⁺フラックス全体セル構成でパッチ クランプ メソッドを使用して、細胞内のイオン組成を制御する、セルの外に移動を検出する電極を使用します。また、巨大なパッチ ・ クランプの技術のアプリケーションには、イオンだけでなく、脂質の細胞内構成の変更ができます。NHE アイソ フォーム 3 (NHE3) の輸送活動はイノシトールリン脂質により NHE3 調節の分子基盤の研究にこの技術的なアプローチを使用して測定しました。

概要

イオンとプラズマ膜における溶質の輸送は細胞のと、それゆえ、生物¹の生存に不可欠です。溶質とイオンの選択的輸送は専門にされたチャネルおよび蛋白質の配列によって実現されます。さまざまな病態、薬物治療¹のチャネルやトランスポーター蛋白質の潜在的なターゲットをレンダリングしばしばこれらの蛋白質の突然変異の結果します。残念ながら、チャネルやトランスポーターの機能と制御機構の解明は、しばしば制限のアクティビティ^2,3、4を研究するのにアプローチで。

具体的には、トランスポーターがサブに分けることが彼らは溶質の輸送中における細胞膜電位を変更するかどうかに応じて 2 つの大規模なグループ: 無k イオン変更 [例えばナトリウム ・ リン酸輸送体共輸送体 2 a (NaPi2a)、ナトリウム カルシウム交換体 (NCX) など]。または非変更 electroneutral イオン運送者 [例えば、ナトリウム プロトン交換 (NHE)、塩化ナトリウム共輸送体、NaPi2c、等です。]。膜側の透過物の蛍光染料²やトランスポーターの両方のクラスの活動は広範囲の放射性同位体の取り込みを使用して検討されています。両方のアプローチは、特定の細胞質のイオンのバルク濃度の変化を測定することによってトランスポーターの活性を推定し、両者適度な感度と時間分解能と細胞内の管理不十分などの制限があります。環境。確かに、多くのトランスポーターの活性は細胞質 (例えばNHE3、NCX)、運ばれたイオン濃度に依存して、これらのイオン濃度の変化が輸送活動²の調節に重要な役割を果たすことが期待^,3,5します。 これらの調節のメカニズムの正確な測定は古典的な方法を使用して制限されます。

これらの制限を克服するために、パッチ クランプ方法トランスポーター活性^2,6が検討されます。具体的には、クランピング システム パッチ併用自己参照型イオン選択性電極 (ISEs)^7,8は最近 electroneutral トランスポーター アクティビティ^3,4の測定を許可しています。^,5。 天気予報がトランスポーター活性細胞膜近くにイオン勾配を作成するという事実に基づいています。移動し、細胞膜の繰り返しから伊勢、振動のファッションは、電圧差 (μ V) を記録します。電圧の違いは、拡散^2,9の Fick の最初の法律を適用する校正法を用いたイオン流束の値に変換できます。天気予報が使用されている間のうち移動イオンのフラックスを検出する細胞、両方の全細胞のパッチ クランプ法またはインサイド アウト構成膜電位および細胞内のイオン組成を制御するために使用します。また、巨大なパッチ ・ クランプの技術のアプリケーションには、イオンだけでなく、脂質とタンパク質の^3、5の細胞内構成の変更ができます。

要約すると、パッチ クランプ法の汎用性は研究する他の方法の輸送活動が行ったことパッチはこれらの他のメソッドの一般的な制限事項を克服するために適切なクランプと比較されます。自己参照を示さなかったし、パッチク ランプ法の組み合わせが厳しく制御された実験環境における electroneutral トランスポーターの活性を測定して小説生物物理・分子を発見するユニークな可能性を提供しています細胞膜の性質は、^3,4,5を転送します。このアプローチは、NHE の活動を研究する正常に使用されています。哺乳類 NHE タンパク質ファミリーは、内側の Na⁺グラデーションを利用した細胞内のプロトン (H⁺)^10,11細胞外ナトリウム (Na⁺) の electroneutral ネット交換を触媒します。哺乳類で、NHE タンパク質ファミリーには、11 の関連蛋白質 (NHE1 9 および NHA1 2) と精子固有の NHE^10,12,13が含まれています。

