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方法論記事

一過性受容体電位バニロイド型 1 Ultrapotent アゴニストと純粋な小さな繊維の神経疾患のマウスモデルを確立します。

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DOI:

10.3791/56651

⸱

2018年2月13日

 ,  , 
1Department of Anatomy, School of Medicine, College of Medicine, Kaohsiung Medical University, 2Department of Medical Research, Kaohsiung Medical University Hospital, 3Department of Medical Research, Ultrastructural Laboratory, Kaohsiung Medical University Hospital

この記事について

サマリー

本研究は、純粋な小さな繊維エナンチオ (RTX) ニューロパシーの実験モデルを確立します。RTX のユニークな線量 (50 μ g/kg) が患者の特性を模した小さな繊維神経障害モデルを開発するため最適な神経因性疼痛の基礎となる受容分子の意義を調査を助けることができます。

要約

糖尿病 (DM) や化学療法剤の神経毒性の影響を経験している患者は、変性と小さな繊維の神経障害と呼ばれる小径感覚ニューロンの損傷による感覚障害を開発があります。小さな繊維の神経障害の存在の動物モデルは両方の大と小口径の感覚線維に影響し、負傷した小径感覚線維の効果を適切に評価するには複雑すぎる、神経病理学をこうして作成します。したがって、これらの問題の検討を十分に純粋な小さな繊維の神経障害の実験モデルを開発する必要があります。このプロトコルは、具体的にはエナンチオ (RTX) 一過性受容体電位バニロイドを通じて型の 1 (TRPV1)、単回投与の ultrapotent アゴニストと細径感覚神経に影響を与える小さな繊維の神経障害の実験的モデルを記述します。腹腔内投与、RTX 神経障害と呼ばれます。この RTX 神経の病的な症状を示し, 表皮内神経線維 (IENF) 変性、具体的には外傷を含む小さな繊維神経症患者の臨床的特徴を模倣行動の異常小径ニューロンと熱消と機械的アロディニアの誘導。このプロトコルは、RTX の 3 つの線量をテストした (200、50、および 10 μ g/kg、それぞれ)、結論 RTX の重要な線量 (50 μ g/kg) の典型的な小さな繊維の神経障害症状の開発に必要なし、する変更された染色手順を準備IENF 変性神経相馬損傷を調査します。修正手順は、高速、体系的、かつ経済的です。神経因性疼痛の行動評価は、細径感覚神経の機能を明らかにするため重要です。実験齧歯動物で機械しきい値の評価は特に挑戦的なこのプロトコルを記述するこのタイプの齧歯動物の評価に適しているカスタマイズされた金属製のメッシュ。要約すると、RTX 神経障害は分子の重要性と神経因性疼痛治療薬の開発のための基礎となる介入を評価する新しいと簡単に確立された実験的モデルです。

概要

IENFs の変性によって明らかである神経因性疼痛を含む小さな繊維の神経障害は、DM などは化学療法のエージェント1,2、神経毒性影響の結果としての条件の様々 な種類の共通 3,4,5。IENFs は後根神経節 (DRG) にある小径ニューロンの末梢の端末を並行 IENF 変性6の場合に影響を受けます。たとえば、神経突起の変えられた上流遺伝子転写は転写因子 3 (atf3 作動)6,7をアクティブにするのアップレギュレーションによって実証されています。さらに、皮膚生検、IENFs 神経支配の評価は小さな繊維神経障害5,8,9の診断に有用。従来、皮膚生検で IENFs のプロファイルに依存しているタンパク質遺伝子産物の免疫組織化学的デモ 9.5 (PGP 9.5)1,10,11。一緒に取られて、後根神経節と IENFs の病理組織学的プロファイルは機能条件の基になる小さな繊維神経障害を反映し、小径ニューロンに神経障害のこのタイプの機能的な結果の指標となることがあります。

