このプロトコルでは、化学 wholemount ラット網膜培養神経伝達物質グルタミン酸神経の形態を調査するための手法について説明します。化学神経は網膜視細胞の変性疾患による不可逆的な失明の治療のための従来の電気神経刺激する有望な代替手段です。
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方法論記事
バイオミメティック化学ニューロモデュレーション神経伝達物質グルタミン酸の in Vitroラット網膜のための方法論
この記事について
サマリー
要約
視細胞の変性疾患は、網膜の光受容細胞の進歩的な損失を取り返しのつかない失明を引き起こします。人工網膜は、人工的に患者に分かりやすい視覚認識を引き出すことを願って存続の網膜神経細胞を刺激することによって視力を回復しようとすると、視細胞の変性疾患の新たな治療法です。現在人工網膜電気網膜を刺激するが、患者にナチュラル ビジョンの高い視力の回復に相当な物理的な障壁に直面する電極の配列を使用している患者に限られた視力を回復の成功を実証しています。ネイティブの神経伝達物質を使用して化学神経生体電気に代わる刺激し、電気神経刺激を用いた人工網膜に関連する根本的な制限を回避することが可能します。具体的には、化学的神経網膜によって使用される通信と同じ自然剤神経伝達物質の非常に少量を注入することにより患者に同程度以上の visual acuities とより自然なビジョンを復元する可能性があります。化学シナプス、現在電気補綴物に比べはるかに細かい解像度で。ただし、比較的未踏刺激パラダイムとして培養網膜の化学的刺激を達成するための確立されたプロトコルではありません。この作業の目的は、網膜の化学ニューロモジュレーションの潜在的なまたは類似を勉強したい者の網膜の化学的刺激を達成するための詳細なフレームワークを提供する神経組織体外。今回、実験のセットアップと網膜神経節細胞 (RGC) スパイク応答視覚と同様の軽い応答野生型を引き出すための方法論について述べるし、注入による視細胞変性 wholemount ラット網膜のボリュームの制御ガラス マイクロ ピペットとカスタム マルチポート マイクロ流体デバイスを用いた網膜の空間に神経伝達物質グルタミン酸。この方法論とプロトコルが他の神経伝達物質やその他の神経組織を用いた神経調節のために適応する十分な一般的です。
概要
視細胞変性疾患、網膜色素変性症、加齢に伴う黄斑変性症などの主要な視野の損失の継承可能な原因は、現在不治1,2。これらの病気は、さまざまな特定の遺伝の突然変異から起こるが、視細胞の変性疾患はグループとして最終的に盲目を引き起こす網膜の光受容細胞の進歩的な損失によって特徴付けられます。光受容体のトリガーの広範な網膜全体改造しますが、双極細胞など、網膜の神経細胞生存の損失のままそのまま視細胞変性3 の高度な段階でも比較的機能、4,5,6,7。
メカニズムとこれらの疾患の病態はよく特徴付けられて3,4,5,6,7をされているが、効果的な治療法は、とらえどころのないままです。過去 3 年間、世界中の研究者が視細胞変性疾患遺伝子療法8、幹細胞治療9を含む影響を受けた人々 に視力を回復のための治療のさまざまなを検討しました。網膜移植10、および存続の網膜ニューロンの人工的な刺激11,12 。これらの最も臨床的に利用可能な従来の目標を特定のパターンで双極細胞または Rgc を電気刺激するために電極の配列を利用して人工神経機器である人工患者11人工視覚認識を作成します。アーガス II13アルファ IMS14デバイスなどの現在の世代電気補綴臨床承認を達成しているし、復元することによって患者の生活の質を改善できるという予備調査は示した、網膜 (網膜の前面) 上と subretinal 視 (網膜) 背の測定デバイス15,16を注入しました。世界中の研究グループはこれらの第一世代のデバイス17,18,19,20の成功を超えて人工網膜の進展に取り組んでいるが、直面しています。電気の義足患者への法的な失明レベル以下高視力視力の回復が可能の設計の難しさ。最近の調査は示したこと安全に刺激するために大規模な電極の使用が余儀無くされる電荷注入制限のため人工の電気ベースは挑戦により、現在の世代よりも高分解能を達成するため、空間分解能、すなわち視力11,21を犠牲にして網膜神経細胞。さらに、電気刺激はさらに主な理由はそれが本質的に不自然な刺激パラダイム21それは通常近くのすべてのセルを刺激し、したがって患者では、不自然と混乱の認識を引き出すために、制限します。それにもかかわらず、電気刺激の初期の成功は、その人工の神経は、視細胞の変性疾患の効果的な治療をすることができますを示しています。これはさらに効果的な治療は、神経伝達物質の化学物質、化学シナプスでコミュニケーションの自然なエージェントと網膜を刺激することによって達成可能なかもしれないことを仮定する 1 つを導きます。本稿で紹介した方法の目的は、化学的刺激、生体電気に代わる刺激として、網膜の神経細胞間のシナプス通信の自然のシステムを模倣するように努めるの治療の可能性を探索するには人工。