NHEs (SLC9a 族) 単純な原核生物から高等真核生物にほとんど生物で普遍的に発見され、さまざまな重要な細胞機能^10,11で細胞の塩分防御を制御に関与しています。原核生物、酸基盤ホメオスタティス、細胞量を維持し、様々 な特殊な上皮^10,12,14,15の塩と水の吸収を調節します。NHEs の重要な生物学的役割とその機能の重要性がいくつかの研究によって決定されています。ただし、いくつかの研究は、方法論の限界⁴のための哺乳類 NHEs 生物物理・分子特性を検討しました。最近では、自己細胞パッチク中に天気予報を参照するアプリケーションはイオン、タンパク質やリン脂質で^{3の細胞内濃度の変化によって規制されての NHE アイソ フォームの分子機構を明らかにしました。 4}。

具体的には、この原稿の提供されるプロトコル概要方法や勉強活動と NHE アイソ フォーム 3 の規則 (NHE3) Na⁺、Cl^-、HCO₃^- 、液の吸収の主要なプレーヤーのためのアプローチ、腎と小腸上皮^14,16の刷子縁膜。細胞内イノシトールリン脂質 NHE3 活動の感度の違いに新しい洞察力 (phosphatidylinositide 4, 5-ビスリン酸 [PI (4, 5) P2] と phosphatidylinositide 3,4,5 三リン酸 [PI(3,4,5]P3]) が報告されます。チャンネルやトランスポーターなどの細胞輸送蛋白質はイノシトールリン脂質¹⁷、によって調整されるし、NHE3 は直接 PI (4, 5) P2 と P3 PI (3,4,5)¹⁸をバインドします。現在の文献に基づいて、いずれかのイノシトールリン脂質 NHE3^5,18,19の生理や病態生理学的規制に関連する可能性があります。我々 の調査結果は、PI (4, 5) P2 の PI (3,4,5) P3 NHE3 活性の調節の別のロールをサポートします。この区別は、全細胞パッチク ランプとの組み合わせで伊勢の技術の適用のため可能だった。この技法は、NHE3 活性の測定中に異なるイノシトールリン脂質の細胞内血流を介してホスホイノシチド携帯電話コンテンツのコントロールもできます。

プロトコル

注: 2 つのアンプ、クランプ、全体セル構成と高 impendence アンプ (細胞を維持するためにパッチ クランプ アンプ パッチと組み合わせて自己参照伊勢で electroneutral 運送者の活動を記録するために必要です電位計)、伊勢経由で輸送活動を記録する (材料の表を参照してください)。パッチ クランプ アンプは、集録ボードの端子に直接接続されます。電位計を利用してフィルター処理し、信号を増幅する差動増幅器に接続されます。差動増幅器は、集録ボードの端子に接続されます。Capmeter、セル容量を監視するパッチ クランプ ソフトウェアは、以前の研究²⁰で使用されています (材料の表を参照してください)。録音室と灌流ソリューションが 37 ° C で維持されます。