以前は、いくつかの実験的モデルが圧縮または断裂14,15による化学療法による末梢神経障害12,13と神経損傷の場合 IENF 変性の問題を解決しました,16. これらの実験モデルにも大口径の神経が影響を受けるそれは、したがって、, 小さな繊維の神経障害; で影響を受ける大径神経の貢献を除外することはできません例えば、有害な撤退によってこれらの障害の検討は、機能運動神経線維17,18,19に依存します。したがって、純粋な小さな繊維神経障害モデルの確立と体系的に神経突起の小径ニューロンの周辺皮膚神経病理学的状態の調査は必要かつ不可欠です。

RTX はカプサイシン アナログと一過性受容体電位バニロイド受容体に 1 (TRPV1) 受容処理20,21,22を媒介する強力なアゴニスト。最近、周辺の RTX 治療安心神経因性の痛み23,24,25 RTX の intraganglionic 注射誘発 DRG ニューロン22の不可逆的な損失。周辺の RTX 投与の効果は用量依存性20,26,27、過渡的脱感作や IENFs の変性につながった。興味深いことに, 体系的な高用量 RTX 治療は神経因性疼痛28, 小さな繊維の神経障害の症状につながった。治療モードと RTX の用量が異なる病理学的効果と神経の反応を生成することが示唆します。ウィットには、周辺の管理ローカル効果29痛み情報伝達を防いだし、神経因性動作6を開発した神経突起が影響を受けます。総称して、RTX 率効果であり、体系的に周辺の IENFs と中央の神経突起などの末梢神経に影響を与える可能性 RTX の特定の投与量があるかどうか問題を提起したことが判明しました。もしそうなら、RTX は特に小径ニューロンに影響を与えるし、診療所の小さな繊維の神経障害を模倣の潜在的なエージェントであるかもしれない。たとえば、クリニックの DM は代謝性疾患と小さな繊維の神経障害の主な特徴は、末梢神経の病理を含む複雑な問題です。DM 関連の小さな繊維の神経障害のメカニズムは、本剤の末梢神経に影響を与えることができない代謝障害の貢献を除外でした。したがって、DM 関連の小さな繊維の神経障害では、体系的な代謝性疾患の影響を除外することができる純粋な動物モデルが必要です。このプロトコルでは、RTX IENF 変性と小径ニューロンの損傷などを含む変更された免疫染色解析によって示されるように、典型的な小さな繊維神経障害モデルを開発するための作業量について説明します。

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プロトコル

記載されているすべての手順研究所動物30に関する倫理指針に基づき、プロトコルは、動物委員会の高雄医学大学、高雄、台湾によって承認されています。

1. RTX 神経障害の確立

注意:RTX は神経毒性と有害です。接触、目、粘膜、上気道刺激として機能します。吸入を避ける、RTX の準備中にラボ メガネとコートを着用します。多量の皮膚への接触や処理後の水で洗い流してください。

  1. Tween 80、エタノール (各溶剤 100 μ L) の等量の混合物を 200 μ l 添加に RTX 粉末の 1 mg を追加します。
  2. 因数 RTX ソリューション (12 μ L/バイアル) し、3 ヵ月の-20 ° C で保存します。この下に RTX 株式;有効期限の残りの RTX ソリューションを破棄します。
  3. 600 μ L の最終巻に生理食塩水入りの RTX 株式を希釈します。RTX 溶液の最終濃度は 0.01% を 10 μ L 車両ソリューションで 1 μ g RTX に匹敵するをする必要があります。
  4. 実験動物として 8 週齢アダルト雄 ICR マウス (35-40 g) を使用し、RTX ソリューションの単一の線量の管理 (投与量: 200、50、および 10 μ g/kg、それぞれ) 腹腔内 (i. p.) マウスにマイクロインジェクション注射器で。マウスは、深い麻酔と 5% イソフルレン吸入による麻酔されました。マウスは、RTX 注入中に四肢の撤退行動を示したマウスは長い吸入麻酔を取る必要があります。
    例: マウスの重さ 40 g を受け取ります RTX ソリューションでは、50 μ g/kg の投与量を表すの 20 μ L。
  5. コントロールとしてマウスの 1 つのグループの車両 (10% Tween 80 と 10% エタノール食塩) の等量を与えます。
  6. RTX 注射後、12-光/12 h 暗い上のプラスチックケージにマウス サイクルし食品を提供し、自由水を返します。