化学人工網膜へ治療の化学刺激の概念の翻訳はネイティブ神経伝達物質のグルタミン酸塩、マイクロを介してリリースなど少量でターゲット網膜神経細胞を化学的に活性化に依存しています。視覚刺激への応答で microports の大規模な配列を構成するデバイス。このように、化学人工になる自然化学信号を網膜に達する光子を変換するバイオミメティック人工視細胞層本質的に。これらの化学信号通常網膜シグナル伝達に利用されている同じ神経伝達物質を使用し、正常な視力経路、結果として得られる visual によって使用される同じシナプス経路を介して変性網膜の存続の網膜神経細胞を刺激するので化学の人工網膜を通じた知覚可能性がありますより自然で分かりやすい 1 つを介して電気的人工誘発に比べています。さらに、非常に小さく、電極とは異なり、高密度に配列した神経伝達物質を解放する microports を行うことができますので潜在的な化学補綴できるかもしれないより焦点刺激を達成するために高い空間電気義足より解像度。したがって、これらの潜在的な利点に基づいて、化学人工網膜は電気義足に非常に有望な代替手段を提供しています。
網膜の化学的刺激、検討されている比較的少し最近まで。一方、網膜の電気刺激は体外22,23、生体内で23,24、および臨床研究13 を通じて仕事の十年にわたっても特徴とされています。 ,14, 化学的刺激の研究はいくつかの in vitro作品25,26,27,28に排他的に限定されています。梨田と Finlayson26と過激派ら27は、網膜上の網膜培養網膜ニューロンのグルタミン酸誘発反応を記録する単一電極と電極 (MEA) をそれぞれ、使用して化学的刺激を示した。もっと最近、ラウントゥリーら28は、網膜上の複数のサイトから神経細胞の反応を記録する網膜側と MEA からグルタミン酸を使用してオフにして網膜の経路の差の刺激を示した。更なる研究が多くを調べることが不可欠であるが、これらの作品は予め化学的刺激の可能性を確立して、このアプローチ以外の側面に対処ところ25,26,27,28、前述の通り化学人工網膜にこの概念を翻訳する前に両方の in vitroとin vivoの動物モデルで治療刺激パラメーターを微調整します。しかし、現在本邦網膜の化学的刺激を達成するための確立された方法論がない、そのような細部で以前の作品で使用される方法が記載されていない複製研究のために不可欠になります。したがって、メソッド本の根拠体外前研究27を複製するどちらかに興味がある研究者の網膜の化学的刺激を実施するための適切に定義されたフレームワークを提供することです。 28または化学神経のこの初期のコンセプトをさらに進めます。
Wholemount 網膜視細胞変性の進行を密接に模倣視細胞変性ラット モデルおよび野生型ラットの網膜神経細胞の化学的刺激培養を行うためのメソッドを示す人間の病気。生体外モデルでこの刺激法の開発の背後にある理論的根拠はさまざまな刺激パラメーターの治療の範囲を評価してが不可能または困難でで観察する神経応答特性に関する研究vivoモデルでは、初期の研究、特に中に焦点を当てたこのアプローチの可能性を評価します。この手順では市販のシングル ポート ガラス マイクロ ピペットとカスタムを介してターゲット網膜近く 1 mM グルタミン酸の少量を提供することにより網膜のシングル サイトと同時複数サイトの化学的刺激を表示します。マイクロ多ポート マイクロ流体デバイスをそれぞれ。一方、単一サイト、複数サイトの両方の刺激は、化学神経の治療の可能性の調査の基本的な目的を達成する、それぞれはユニークな利点と異なる目的を果たします。市販の予ガラス マイクロ ピペットを達成する可能性があります、単一サイト刺激単一サイトで網膜の地下に直接化学物質を注入するため、オブザーバブル RGC スパイク率を調査する提供しています視覚誘発の光応答に似た応答は、注射部位の下で先んじて誘発されることができます。その一方で、マルチサイト刺激を特殊加工したマルチポート マイクロ流体デバイスを必要とする網膜の表面に複数のサイトで空間的化学物質を注入するため、どれだけグルタミン酸誘発 RCG を調査するのに役立つ応答パターンはパターン刺激研究におけるグルタミン酸噴射パターンに対応します。
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プロトコル
