方法論記事

同所性同種肺がん細胞生着の効率を高めるブレオマイシンとマウスの気道をプレコンディショニング

DOI：

10.3791/56650

⸱

2018年6月28日

 ,  , 
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

事前の負傷で気道をコンディショニングすることでマウスの肺に肺癌細胞の同所性同種移植を大幅に強化する手法について述べる。このアプローチは肺微小環境、転移播種、肺癌併存、間質相互作用の研究にも適用可能性があり、派生した異種移植片をより効率的に患者を生成します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺がんは、異種生物である致命的な治療難治性の疾患です。理解し胸部悪性腫瘍の完全な臨床スペクトルを効果的に治療するには、多様な人間の肺の癌のサブタイプとステージを要約することができます追加の動物モデルが必要です。同種または異種移植モデルは多目的、発癌性容量の生体内で、マウスやひと由来の悪性細胞を用いた定量化を有効にします。ただし、マウス細胞の肺への同所性同種移植の非効率性のためのフランクなどの非生理的サイトで肺のがん細胞の生着の上記の方法を行った。本研究ではあらかじめ線維症誘導エージェント ブレオマイシンとマウスの気道をコンディショニングすることで同所性同種肺がん細胞生着を強化する方法をについて説明します。概念実証実験としてマウスの系統にマウスまたは人的情報源から得られた肺腺癌のサブタイプの腫瘍細胞を接がへのこのアプローチを適用されます。我々 は腫瘍細胞の注入前にブレオマイシンと気道が負傷 0-17 から腫瘍細胞の生着が増加を示す 71 100%。大幅にこのメソッドが強化されたは、肺腫瘍の発生率と異なるモデルとマウス系統を使用して後続の副産物。さらに、明らかな移植肺癌細胞を関連する遠隔臓器に肺から発信します。したがって、我々 はの確立し、肺癌の細胞またはラットの量を制限することの新しい直交異方性モデルを維持し、肺癌細胞生理学的に関連する設定での発癌性の能力を定量的に評価するために使用できるプロトコルを提供します。.

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺癌は主要ながんの原因関連死亡世界中1。肺癌患者は転移から最終的に屈する遠い器官、特に中枢神経系、肝臓、副腎、骨2,3,4。胸部の悪性腫瘍は、伝統的に小細胞肺癌 (SCLC) または非小細胞肺癌 (NSCLC) がん5として分類されています。非小細胞肺癌は、最も頻繁に悪性腫瘍の診断、肺腺癌 (LUAD) 肺扁平上皮癌 (LUSC)6など、さまざまな組織学的サブタイプに分割することができます。切除人間原発性肺癌のゲノム解析は、指定された histotype 内腫瘍では多様な分子の摂動、さらに彼らの発散の臨床進行に貢献し、患者の予後を交絡を表すことも明らかにしました。肺癌の顕著な不均一性は、合理的な設計、前臨床テスト、および効果的な治療戦略の実装に重要な挑戦を表します。その結果、多様な携帯電話の起源、分子サブタイプ、およびこの病気の段階を検討する難治性肺癌モデルのレパートリーを拡大する必要性があります。

モデル動物を用いた様々 なアプローチは肺癌生体内で、それぞれ独自の長所と短所の興味の生物的質問によって研究に採用されています。遺伝子組み換えマウス モデル (GEMMs) は腫瘍免疫ホスト7その中その結果特定の前駆細胞の種類に特定の遺伝子変異をターゲットできます。臨床的に関連する、非常に強力な GEMMs に関連付けられている待機時間、変動、および/または肺の腫瘍罹患率が特定の定量的計測と遠隔臓器8後期段階転移の検出に法外なことができます。補完的なアプローチという肺癌細胞、マウス腫瘍から直接を取得もしくは派生文化では、確立されたセルラインとして最初は同系のホストに再導入された同種移植モデルの使用であります。同様に肺癌異種移植片は、ひと細胞または患者の派生腫瘍サンプルから確立されます。ひと細胞ライン異種移植片または患者派生異種移植片 (PDXs) 免疫不全マウスにおける一般的に維持され、したがって完全な免疫監視9を排除します。この欠点にもかかわらず、人間 biospecimens 研究基礎的体内プロパティ GEMM 腫瘍よりもより複雑なゲノム異常のためエンコードひと癌細胞の量を制限することを伝達する道を提供します。