2. 神経因性挙動の評価

注: は、注射後リカバリするように快適な環境 (ステップ 1.6) で動物を保持します。7 日目の RTX のポスト噴射 (D7) にそれぞれの動物は時差を減らすし、行動テストの効率を促進するために同じ日にホット プレート、von Frey 髪フィラメントのテストを実行します。動物の馴化を最適化し、動作テスト中に環境影響の低減のため安定した湿度 (40%) と (27 ° C) の温度で維持される静かな部屋に動物をもたらします。テスト期間中に動物を邪魔しないで行動テストは毎週予定しています。

  1. ホット プレート テストで熱遅延の測定
    1. 透明なプレキシ グラス ケージの金属ホット プレート (27 cm × 29 cm) の上に優しく動物を配置 (長さ × 幅 × 高さ: 22 cm × 22 cm × 25 cm である;図 1 a)。52 ° c. に金属製のホット プレートの温度を設定します。
    2. 動物のグルタミ ホット プレートに触れるし、動物のグルタミ ン応答を観察したら、ホット プレートの手順で、内蔵タイマーでのホット プレート上の動物の熱遅延の期間を測定を開始します。動物は、揺れを示している場合、グルタミ ン舐めるまたはホット プレート上中ジャンプ削除し、ホット プレート上に動物が残された時間を記録します。この時間は、個々 の動物の熱遅延を定義します。最も近い 0.1 熱遅延時間を記録 s。
    3. 各テスト セッションの最後のホット プレート テスト後応答正規化の 30 分間隔で 3 つのトライアルを実行します。動物は、ホット プレートには応答を示さない場合 25 後セッションを停止 s 潜在的な組織の損傷を避けるために。
  2. Von Frey 毛フィラメントと力学的閾値の測定テストします。
    1. カスタマイズされた金属製のメッシュの動物を置く (メッシュ サイズ: 5 × 5 mm) 半透明シリンダー プレキシ ガラスのケージ (直径: 13 cm; 高さ: 12 cm) (図 1 b) 少なくとも 2 h の順応に。
    2. 上下法31と後足部の足底に von Frey 毛繊維の別の calibers を適用されます。5-8 s のフィラメント アプリケーションの持続期間のため von Frey 毛フィラメントのセットの中間力から最初のアプリケーションを起動します。
    3. 動物の正規化を最適化するフィラメント アプリケーション間 2 分間隔を使用します。動物の最後の応答に基づく応用フィラメント力を変更します。
      Von Frey 毛フィラメントのセットは 0.064、0.085、0.145、0.32、0.39、1.1、および 1.7 g 力のアプリケーションで構成されています。たとえば、0.32 g の初期力と後足の撤退が発生した場合は 0.145 g を適用します。足撤退の不在、0.39 g フォースが適用されます。さまざまな力の 4 つの追加のフィラメントは、前の応答に基づいて適用されますが、公開された数式31によると機械のしきい値を計算します。
    4. 各テスト セッションのため二国間グルタミが含まれます。各後足の 3 つの試験を実行します。それぞれの動物の平均機械しきい値 (mg)、これらの六つの機械しきい値のなかを表現します。

figure-protocol-1
図 1。エナンチオ (RTX) のマウス モデルにおける神経因性疼痛の評価のためのカスタムメイドのプレキシ ガラスのケージと金属メッシュ-小さな繊維の神経障害を誘発します。(A, B)これらのグラフは透明なプレキシ グラス ケージと金属の熱板 (27 cm × 29 cm) 測定に使用される装置 (A) に熱遅延時間を表示 (長さ × 幅 × 高さ: 22 cm × 22 cm × 25 cm) と (B) カスタマイズされたメタによる機械の閾値を評価l メッシュ (メッシュ サイズ: 5 × 5 mm) 半透明シリンダー プレキシ ガラスのケージ (直径: 13 cm; 高さ: 12 cm) RTX 誘起小さな繊維の神経障害を持つマウスで。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