ケアと実験動物の使用のため国立研究評議会のガイドで説明されているガイドラインに従ってすべての動物実験を行った。動物の処理および安楽死のプロトコルが審査し、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) イリノイ大学シカゴ校の承認します。
1. 動物モデル
- 野生型ロング ・ ラット
- 標準的な 12 時間日または夜リズムの発生男女 24 32 日古い野生型長いエバンス フード付きラットを調達します。
- 暗闇は、実験を開始する前に 1 時間完全に暗い部屋に置くことで、ラットを適応します。
- S334ter 3 ラット
- ラインを越えるトランスジェニック アルビノ ホモ S334ter 3 ラット (どちらかの性)、色素の野生型ロング ・ ラット視細胞変性を示す色素のヘテロ接合体 S334ter 3 ラットを生成する変異型ロドプシン遺伝子の 2 つのコピーを表現します。人間の網膜色素変性症29,30進行に似ています。
- 標準的な 12 時間日または夜リズムのヘテロ接合体の子孫を上げるし、次の視細胞変性段階に対応する次の年齢の実験のためにどちらかの性のラットを使用: 初期段階の変性: 14-20 日古い;中間ステージ変性: 21-27 日;後半ステージ変性: 28-35 日。完全にブラインド: > 50 日経過。
- 暗闇は、実験を開始する前に 1 時間完全に暗い部屋に置くことで、ラットを適応します。
2. エイムズの中規模ソリューションと灌流システムの準備
図 1: 実験装置の概略図。ガラス マイクロ ピペット(A)と(B)のカスタム マルチポート マイクロ流体デバイスを用いた化学刺激の実験装置の概略図。網膜は、pMEA の配置、pMEA 穿孔を通して上下両方から、新鮮な酸素のエイムズ中ソリューションを継続的に灌流します。神経応答信号、pMEA の電極によってピックアップは、データ集録コンピューターに MEA 増幅器を通して供給されます。それぞれ、緑色の LED と、8 チャンネル ・ プレッシャー インジェクターを使用して視覚的・化学的刺激を行うし、両方の刺激が高精度の 3 軸でピペットの位置にも使用される専用刺激コンピューターによって引き起こされるマニピュレーターです。倒立顕微鏡、実験中に網膜を観察するために使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 実験のセットアップ。(A) すべてのコンポーネントの相対位置を示す実験のセットアップを完了の写真。MEA 増幅器システムは、網膜を目視で確認し、実験中に接続された高速カメラによる画像のデジタル デバイス網膜インターフェイスに使用される倒立顕微鏡上に配置されます。上部と下部の灌流、個別に調整ソレノイド制御灌流システムを使用しています。インピー ダンス測定、位置制御、噴射圧インジェクター、マイクロマニピュレーター、およびパッチ クランプ アンプを使用して達成される (オレンジ ボックス; B で詳しく示されている)、それぞれ。マイクロ ピペットまたはデバイスがインピー ダンス測定用パッチ クランプ パッチアンプ用アダプターに挿入され、ガントリーに搭載 (緑のボックスによって示される; C で詳しく示されている) マニュピュレーターを使用して位置決めを容易にします。(B)実験における計測・制御機器のクローズ アップ: 8 チャネル圧インジェクター、マニピュレーター制御システム、インピー ダンス測定用パッチ クランプ アンプ、灌流除去用吸引容器。(C)マルチポート デバイスを示す注入システム ガントリーのクローズ アップは、ピペット ホルダー、パッチ クランプ パッチアンプ用アダプター、マイクロマニピュレーターとインターフェース。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 灌流セットアップします。(A) 上の灌流吸引と視覚的な光刺激用の緑の LED の場所を示す MEA アンプの上部の写真。(B)上の灌流・吸引、pMEA、インピー ダンス測定用参照電極の正確な位置を示す pMEA 灌流チェンバのクローズ アップ。(C)下灌流プレートの顕微鏡写真。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
メモ: は、図 1図 2、および図 3を参照してください。
- 900 mL の室温 (~ 21 ° C) で脱イオン水を測定し、1 リットル容器に配置。
- バブリング機構を使用して 100% CO2と水を灌流します。
- 1 L の容器に水を粉エイムス媒体の 8.8 g を追加します。