1. 天気予報のピペットの準備

1. ピペット ホウケイ酸塩のガラス管から 1.2 mm の外径を引く (材料の表を参照してください)²ピペットの引き手を使用して。
2. 使用して、マイクロフォージ ピペットを磨きます。ピペット先端の直径は、2-3 μ m にする必要があります。
3. (材料の表を参照) を向いてピペット チップ ピペット用の瓶ホルダーで、ピペットを配置します。
   注意: 換気の化学発煙のフード 1.4-1.6 の手順に従います。
4. ビス (ジメチルアミノ) ジメチル シランと四塩化炭素の 10 滴 1 滴 (~ 150 μ L) で構成される製造混合物のミックス (材料の表を参照してください)。
5. 瓶にケイの混合物を注ぎ、ふたをしっかり締めて。
6. 混合物が完全に蒸発するまでは、24-48 時間室温での化学発煙のフード製造混合物と jar を孵化させなさい。
7. バックフィル適切なイオン選択性樹脂を用いるピペット約 2-4 mm の列を作成します。
   注: 水素イオノフォア私カクテル B は、NHE アクティビティの使用記録をすることができます (材料の表を参照してください)。
8. 先端部にイオン選択性樹脂を配布するピペットの先端をタップし、ダウン ピペット ピペット チップの瓶ホルダー内で縦方向に配置します。
9. Checkunder 樹脂カクテルがヒントの最後に達したこと解剖顕微鏡。必要な場合は、最後に樹脂をプッシュする肯定的な圧力を適用します。
10. 適切なソリューションとバックフィル半分ピペット (~ 100 μ L)。イオノフォアを使用している場合ここでは、pH 7.0 で 100 mM KCl と 10 mM HEPES を使用私カクテル b.
11. 電位計に ISE を接続し、記録用風呂のソリューションに、伊勢の先端を配置します。電位計はゼロします。
12. 試験 H⁺-バス溶液の pH を変更することで選択的な伊勢の応答。平均 H⁺-伊勢の選択的な応答は 〜 58 単位 pH の mV。
13. 伊勢レスポンス校正を定期的に評価します。

2. パッチク ランプの準備記録用ピペットします。

メモ: 単一チャネル記録²¹ドナルド ・ Hilgemann によって彼の記事で説明した方法をお勧めします。

1. ホウケイ酸ガラス管から巨大なパッチ用ピペットを引く (2.0 mmOD/1.5 mm ID) ピペット引き手^2,22,23。
2. 広いピペット チップ (10-22 μ m)²³をするために逆にされた顕微鏡のステージ上を使用して、マイクロフォージ マウント。ビーズを溶かす (〜 0.5 mL)、マイクロフォージの厚い白金線に軟質のガラス。
   注: 比較的厚い白金細線が必要 (~0.5 mm) 巨大なパッチ ピペットを作製します。
3. 軟質ガラス ビーズに近いパッチ ピペットを置き、先端が後退を開始するまでの完全な熱を適用します。白金細線加熱配属されていますに向かって少し移動します。
4. 熱の電源を切り、軟化したガラス ビーズにピペット チップをプッシュします。冷却のワイヤー工具はリトラクトし、ピペット チップを破る。
5. ピペット チップを滑らかに必要な径のピペット チップを作成し熱を再適用します。先端の直径が依存するセルのサイズ パッチ (本研究では 8-10 μ m)。

3. 細胞の調製

1. ウォーム アップ リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) Ca^{2 +} Mg^{2 +}、トリプシン EDTA 溶液、37 ° C で中長期成長なし
2. 洗浄のセル PBS で 2 回。35 mm 直径細胞培養プレートに 1 mL のバッファーを使用します。
3. トリプシンの 0.5 mL を 35 mm 直径細胞培養プレートのセルに追加します。
   注: セル起動するとラウンド アップ、セルをアタッチ解除するプレートを振るとき。
4. 10% 牛胎児血清を添加した完全な成長培地 5 mL (35 mm 径細胞培養プレートの量) を追加することによってトリプシンのアクションを停止します。
   注: トリプシンの反応時間は、細胞型依存。
5. 塊の形成を防ぐためにロッキング シェーカーにセルを配置します。
6. Trypsinization 後 2 h までのセルを使用します。
   注: セルの行によって時間が異なります。

4. ピペット内灌流システムの準備

1. 石英管の適切なサイズをカット (150 μ m OD/75 μ m ID) 内ピペット灌流線を準備します。
2. 200 μ L ピペット チップ石英管の片側に挿入します。先端に石英管を接着し、鋭いかみそりの刃と先端の端をカットします。
3. ピペット内灌流液の貯留層となるシリコン チューブの小片に灌流線 (石英チューブ先端に接着) を接続します。
4. 肯定的な圧力を作成する注射器にシリコン チューブを接続します。
5. 挿入側灌流のピペット ホルダーのポリエチレン管を通って石英チューブのポート (材料の表を参照)。
6. ピペット ソリューションと灌流線を評価します。