同種および異種移植片の 1 つの便利なプロパティは、がん幹細胞 (TICs) 悪性細胞人口10以内の頻度を定量化する採用、制限する従来の細胞希釈アッセイに従うことです。これらの実験で定義されたセル数は動物の側腹部に皮下し、チックの頻度は腫瘍を取る率に基づいて推定できます。皮下腫瘍しかしより低酸素11でき肺腫瘍微小環境のキーの生理学的な制約はモデル化されないことがあります。マウスの肺に上皮幹・前駆細胞気管内配信は、肺と気道幹細胞生物学12を勉強する方法です。ただし、肺が損傷、ウイルス感染13,14などの生理学的なフォームを受ける最初でない限りこの手法から生着率は比較的低いできます。炎症性間質細胞からのサポートおよび/または肺基底膜の中断は、遠位気道15に関連する幹細胞ニッチに移植細胞の保持を向上させる可能性があります。誘導剤の線維化がすることができます誘導多能性細胞16および17間葉系幹細胞の生着を強化する肺を事前条件も。気道損傷のようなフォームが生着率を適用できるかどうか、腫瘍開始容量と肺癌細胞の伸長がまだ体系的に評価します。

本研究では事前の負傷でマウスの肺をコンディショニングすることで同所性同種肺がん細胞生着の効率を上げる方法をについて説明します。LUAD にこれらの癌は、しばしば予後不良19と相関線維性間質18の開発の重要なサブセットと遠位気道で発生します。自然リボソーム ハイブリッド ペプチド-ポリケチド、ブレオマイシンはマウス20肺線維化を誘導するために広く利用されています。ブレオマイシンの気道注入は最初上皮消耗戦肺胞の炎症細胞、マクロファージ、好中球と単球21の募集を推進しています。遠位気道基底膜再編成22,23細胞外マトリックス (ECM) 蒸着24組織の改造現象が続きます。ほとんどの研究25で 30 日後に解決する線維症単一ブレオマイシン投与の効果は一時的なもの。同種および異種移植腫瘍モデルを用いた場合 LUAD 肺細胞の取る速度が大きく向上できるプレコンディショニング ブレオマイシンとマウスの気道をテストしました。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) イェール大学によって承認されたプロトコルに従ってすべての実験を行った。