- エイムスの媒体数 mL の脱イオン水が粉末エイムス媒体のすべてのトレースを削除し、1 L コンテナーに追加のコンテナーをすすいでください。
- 重炭酸ナトリウム溶液 (7.5 %w/v31) 25.3 mL を 1 L コンテナーに追加します。
- 1 L の最終巻にソリューションをもたらす追加の水を追加します。
- 約 5 分の CO2と水を灌を続行します。
- CO2灌流を停止し、灌 95% O2と 5% CO2少なくとも 30 分または pH が 7.4 で安定するまでの医療グレードのガス混合ソリューションを開始します。
注: この議定書の目的のためエイムス媒体は室温で保管 (~ 21 ° C) から発生するアウトガスが CO2または O2を防ぐために実験を通して空気泡と灌流線を閉塞することができます。 - 70% のエタノールの充填により上下流管をきれいにし、脱イオン水で 3 回両方の線を洗います。脱イオン水と空気と一番上の行と下の行を入力します。
3. Wholemount 網膜の準備
図 4: 網膜の解剖と wholemount の準備。視細胞変性動物から取られるそのままのアイカップの(A)の写真。(B)は、それを平らに縦カットで網膜の顕微鏡写真。(C)網膜をフラット化した後それは、感光面をメッシュを接触とメッシュ グリッド上に配置されてし、ひだまたはカールされた端がないため保証するために (血流中) の外の空気で平坦化します。(D)メッシュと網膜神経節細胞面電極を接触と、pMEA に迅速に転送、酸素エイムス媒体すぐに灌流します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 多孔電極。(A)プロトコルで使用される多孔電極の写真。網膜は酸素エイムス媒体で継続的な血流を許可するように pMEA チャンバー内 (B で詳しく示されている赤い四角形によって示される) 電極アレイに配置されます。(B)電極アレイ電極間穿孔の配置を示す自体の顕微鏡写真。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
メモ: は、図 4と図 5を参照してください。
- ハンドヘルド赤 LED 懐中電灯を使用して、薄暗い赤い照明を提供、IACUC プロトコルに従って二酸化炭素窒息続く頚部転位または別の選択した方法を介して動物を安楽死させます。
- 宝石商の #5 鉗子を使用して両方の目を摘出し、新鮮な酸素のエイムズ メディア ソリューションの約 3-4 mL で 60 mm 径シャーレの除核目を配置します。
- 赤フィルター画面カバー上部と下部の照明と解剖顕微鏡で目を観察、メスやはさみのペアを使用して角膜の顔で小切開を行います。
- この小さな切開から角膜の端にカットし、角膜の全体の端のまわりの円周セクションのカットを拡張します。レンズ、半透明の水性と硝子体液と一緒に今戸建角膜を削除します。
- 軽く押しながら鉗子の 1 つのペアとアイカップは慎重にアイカップの反対側に 2 つの小さな切開を確認します。次に、鉗子の 2 つのペアを使用して、優しく切開のアイカップを引き離し、強膜から網膜を分離するため。 強膜とアイカップから網膜全体をゆっくりと持ち上げます。それはまだ接続されている場合、視神経をカットします。
- 半分または四分の一セクション、はさみを使用して取得する網膜の縦方向のカットを行い、メッシュから神経節細胞 (網膜の凹面側) 直面するとナイロン メッシュ (100 μ m スレッド径 350 μ m を開く) を 1 つの網膜セクションを軽く広げ。
- メッシュと網膜 pMEA 面と接触して神経節細胞と多孔電極 (pMEA) に配置します。場所で網膜を保持するメッシュの上にゆっくり加重スライス グリッドを配置します。
4. MEA とデータ集録のセットアップ
図 6: pMEA のノイズレベルします。(A)高の永続的なノイズを出展 pMEA 電極のサブセットの代表的な録音。このノイズは特に接触パッドで、pMEA 上 pMEA の接触パッドと穴あきポリイミド薄膜層の通常の摩耗の結果として MEA アンプのピンの間の適切な接触の不足のため通常は。騒音の他の可能な源は通常 pMEA アンプ接触パッド上に流出ソリューションです。貧しいピンによる永続的なノイズは連絡および/またはパッド通常は良い接触や掃除や、パッドをそれぞれ乾燥を取得するアンプ内 pMEA の位置をシフトすることによって修正することができます連絡先のソリューションを流出します。清掃や pMEA 位置をシフトでノイズを除去できない場合、pMEA は完全に交換する必要があります。(B) pMEA とアンプとの間の良好な接触を持つクリーン pMEA pMEA 電極のサブセットからの騒音レベルの代表的な録音。通常、平均騒音レベル ±16 μ V 以内ですこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