5. 溶液の調製

1. NHE (115 mM カリウム アスパラギン酸 (KAsp) 1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、MgCl₂0.5 mM、10 mM Mg-ATP、HEPES が 12.5 mM、12.5 mM パイプ、12.5 mM モップ 12.5 mM MES の pH 6.0 アスパラギン酸で調整) を記録するため重くバッファー ピペット ソリューションを準備します。
   注: は、ストック ピペット ソリューションとフィルターを準備します。録音の前に Mg ATP を追加します。
2. (140 mM の NaCl、2 mM CaCl₂、2 mM MgCl₂、および 0.1 mM トリス塩酸 pH 8.2) するたびに新鮮なバス ソリューションを準備します。

6. 輸送活動の記録

1. トランスポーターの活動は温度依存するので、録音室と 37 ° C ですべてのソリューションを維持します。
2. 記録室にセルを配置します。彼らはチャンバーの下部にドロップしますが、チャンバーに接続させていない場合まで待ちます。
3. 適切なセルを選択します。眼のマイクロメータとセルの直径を測定します。同じような直径を持つセルを選択します。
   注: 一般的に、大細胞がありより細胞表面おそらくよりトランスポーター従ってより多くのトランスポーター活性を有するも、その膜に発現します。ただし、トランスポーターの活性によって異なります特定のトランスポーターと検討中細胞型、これは必ずしも正しくではないです。
4. マイクロマニピュレーターにイオン選択性電極のピペットをマウント、バックフィル細胞内のソリューションでは、パッチ用ピペット ピペット²のヒントを解決策に到達を確認してください。
   注: それはピペットの先端で気泡を除去するためにいくつかの穏やかなタップを必要があります。
5. 設定^2,22,23電気生理学の頭の段階にパッチ用ピペットをマウントします。
   これにより、強いシールの形成に適しているピペットの入口角度としてメモ: 水平軸に約 45 度の角度でヘッドのステージを保つために重要です。
6. 小さく肯定的な圧力を適用 (~ 5 cm H₂O) パッチ ピペット先端をブロックする可能性を削減し、お風呂のソリューションに配置します。
7. パッチ クランプ ピペットの先端がセルの近くに移動を停止します。
8. ピペットに触れるセル間に肯定的な圧力を緩和し、わずかな否定的な圧力を適用 (~ 5 cm H₂O) を取得する、> 1000 パッチで細胞膜上の MΩ (ギガ ω) シール ピペット²³。
9. 伊勢市と同じ焦点面でセルとパッチ ピペットを置き、パッチ ピペット、伊勢への近さ内のセルを移動 (~ 5-10 μ m)^2,5が回避する (図 1 a) 伊勢にお問い合わせください。
10. 潜在的な保有が 0 であることを保証する mV。
11. シリーズでは全細胞構成を取得する短い吸引のシールを破裂します。
12. 伊勢 (またはパッチ クランプ ピペット) 移動ゆっくりと左右または上下トランスポーター (図 1 b) の活動を記録します。
13. 少なくとも 5-8 ピークを記録 (図 1、A から B に)。
14. シールと細胞膜容量 (図 1) の品質を監視する記録中に方形波の摂動を適用します。
15. H⁺フラックスの推定 () 細胞表面とバルク ソリューション (ΔH⁺) 無料 H⁺の濃度の違いから
    
    
    注:とH⁺は、それぞれ、拡散係数をバッファー B_Tがバッファーの合計濃度、 K_Dはバッファーの解離定数、 rはセル半径、および無料 H⁺の小さな変化のため連結 H⁺の濃度の定常状態の変化を決定します。H⁺は、ソリューションの無料プロトンを示します。先行研究と一致する H⁺フラックス、フラックスの現在の同等物を計算して電気生理学的磁束の単位に変換されます (/faraday) pA^3,5]。
16. 携帯サイズから計算することができます細胞表面に膜容量陽子のフラックスを正規化します。