1. セットアップ/試薬の準備。

  1. ブレオマイシン
    注意: ベースの世界調和システム (GHS) の分類および化学、ブレオマイシンは GHS08 保健上の危険として分類されます。
    1. 化学のフードにブレオマイシンを準備します。滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 5 mL に 15 U を再懸濁します。
    2. 分注 100-200 μ L グラスにソリューションのバイアルし、それらを将来使用するための-20 ° C で凍結します。正しく再懸濁の日付を持つチューブ ラベルを付けます。この日から 6 ヶ月以内に使用します。
      注: 各マウスの緊張はブレオマイシン26に異なる感度を有する。各マウスの緊張にブレオマイシンの異なる投与量をテストすることをお勧めします。マウス系統とブレオマイシンの代表的な実験で使用される対応する用量は表 1に表示されます。
  2. マウス
    1. 実験に必要なマウスを購入し、マウスに注入前に順応する 7 日間を許可します。バイオ セーフティ フードで輸液を行います。非 BSL2 準拠 BSL2 ルーム ブレオマイシン注入前に制度の標準的な手順を使用して部屋に入って動物を譲渡します。6-8 週齢ではマウスを投入します。
      警告: 注入マウス (BSL2) 有害エージェント、バイオ セーフティ レベル 2 の制度のガイドラインと IACUC 承認します。
      注: マウスの代表的な実験のために購入は材料のテーブルに表示されます。雄マウスのみを使用しています。
  3. 肺癌細胞株
    1. 文化には、それぞれのメディアで細胞が望まれています。注射の前に短いタンデム繰り返し DNA プロファイリングまたは確実に適切な細胞ライン識別する遺伝テストを実行します。体内と体外イメージングしやすく、レンチ ウイルスのチミジンのキナーゼ、緑色蛍光タンパク質 (GFP) とルシフェラーゼ融合記者27、表現すると細胞に感染しを蛍光レポーター陽性細胞を並べ替えるアクティブ セル (FACS) を生着前に並べ替えになります。6 ヶ月ごとにマイコ プラズマのためのラインをテストします。
      1. ウシ胎児血清 (FBS)、10% でロズウェル パーク記念研究所メディア (RPMI) を使用して製造元の推奨どおり H2030 ひとがん細胞株を培養ペニシリン-ストレプトマイシンとアムホテリシン b
      2. 368T1 マウス細胞株 ( KrasG12D; p53-/-マウス由来) を文化ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) を用いた 10 %fbs、ペニシリン ・ ストレプトマイシンとアムホテリシン b
      3. 10% 用いた RPMI PC9 ひとがん細胞株を培養 FBS、ペニシリン ・ ストレプトマイシンとアムホテリシン b

2. ブレオマイシンの治療

  1. ブレオマイシン腫瘍細胞の生着前 14 日マウスの気管内に注入する予定です。
  2. 氷上注射前に 2 h ブレオマイシン株式を解凍します。
  3. 解凍後、望ましい作業集中 (0.02 U/50 μ L または 0.005 U/50 μ L) にブレオマイシンを希釈し、氷の上にそれを維持します。
    注: ブレオマイシンの濃度によって異なります (表 1) 実験用マウス緊張。マウスにおけるブレオマイシンの滴定は、至適投与量を決定する実行必要があります。
  4. 100/10 mg/kg 腹腔内ケタミン ・ キシラジン溶液を注入することによりそれぞれのマウスを麻酔 1 mL 注射器および 27 G 針を使用して、それぞれケタミン ・ キシラジン最終濃度 10 mg/mL と 1 mg/mL で希釈することによって麻酔を準備それぞれ。
  5. マウスの呼吸を監視およびつま先のピンチを採用します。ピンチをつま先までマウスが応答しない場合は、適切な anesthetization を確認します。麻酔中の乾燥を防ぐため目に獣医軟膏を適用します。
  6. そのプラットフォームに対して背部が前歯を掛けることによって、挿管のプラットフォーム上で一度に 1 マウスを置きます。
  7. 気管の可視化を支援するための光ファイバー照明を使用してデコルテを照らします。マウスの口を開くし、滅菌フラット ピンセットで、優しく舌を抜きます。
  8. 呼吸をブロックしないように、針なしの静脈のカテーテルを使用します。白い光でカテーテルの位置は、気管の開口部から放出されます。
  9. カテーテルの上部に達する前歯まで、カテーテルを気管に挿入します。気管内カテーテルの適切な配置を確認するには、口の中でカテーテルの開口部を通して輝く白色光を可視化します。
  10. ピペットを使用すると、ボリューム全体が吸い込まれることを確保するためのカテーテルに直接ブレオマイシンや車 (PBS) の 50 μ L を調剤します。この手順では、無菌条件の下で。
  11. カテーテルが正しく挿入されている場合、マウスはすぐにカテーテルの内容を吸い込みます。全体のボリューム移動、カテーテルまで数秒を待ちます。カテーテルを気管から削除し、10% 漂白剤溶液で処分します。
    注: 手順 2.7 2.11 のマウスごとの平均時間は約 5 分です。
  12. マウスは液体を吸っていない場合慎重に呼吸を監視し、カテーテルの位置を調整します。マウスで呼吸が停止した場合、カテーテルをすぐに削除し、カテーテルを再挿入する前に、通常の呼吸を再開するマウスを許可します。
  13. 回復のための平らな面に背中に IACUC 承認された加熱パッドに注入されたマウスを配置します。全体の手順は、マウスあたり 10 分かかります。完全に回復するまで他の動物の会社への注入を受けている動物は返されません。
  14. 24 h のケージに有害化学物質「使用中」カードを置きます。