メモ: は、図 6を参照してください。
- 薄暗い赤照射 pMEA MEA のアンプを置き、アンプのラッチを閉じてください。
- 脚注記号は既に pMEA チャンバ リングの存在しない場合エッチング 2 'X'-形マーク ブーム スタンド マウント顕微鏡の上から容易に目に見える地域に約 5 mm 間隔の間隔。
- PMEA チャンバ内トップの灌流のコンセントを置き、1 分あたり約 3 mL の灌流率を達成するためにトップの灌流バルブをオンにします。必要な出納レベル (~ 5 mm 深い) で上部の吸込口の位置し、それが動作していることを確認します。
- データ収集コンピューターのデータ集録ソフトウェアを開き、データの受信を開始する 'プレイ' ボタンをクリックします。PMEA のすべてのチャンネルがノイズないと録音の神経信号であることを確認します。
- 倒立顕微鏡の視野のライブ画像をモニターで見て、ソリューションは、灌流の底板を流れる証拠 pMEA の底面を観察します。
5. グルタミン酸刺激の準備
図 7: ガラス マイクロ ピペットとマルチポート マイクロ流体デバイス。(A)マイクロ ピペットまたはデバイスを挿入する前にピペット ホルダーです。銀/塩化銀電極 (50 μ m 径) 電気的インターフェイスへの端にアダプター パッチ クランプ パッチアンプ用アダプターと結合されます。(B)写真ガラス マイクロ ピペット ピペット ホルダーの空気注入を開始するために使用圧力ポートの位置を示すとインターフェイスで接続。(C)カスタム マルチポート マイクロ流体デバイス (1 cm 1 cm 0.134 cm) カスタム 3 D プリントされた据え付け品に添付がありステンレス製管を通ってピペット ホルダーと接続します。2 つのレイヤーで作製したデバイスは、8 microports (直径 14 μ m) 下部層 (340 μ m 厚)、8 つのチップの貯水池 (直径 1.6 mm) (厚さ 1 mm) の最上位のレイヤーにグルタミン酸を格納します。8 microports デバイスの底層でのそれぞれは独立して面内マイクロ経由で上層のオンチップ貯水池に接続され、各チップに貯水池順番経由で 8 チャンネル ・ プレッシャー インジェクターの圧力ポートに接続、パターン化されたマルチサイト注射用 microports の独立した作動できるようにフレキシブル チューブ。(D) 8 つの個別アドレス指定可能なオンチップ堰とチューブの入り江の配列を示すチューブ インターフェイス器具を取り付ける前にピンセットで開催マルチポート デバイスのクローズ アップ。(E) 、pMEA の電極に合わせて 200 μ m 間隔の 3 × 3 の構成で配置 8 14 μ m 径の microports を表示するデバイスの底面の顕微鏡写真。中央ポートがデバイスの作製中に配置を厳密に使われていた、マルチサイト注射用 microports 外 8 が利用されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
注: は、図 7を参照してください。
- ストック グルタミン酸備えた酸素エイムス中ソリューション作業濃度 1 mM グルタミン酸で 0.5 mL サンプルを得るために混合することによってグルタミン酸ソリューションを準備します。
- 予 10 μ m 径のピペットまたは 50 μ m 径の銀/塩化銀線電極を含む標準的なピペット ホルダーにマルチポート マイクロ流体デバイスに接続されているステンレス鋼棒を慎重に挿入します。
注: インピー ダンス検出を使用できない場合は、銀/塩化銀線電極が省略されるかもしれません。 - ピペット ホルダーのパッチ ・ クランプ パッチアンプ用アダプターとのインタ フェースしチャンネル圧力噴射システムの 1 ガラス ピペットを利用した場合にピペット ホルダーの圧力ポート ルアー接続を接続または接続のそれぞれの圧力ポート ルアー接続圧力噴射システム、マルチポートのデバイスの場合のチャンネル 1 8 8 注入ポート。
- 手動で圧噴射システムをオンにし、チャンネル 1 (または該当するチャンネル 1-8) を入れます。システムは大気に出された 0.1 psi に射出圧力を設定ことを確認します。
- マイクロマニピュレーターをオンにし、マニピュレーター コント ローラー '調整' ボタンを押して調整します。マニピュレーターの位置をマイクロ ピペット チップ (または該当する場合、デバイスの下部) は MEA 増幅器より約 30 mm。