結果

全細胞のパッチ ・ クランプ記録の中に自己参照の伊勢は、イノシトールリン脂質によって NHE3 活性の調節を研究に適用されました。PS120 線維芽細胞様細胞の²⁴、内因性膜 NHEs の表現が不足しているが使用されました。NHE3 野生型 (NHE3 wt) または NHE3 変異しないバインド イノシトールリン脂質 [チロシン 501、503 アルギニンとリジン 505 はアラニン、Y501A/R503A/K505A (NHE3 YRK) で置換された] 安定 PS120 線維芽細胞様細胞¹⁸で表現されました。

トレースは、図 2に掲載されています。セルを全体セル構成、パッチク ランプ用ピペットで開催しましたし、ISE はセルの前に置かれました。この位置で、伊勢記録無料 H⁺

ディスカッション

トランスポーターの重要な機能、にもかかわらず彼らの活動を研究するメソッドがないと不十分です。1 つの制限は、使用可能なメソッドが実験⁴細胞内イオン組成の変動を考慮することがなくトランスポーター活性化イオンの動きを測定することです。提案手法により、細胞内外のイオン組成を正確に制御し、細胞内イオン、タンパク質と脂質組成^3,4,5を変更するための強力なツールを提供しています。

このプロトコルでは最も重要なステップは、²⁵の長周期の安定している伊勢の準備です。我々 の経験で不安定な伊勢、ないよくシリル (例えば、伊勢ピペット両側イオン選択性樹脂は再配布)、伊勢の信号で定数と手に負えないドリフトによる検知が可能します。さらに、実験中に ISE で樹脂分布を綿密に監視する必要があります。お風呂のソ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
パッチクランプアンプ	分子デバイス
デュアルチャネル差動電位計 (HiZ-223)	ワーナーインスツルメンツ	64-1650
差動アンプ (DP-301)	ワーナーインスツルメンツ	64-0044
パッチクランプソフトウェア MatLab MatLabと	取得ツールボックス		キャプメータソフトウェアをお勧めします
サーモクランプ-1 温度制御システム	AutoMate Scientific	03-11-LL	インラインヒーター
シングルチャンネル温度コントローラー (TC-324C)	ワーナーインスツルメンツ	64-2400
シングルバレル標準ホウケイ酸ガラス管	ワールドプレシジョン インスツルメンツ	1B120F-3	イオン選択性電極に使用
マイクロピペット収納ジャー	ワールド精密機器	E212
ビス(ジメチルアミノ)ジメチルシラン	シグマ・アルドリッチ	14755-100ML
四塩化炭素	シグマ・アルドリッチ	319961-500ML
水素イオノフォア I - カクテル B	シグマ・アルドリッチ	95293
薄肉ホウケイ酸チューブ	Sutter Instrument	B200-156-15	パッチクランプピペットに使用
軟質ガラス(コーニング8161パッチガラス)	ワーナーインスツルメンツ	64-0815
シリカキャピラリーチューブ(150um OD / 75um ID)	モレックス(Polymicro Technologies)	106815-0018	ペット内灌流システムに使用
塩化カリウム	Sigma-Aldrich	P9333
パラギン酸カリウム	Sigma-Aldrich	A6558
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
塩化マグネシウム	Sigma-Aldrich	M4880
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MES	Sigma-Aldrich	M3671
塩化カルシウム	Sigma-Aldrich	C5670
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
塩酸	Sigma-Aldrich	H1758
Apyrase	Sigma-Aldrich	A6535
Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8	Echelonバイオサイエンス	P-4508
ホスファチジルイノシトール 3,4,5-三リン酸ジC8	エシュロンバイオサイエンス	P-3908