3. マウス挿管後の監視

  1. マウスを麻酔から覚ますまで挿管とし、15 分毎の直後に呼吸困難のためマウスを監視します。放置しないでくださいマウスまで胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しています。
  2. 痛みを軽減するために腹腔内ケトプロフェン (5 mg/kg) を挿入します。
  3. マウス 24 h ポスト挿管と週 3 回合併症の兆候を調べます。
  4. プロシージャ、動物の個体識別、プロシージャの種類、時間、麻酔や術後のモニタリング観測の種類の日付の記録を保持します。
  5. 体重減少、呼吸困難、行動異常と体条件スコア マウスを監視 < 2 (脊柱明らか/背骨盤骨のセグメンテーションが触知) 隔週制癌性抗生物質ブレオマイシン注射後。
  6. 呼吸困難の下でマウスや CO2ケタミン ・ キシラジン頚部転位続いて体の質量の 15% の損失を経験しているマウスを安楽死させます。呼吸活性の触診を行うことにより安楽死を確認します。

4. 肺腺癌細胞の生着。

注: は、ブレオマイシン (ステップ 2.1) の注入後 14 日細胞の生着を実行します。

  1. 成長する 75 cm2フラスコで妨げられていない対応するメディアの注射の日前 3 日間手順 1.3 で述べたようにセルを許可します。
    注: 彼らは注射の日で 80% 合流をする必要があります (10 x 2-3 に対応する6セルの行によって各フラスコに)。
  2. 室温で 5 mL の PBS と 75 cm2フラスコに成長している細胞を洗浄します。
  3. PBS を吸引、セルに 1.5 mL のトリプシンを追加し、セルをデタッチ (通常 2-5 分) まで、37 ° C でセルを孵化させなさい。
    注: 光顕微鏡やフラスコの底の簡単な可視化によるプラスチックから細胞の剥離のため 2 分ごとのチェックをお勧めします。トリプシンと孵化の 5 分を超えないようにします。
  4. 10% を含むメディアの 4 つの mL を追加してトリプシンを中和する FBS (4.1 のステップとして同じメディア)。15 mL チューブに細胞を収集し、室温で 3 分間 200 × g で遠心分離機します。
  5. メディアを吸引し、細胞を洗浄する PBS の 5 mL の細胞ペレットを再懸濁します。細胞のペレットを室温で 3 分間 200 x g で細胞を遠心します。この 1 時間を繰り返します。
  6. PBS を吸引し、フラスコあたり 1.5 mL の PBS でペレットを再懸濁します。
  7. トリパン ブルーの 50 μ L でセルの混合物の 50 μ L を混合し、携帯カウンター/検定商工会議所28を使用してセルをカウントします。
  8. マウスあたり 50 μ L で 1 x 10 の5セル (またはその他の金額) を注入する PBS のセルを希釈して細胞懸濁液を準備します。注入前に氷で細胞を保ちます。
    注: は、細胞懸濁液の不足を回避する注入の少なくとも 2 倍以上セルを準備します。
  9. 100/10 mg/kg 腹腔内ケタミン ・ キシラジン溶液を注入することによりそれぞれのマウスを麻酔 1 mL 注射器および 27 G 針を使用して、それぞれケタミン ・ キシラジン最終濃度 10 mg/mL と 1 mg/mL で希釈することによって麻酔を準備それぞれ。
  10. マウスの呼吸を監視およびつま先のピンチを採用します。ピンチをつま先までマウスが応答しない場合は、適切な anesthetization を確認します。麻酔中の乾燥を防ぐため目に獣医軟膏を適用します。
  11. そのプラットフォームに対して背部が前歯を掛けることによって、挿管のプラットフォーム上で一度に 1 マウスを置きます。
  12. 気管の可視化を支援するための光ファイバー照明を使用してデコルテを照らします。
  13. 塊を形成しないように軽く p200 ピペットを使用して細胞を再懸濁します。マウスの口を開くし、滅菌フラット ピンセットで、優しく舌を抜きます。