- グルタミン酸ソリューション (標準エイムス中グルタミン酸 1 mM) で小さいペトリ皿を入力し、マイクロマニピュレーターの下に配置します。圧力噴射装置 (H2O で-13 の吸引圧) の 'Fill' ボタンを押してマイクロ ピペット チップ (またはデバイス) ソリューションに塗りつぶしを下げるガラス マイクロ ピペットで目に見えるソリューションのおよそ 20 の mm があるまで、またはマルチポートのデバイスのチューブです。
- マルチポートのデバイスを使用して、圧インジェクターのオフ、1 チャンネルを切り、2-8 のチャネル プロトコルを繰り返します。マイクロ ピペット チップまたはソリューションからの装置を持ち上げて、シャーレを削除し、pMEA チャンバー上マニピュレーターの位置します。
- ブーム スタンド式実体顕微鏡を使用して、pMEA チャンバ リングにエッチングされた脚注記号にマイクロ ピペット チップまたはデバイスの角を合わせます。'ストア参照 A' と ' ストア参照 B' ボタンを使用してコントロール ソフトウェアにマニピュレーターの位置を保存 (または単に注: マニピュレーターの座標を手動で) pMEA 電極を用いたマニピュレーターの座標系にマップします。
- マニピュレーターの制御ソフトウェアを使用して、堅牢な自発活動とターゲット pMEA 電極を選択し、ガラス micropipettewith ターゲット電極を配置する 'チャネルに移動」ボタンをクリックします。
6. 網膜とのインタ フェースします。
- インピー ダンス測定が可能です、パッチ クランプ アンプをオンにし、ピペット ホルダー内銀/塩化銀電極のインピー ダンスを可視化する「スタート」ボタンをクリックしてインピー ダンスの可視化ソフトウェアを開始します。観察しながらリアルタイム インピー ダンス信号徐々 に低くピペットまたはデバイス インピー ダンスの急激な増加によって示される、網膜の表面を接触するまで信号 (図 8を参照)。保存または網膜の表面の位置をメモしておきます。
- インピー ダンス測定が利用できない場合は、これは精度が低くなりますが目視観察により網膜の表面が付いている接触を検出します。目に見えて MEA チャンバーでエイムズ メディア ソリューションの上面接触するまでピペットまたはデバイスを下げます。
- 、倒立顕微鏡で網膜の上を観察しながらゆっくりと下げて、ピペットまたはデバイス網膜表面との接触が行われたことを示す、網膜の最表面が歪んでいる目に見えない。保存または網膜の表面の位置をメモしておきます。
- 地下の刺激のためさらにピペットを下げる (S334ter 3 網膜) の 40 μ m または 70 μ m (野生型網膜) のため。
- 圧力噴射 (0.1 psi) を使用してセル付近のマイクロ ピペット チップ デバイス microports はデータ集録と神経の信号を観察することによってグルタミン酸刺激を受け入れるかを決定するいくつかの短い期間 (10-30 ms) 注射を行うソフトウェア。
注: 成功した注射がはっきりと見えるスパイク率バーストまたはスパイク抑制を引き出すでしょう (図 9を参照)。応答が観測されない場合、異なる電極でマイクロ ピペットまたはデバイスを再配置します。
図 8: インピー ダンス測定します。(A)インピー ダンス測定法の模式図。パッチ クランプ アンプを使用して、マイクロ ピペットのインピー ダンスでは網膜の表面に向かってゆっくりと下げます、継続的に監視されます。マイクロ ピペットは、網膜上がとき、エイムズの中の比較的高いイオン伝導性と低インピー ダンス読書。マイクロ ピペットは、網膜の表面との接触、銀/塩化銀ワイヤーを介してイオン伝導度が減少し、インピー ダンス測定の急激な増加を引き起こしています。(B)インピー ダンス変化を表示するプロットは、直前に、網膜の表面にピペット チップの接触後に記録されます。インピー ダンス測定は、マイクロ ピペット チップ ソリューションが比較的低い (左側のオレンジ色の領域で示される) の接触の直前に。一度接触が行われる (赤矢印と右上緑の領域によって示される)、インピー ダンスは急速に網膜の組織との接触時にイオン伝導度減少により増加します。実際には、網膜の表面は測定されたインピー ダンス (赤の矢印の位置) の急な上昇の開始に対応する高さとして登録されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: 視覚的、自発的、中に神経活動の記録とグルタミン酸注射記録します。高域通過を示す 9 つの pMEA 電極から(A)代表的な録音は緑色の LED で視覚的な光刺激中電極データをフィルターし、それぞれの四角形がユニークな電極から神経のデータを示しています。各電極の記録は、左の y 軸に表示される一般的な電圧スケールと緑の LED (タイミング各プロットのオレンジの矢印で示すように) 電源を入れた後最初の 1 秒間に収集されたデータを示しています。スパイクは、-18 μ V (各電極のプロットで水平方向の赤い線) のしきい値電圧を使用して識別された、緑の電極データを黒の痕跡が表されます。視覚刺激は、トップ センター光抑制反応を持っていた 1 つを除くすべての電極でスパイク (励起) のバーストを発生します。(B)注入または視覚刺激せず自発神経活動を示す同じ電極用の同様のプロット。小さいバーストだった存在が、スパイクのパターンが視覚刺激への応答に記録されたそれらと非常に異なって。(C)電極の同じサブセットからの代表的な録音は中心電極 (タイミング各プロットのオレンジの矢印で示されます) でグルタミン酸注射の直後に記録されます。注入されたグルタミン酸は、視覚誘発スパイク バーストに非常に類似していた中央電極の急激な増加のバーストを引き出した。他のすべての電極は化学刺激法の罰金の空間分解能を示すグルタミン酸注射による影響を受けませんでした。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
7. 網膜の記録と刺激プログラムを開始します。
- 網膜の最表面に向かって緑色の LED を向けます。ファイル名を入力し、「レコード」ボタンをクリックすると専用の録音コンピューターでデータ集録ソフトウェアを使用して記録を開始します。
- 録音が始まったら、刺激制御プログラムを開き、「刺激ファイルの読み込み」ボタンをクリックして既定の刺激ファイルをロードします。次に、以下の注で説明した刺激とデータ取得プロトコルから成る既定の刺激ファイルを開始する「刺激ファイルを実行」ボタンをクリックします。
注: (i) 30 試験 2 s、2 s オフの完全なフィールド フラッシュ (5 lm/m2の輝度) を緑の LED を使用します。(ii) 120 秒の緑の LED を使用して似たようなタイム スケールで網膜の自発活動を記録することがなくデータ。(iii) 1 以上のグルタミン酸注射 (注入量約 100-300 pL) 時間 10-30 ms 注入 0.1 psi と 3 s interpulse 期間でグルタミン酸注射の 30 の試験から成るセット。複数サイトにわたる注射の場合同時に注入する 2 つ以上のポートを選択します。
図 10: 視覚的、自発、およびグルタミン酸応答の刺激前後ヒストグラム。(A)代表刺激前後のヒストグラム (30 ms binwidth)図 9 a電極のサブセットからスパイク データの視覚的な光刺激の 20 試験全体の平均。一般的なスパイク評価尺度は、すべての電極に適用し、左の y 軸に表示されます。各電極のプロットの黒い線は、緑の LED の電源を入れた後の最初の 2 番目の中に記録されたすべてのスパイクは平均スパイク速度を表します。見ることができる視覚的な刺激の光に一時的な抑制反応を持っていた上部の中央電極を除くすべての電極で過渡的興奮スパイク レート応答が発生しました。(B)平均自発スパイク レート応答はあらゆる視覚的または化学的刺激せず同じ電極で記録されます。刺激せずに、各電極スパイク率比較的一定であります。(C)平均スパイク レート応答は中心電極上の場所でグルタミン酸注射に対して同じ電極で記録されます。明らかだけ過渡応答は、注射部位の直下に電極で興奮性の応答です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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結果
通常、野生型の網膜と視細胞を化学的に刺激するためにこのプロトコルを使用することができる退化網膜光受容体の喪失による実質的な携帯電話改造にもかかわらず。退化したどちらかの光受容体を用いた実験を開始または野生型網膜、準備するのに記録と刺激装置 (図 1および図 2) 必要性および pMEA (図 5) を最小限に抑えるにきれいになるべきである前に、各電極のチャネル (図 6) のノイズ。視細胞変性網膜が薄く、そのため野生型網膜より敏感、両方同じ解剖手順 (図 4) に使用します。新鮮な酸素のエイムズ媒体とすることができます継続的に潅次郭清、網膜が慎重に神経節細胞面を電極にして pMEA と (図 3 a)、MEA アンプ内...