  14. 呼吸をブロックしないように削除針で静脈のカテーテルを使用します。白い光でカテーテルの位置は、気管の開口部から放出されます。
  15. カテーテルの上部に達する前歯まで、カテーテルを気管に挿入します。気管内カテーテルの適切な配置を確認するには、口の中でカテーテルの開口部を通して輝く白色光を可視化します。
  16. ピペットを使用すると、ボリューム全体が吸い込まれることを確保するためのカテーテルに直接細胞の 50 μ L を調剤します。この手順では、無菌条件の下で。
    注: カテーテルが正しく挿入されている場合、マウスはすぐにカテーテルの内容を吸い込みます。
  17. 全体のボリュームは、カテーテルを旅するまで数秒待ってからカテーテルを気管から削除し、10% 漂白剤溶液で処分します。
  18. マウスは液体を吸っていない場合慎重に呼吸を監視し、カテーテルの位置を調整します。マウスで呼吸が停止した場合、カテーテルをすぐに削除し、カテーテルを再挿入する前に、通常の呼吸を再開するマウスを許可します。
    注: 手順 4.11 4.18 のマウスごとの平均時間は約 5 分です。
  19. 回復のための平らな面に背中に IACUC 承認された加熱パッドに注入されたマウスを配置します。
    メモ: 全体の手順は、マウスあたり 10 分かかります。完全に回復するまで他の動物の会社への注入を受けている動物は返されません。
  20. 腹側の両方全体リブ領域を剃るし、背側 B6129SF1/J ・黒い髪と他のマウス系統のイメージングの前に電気シェーバーを使用します。
  21. 細胞の注入後 2 〜 3 分レトロ軌道ルシフェリンの 100 μ L を注入 (15 mg/mL) インスリンの針を使用します。インジェクション イメージング セッションごとの使用された目を交互に。
  22. 少なくとも 2 分後背臥床位動物生物発光の撮像素子で最大 5 マウスを配置し、発光設定29を使用して腹側画像を取得します。
  23. コントロール パネルの [特定のセル行の発光を測定する分解能と感度設定を調整します。3 分 (または「自動」飽和される場合)、ビニング始まるほとんどのアプリケーションに対して媒体 (4)、F/ストップを = = 1、ビューのフィールド = D、件名高さ = 1.50。
    注: 注入が成功した場合、片肺または両肺の上部の胸の領域に発光信号が検出されます。
  24. 胸骨の横臥位置の上にマウスを反転し、上記と背側の画像を取得します。
    注: 細胞の注入を正しく行わないと、細胞が首、気管の入り口にクラスターがあります。
  25. ケトプロフェンを注入 5 mg/kg 腹腔内に痛みを軽減します。
  26. 彼らのおりにマウスを移動し、ケージの「BSL 2 エージェントで使用」カードを配置します。
  27. マウスが麻酔から覚めるまで挿管、および、すべての 15 分後すぐに呼吸困難のためマウスを監視します。放置しないでくださいマウスまで胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しています。
  28. マウス 24 h ポスト挿管と罹患率のあらゆる印のため週に 3 回を調べます。
  29. プロシージャ、動物の識別、プロシージャの種類、麻酔薬と術後のモニタリング観測と時刻の型の日の航海日誌に記録します。
  30. 体重減少、呼吸困難、行動異常と体条件スコア マウスを監視 < 2 (脊柱明らか/背骨盤骨のセグメンテーションが触知) 隔週ブレオマイシンの予防接種に伴った。
    注: 肺腫瘍を持つマウスは、呼吸器の炎症、体重減少、悪液質、および/または死を示すことがあります。
  31. 呼吸困難の下でマウスや CO2ケタミン ・ キシラジン続いて頚部転位組織の収集の体重の 15% の損失を経験しているマウスを安楽死させます。呼吸活性の触診を行うことにより安楽死を確認します。