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ディスカッション
ここで紹介した方法は、前記網膜神経細胞は化学的に網膜体外の地下にネイティブの神経伝達物質の化学物質を注入することによって刺激されるユニークな神経刺激パラダイムを示します。この化学刺激テクニック選択性高い焦点ターゲット ニューロン特異性など従来の電気刺激法をいくつかの利点を提供しています。上記の詳細をどのように小さなターゲット網膜神経細胞のいずれかを使用して近くに神経伝達物質グルタミン酸の量空気注射配信のシングル ポート ガラス マイクロ ピペットまたはカスタム マイクロ マルチポート マイクロ流体デバイスを引き出すプロトコル生理学的に有意な RGC 反応。このプロトコルは、グルタミン酸だけで実証されている、プロトコルは他の種類の神経伝達物質と網膜の化学的刺激を調べる場合に役立ちます。さらに、このプロトコルは、他の MEA のデザインで説明した電気生理学的記録32 pMEA を使用することが望ましいですが非穿孔型などされる可能性があります、pMEA として同様の結果を達成するために。次の段落で、プロトコルの最も重要な手順の一般的な問題と制限をトラブルシューティングする方法と...
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
本稿で仕事に支えられた全米科学財団、研究の新たなフロンティアとイノベーション (NSF-年度に新設された) プログラム許可番号 0938072。本稿の内容は著者の責任であり、NSF の公式見解を必ずしも表さない。著者はまた彼の仕事の設計とテストの化学刺激の初期の実験のセットアップおよび氏 Ashwin ラグーネイサンで使用するマルチポート マイクロ流体デバイスを評価の設計、製造、および彼の仕事のための博士国内過激派を感謝したいです。本研究では。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 微小電極アレイ、穴あきレイアウト | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Multi Channel Systems, GmbH | の底部灌流グランドプレート | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3軸電動マイクロマニピュレーター | サッター機器 カリフォルニア州ノヴァト | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| マイクロマニピュレータ制御システム | サッター機器 カリフォルニア州ノヴァト | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| ガントリー型リニアスライド付きマイクロマニピュレータースタンド | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | |
| https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html 8チャンネル プログラマブルマルチチャンネル圧力インジェクター | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ ベンダー: Harvard Apparatus UK | PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm ベンダー: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A 統合パッチ クランプ アンプ | 分子デバイス、サニーベール、カリフォルニア州 | Axopatch 200A | Axopatch 200A は、新しいモデル Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| パッチ クランプに置き換えられましたheadstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | |
| http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| プリプル 10 μm先端径ガラスマイクロピペット | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | |
| https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745T |
| Microscope boom stand with dual linear ballベアリングアーム | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | |
| http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 | |
| Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | EclipseTi-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 | |
| 重炭酸ナトリウム | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| 60 mm ペトリ皿 (高さ 10 mm) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm Clear Petri Dish; |
| https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | |
| https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments、フロリダ州サラソタ | 503378 | |
| https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ ナイロンメッシュキット | 、ワーナーインスツルメンツ、ハムデン、CT | のNYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| ハープスライスグリッド | ALAサイエンティフィックインスツルメンツ、ファーミングデール、ニューヨーク | HSG-5AD | |
| http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ Ag/AgCl参照電極ペレット | マルチチャネルシステム、GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4チャネルバルブ制御重力灌流システム | ALAScientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS顕微鏡カメラ | Andor Technology, ベルファスト, 英国 | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| 銀線 (50 μm直径) | Fischer Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ | 州AA44461G5 | |
| https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 タイゴンマイクロボアチューブ(直径1.6 mm) | コールパーマー、バーノンヒルズ、イリノイ州 | EW-06419-01 | |
| https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 チルティングツールホルダー、スチールカニューレ付き | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | of these were used for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | メーカー: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux ベンダー: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith &ウェッソンギャラクシーレッド懐中電灯 | スミス&ウェッソン、2100ルーズベルトアベニュー、スプリングフィールド、マサチューセッツ | 4588 | メーカー:https://www.smith-wesson.com/ ベンダー: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | MultiChannel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | |
| http://www.ni.com/labview/ NIS-Elements: 基礎研究ソフトウェア | ニコン, 東京, 日本 | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
参考文献
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