5. 生物発光イメージングによる腫瘍増殖のモニタリング

  1. その後 3 日後の生着と毎週、マウスの画像を繰り返します。
  2. 吸入イソフルラン (2%)、(前述の手順 2.4 2.5) ケタミン ・ キシラジンを注入することにより、マウスを麻酔します。マウスの呼吸を監視し、適切な anesthetization を確認するつま先ピンチを採用します。麻酔中の乾燥を防ぐため目に獣医軟膏を適用します。
  3. 腹側の両方全体リブ領域を剃るし、背側 B6129SF1/J ・黒い髪と他のマウス系統のイメージングの前に電気シェーバーを使用します。
  4. マウスが麻酔下で、レトロな軌道ルシフェリンの 100 μ L を注入 (15 mg/mL) インスリンの針を使用しています。2 分代替射出イメージング セッションごとの使用された目を待ちます。
  5. 撮像素子にマウスを置き、4.22 4.24 の手順で説明したように背側と腹側の画像を取得します。
  6. 回復のための平らな面に背中にイメージング後ケージにマウスを配置します。
    メモ: 全体の手順は 5 マウスのグループごと 5 分かかります。放置しないでくださいマウスまで胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しています。
  7. イメージャ/発光解析ソフトウェアを使用して画像を分析します。
    1. 適切な画像を選択し、発光解析ソフトウェアのグループとしてそれらをロードします。
    2. クリックしてROI ツール | スクエア利益 (率 ROI) の正方形の領域を追加します。投資収益率を全体の肺イメージをカバー上部の胸の部分にかぶせます。マウス画像ごとに、この手順を繰り返します。
    3. 右クリックし、同じ ROI をグループ内のすべてのイメージに適用し、マウス、腹側と背側のビューの上部の胸にすべての投資収益率をコピー機能を選択します。
    4. 画像ウィンドウの左上隅で光子関数を選択します。Roi を測定する測定コントロール パネル機能をクリックします。コピーし、さらにデータの分析に最適なソフトウェアに全光束 (光子/秒) を含む出力テーブルを貼り付けます。
    5. 0 日目に測定の投資収益率の値に各マウスの日常投資収益率値を正規化します。

6. 組織分離と処理。

  1. (前述の手順 2.4 2.5 または吸入イソフルラン (2%) でケタミン ・ キシラジンを注入することによりマウスを麻酔します。マウスの呼吸を監視およびつま先のピンチを採用します。ピンチをつま先までマウスが応答しない場合は、適切な anesthetization を確認します。麻酔中の乾燥を防ぐため目に獣医軟膏を適用します。
  2. レトロな軌道ルシフェリンの 100 μ L を注入 (15 mg/mL) インスリンの針を使用しています。2 分待ちます。
  3. このプロトコルから次の手順 4.22 4.24 イメージ マウス。
  4. レトロな軌道安楽死の前にインスリンの針を使ってルシフェリンの 100 μ L 別ステップ 6.2 からもう片方の目に挿入します。
  5. ケタミン ・ キシラジンの腹腔内投与によるマウスを安楽死させる頚部転位 (詳細については手順 2.4 参照) 続いて IACUC によって提供されるガイドラインに従って深い麻酔下マウスがある場合。呼吸活性の触診を行うことにより安楽死を確認します。
  6. 滅菌手術用はさみ、胸骨下の皮膚切開を使用しています。鉗子、手術用はさみを使ったダイヤフラムに沿って筋層を開き、肋骨側面内部胸部動脈を回避するのいずれかを介して切断して胸腔内を公開します。
  7. マウスを灌流心臓の右心房で小切開を行うことで、左心室を 5 mL の PBS を注入します。肺組織の色赤からに行く淡いピンク ホワイト血液灌流が正しく行われている場合。
  8. 鉗子で食道や心臓を掴んで慎重に胸腔内から肺を切除します。優しくティッシュを引くし、外科はさみを使用して慎重に肺組織の穿刺を回避する接続組織を切断します。後の手順で肺気道のインフレのためにできるだけ気管を保持します。
  9. 水没、余分な血液を削除する PBS の 3 ml 6 ウェル プレートで組織を 3 回旋回して肺を洗浄します。
  10. 6 ウェル プレートの蓋に肺を配置し発光の撮像素子で組織を含むふたを配置し、発光画像30。
    注:「取得制御パネル」から以下設定を選択することをお勧め"ビューのフィールド A ="と"件名高さ = 0.75 cm」し、「自動露出」飽和画像を得ることを避けるために。
  11. 消費税し、画像他の臓器の転移が発光、脳、肝臓、副腎、骨、リンパ節、腎臓や脾臓31などによって識別された 6.9、6.10 の手順で行われて。
  12. マウスの気管に針を挿入して 1 ml の 4% のパラホルムアルデヒドの肺を灌流します。場合よく灌流、肺が膨らみます。
    注意: 4% パラホルムアルデヒドは有毒、健康危険性を GHS07 と GHS08。
  13. 4% のパラホルムアルデヒドの 5 mL と 15 mL 円錐に肺を転送します。
  14. 一晩で 30-50 rpm での振動デバイス 4 ° C 4% パラホルムアルデヒドでティッシュの孵化によって肺や他の組織を修正します。
  15. パラフィンや最適な切削温度アプリケーション32によって化合物の肺 (または他のティッシュ) を埋め込みます。
    注: パラフィンは肺の構造を維持する方法、ヘマトキシリン ・ エオジン染色とマッソン Trichrome。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LUAD マウスの肺に癌細胞移植の効率を高めるには、まず事前条件を同所性同種腫瘍細胞の注入 (図 1) に続いてブレオマイシンを使用して航空プロトコルを開発しました。無胸腺を免疫不全マウスに投与した際にもブレオマイシンによる一時的な線維症気道アーキテクチャと増加のコラーゲン沈着 (図 2) の損失によって証明されるように 14 日目を確認しました。これらのマウスの総線維症は、50 日後にブレオマイシン注入 (図 2; 右パネル)24先行研究と一致して解決。

いた事前に調節された車両やブレオマイシンの単回投与で 14 日前系統マウスの肺に異なる起源の LUAD セルにしみ込んでこれらの観察に基づいて、我々。たとえば、確立された人間...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

印象的な臨床の平行線は、肺癌と肺36の他の慢性疾患と記載されています。特に、特発性肺線維症 (IPF) 患者は、肺癌の増加好みを有しこの協会の歴史37,38を喫煙とは無関係です。IPF は、肺のアーキテクチャと ECM39の析出による呼吸機能の低下の進歩的な破壊によって特徴付けられます。また、外科的切除に続いて同時 IPF で初期期非小細胞肺癌患者予後40があります。ほとんどの非小細胞肺癌腫瘍には診断時に線維化コンポーネントが含まれて、この間質反応の程度は予後不良18と相関します。線維症から急性または持続的な組織の損傷は、複数の方法で腫瘍の頻度を増加可能性があります。例えば、損傷後、上皮再生のプロセス変換を受けやすい前駆細胞のプールの拡張可能性があります。また、流入と多様な免疫細胞の機能を助けるかもしれない芽の活性化、成長因子を分泌...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、国立癌研究所 (R01CA166376 ・ D.X. ・ グエンに R01CA191489) と国防総省 (W81XWH-16-1-0227 D.X. グエンに) からの助成金によって賄われていた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ブレオマイシンシグマB5507-15UN注意 健康被害 GHS08
エクセルカテーテル 24Gフィッシャー1484121針を外します。気管内注射用
ケタミン (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL)Butler Schein56344マウスを麻酔する
XylazineButler Schein33198を麻酔する
Ketoprofen, 5,000 mgCayman Chemical10006661Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic OintmentBUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897麻酔下での眼の乾燥を防ぐため
D-ルシフェリン粉末パーキン・エルマー・ヘルス・サイエンシズ社122799発光イメージング用。粉末をPBSで再構成し、使用濃度を15 mg / mLにします。.光から保護する
げっ歯類挿管スタンドBraintree ScientificRIS-100気管内注射用推奨スタンド
MI-150 イルミネーター 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150/EEG2823M気管を照らして視覚化するために
Graefe Forceps、2.75 (7 cm) 長鋸歯RobozRS-5111気管内注射用
シリンジ Luer-Lok 滅菌済み 5mlBD /フィッシャー309646
サテンスムースバイコンエアーデュアルフォイルウェット/ドライ充電式シェーバーConair-マウスを剃るために
ボンはさみ、3.5 "ストレート15ミリメートルシャープ/シャープ確実カットブレードRobozRS-5840SC
15 mL円錐管BD /フィッシャー352097
1.5 mL遠心分離管USA SCIENTIFIC INC1615-5500
バイアルシンチレーション7 mLホウケイ酸ガラスGPIフィッシャー701350
フィルターピペットチップ(200 μL)USA SCIENTIFIC INC1120-8710
リン酸緩衝生理食塩水Life Technologies14190-144
0.25% トリプシン-EDTALife Technologies25200-056
DMEM 高グルコースLife Technologies11965-092
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093
ウシ胎児血清 USDALife Technologies10437-028
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140-122
Amphotericin BSigmaA2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4%Life Technologies15250-061
Countess Automated Cell CounterLife TechnologiesAMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue capフィッシャー/コーニング353135
IVIS スペクトラム Xenogen Bioluminiscenceパーキン・エルマー・ヘルス・サイエンシズ124262in vivo生物発光イメージング用
生体画像ソフトパーキン・エルマー・ヘルス・サイエンシズ・インク128113in vivo 生物発光解析用
XGI-8 ガス麻酔システムパーキン・エルマー・ヘルス・サイエンシズ118918イソフルラン麻酔用
BDウルトラファインII ショートニードル インスリンシリンジ 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in)BD / FisherBD328418眼窩後ルシフェリン注射用
シリンジ 1mlBD / Fisher14-823-434腹腔内注射用
26 G x 1/2 インチ針BD / Fisher305111腔内注射用
4% パラホルムアルデヒドVWR43368-9M注意 健康被害 GHS07、GHS08。ティッシュ固定用
Pipet-Lite Pipette, Unv.SL-200XLS+メトラー・トレド国際
メイヤーのヘマトキシリン電子顕微鏡科学517-28-2
オシンY染色0.25%(w / v)で57%フィッシャー67-63-0
マッソントリクローム染色キットIMEB IncK7228
を視覚化するマッソントリクローム染色用
6ウェルプレートコーニングC3516
ユニバーサルマイコプラズマ検出キットATCC30-1012K
OCT 包埋化合物電子顕微鏡科学62550-12凍結切片用組織包埋用
ライカCM3050 S 研究用 クライオスタットライカCM3050 S染色分析
用切片組織へキーエンス オールインワン蛍光顕微鏡KeyenceBZ-X700
ImageJ米国国立衛生研究所IJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS XGraphPad Software, Inc.-
アチミック(Crl:NU(NCr)-Foxn1nu)マウスチャールズリバーNIH-553
NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) miceJackson Laboratories5557
B6129SF1/J miceJackson Laboratories101043
NIH-H2030 cellsATCCCRL-5914
368T1寛大に提供された Monte Winslow (Standford University)-
PC9 cellsNguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–
BrM3細胞Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62〜
マウス 腹17014411エコラーゲンスーパーフロストプラスガラススライドフィッシャー1255015 62-H2030 、

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