3. 皮膚 IENFs 神経の生検の作製と評価

  1. 動作テスト後、5% イソフルランと動物の麻酔し、0.1 M pb 4% パラホルムアルデヒド (4 P) 続いて 0.1 M のリン酸バッファー (PB) (pH 7.4) と心腔内灌流による動物を犠牲に。
  2. 灌流後 2 つグルタミ ン最初フットパッドをカットし、後に 4 P で別 6 h 長期保存のための 4 ° C で 0.1 M の PB への転送足蹠組織のそれらをじっと見つめます。
  3. Cryoprotect フットパッド PB を一晩で 30% ショ糖と 30 μ m の厚さのスライスの足底の表面的に垂直にカットします。蹠のセクションを順番にラベル付けし、-20 ° C で不凍液に保管
    注: 不凍液の組成は次のように: 蒸留水、エチレン グリセリン、グリセリン、3:3:3:1 の比率で 2 x PB。
  4. 確実に適切なサンプリングを蹠のすべての 3 番目のセクションを選択します。
    1. コート スライド グラスに選ばれた足蹠のセクションを置いて、それらを風乾します。
    2. スライドと標準的な免疫染色の手順とプロセスのプラスチック オイルタンクから取り外をカバーします。
      1. 30 分のメタノールの 1% H2O2足蹠のセクションを消すし、0.5% 脱脂粉乳と 0.1 %1 h 用 0.5 M Tris バッファー (トリス) のトリトン X-100 をブロックします。
      2. 4 ° C でパン軸索マーカー、PGP 9.5 (で育ったウサギ; 1:1, 000) に対する抗血清と足蹠セクションを一晩インキュベートします。
      3. 足蹠セクション 1 時間室温 (RT) でビオチン標識ヤギ抗うさぎ IgG 二次抗体の孵化し、45 分間常温アビジン-ビオチン複合体を孵化させなさい。
      4. 0.05% で反応生成物を可視化する 3, 3'-ジアミノベンジジン (軽打) 向け 45 s。蒸留水と足蹠セクションを洗うし、取付のためそれらを風乾します。
        注: プライマリおよびセカンダリの血清希釈が 0.5 %0.5 M トリスで脱脂乾燥したミルク。

4 負傷した小径ニューロンの DRG セクションの作製と評価

  1. 4thと 5thを解剖腰部後根神経節と別の 2 時間のポストの修正。
  2. 30% スクロースを PB Cryoprotect 後根神経節組織一晩し順番に 8 μ m 厚にカット、顕微鏡スライド、およびラベルを貼る。-80 ° C のフリーザーに DRG のセクションを格納します。
  3. 適切なサンプリングが確実に 80 μ m 間隔で Immunostain DRG のセクション。
    1. 二重分類蛍光プロシージャを除き、足蹠のセクションの DRG 染色手順を実行します。また、atf3 作動を含める (で育ったウサギ; 1: 100)、傷害マーカーと peripherin (で育ったマウス; 1:800)、主な抗血清で小径神経マーカー。
    2. 4 ° C で一晩一次抗血清の混合物と後根神経節のセクションを孵化させなさい
  4. 赤や蛍光イソチオシアネート (FITC) をテキサスとどちらかに DRG セクションを孵化させなさい-共役二次抗血清 (レバレッジ)、1 h の RT で適切なプライマリ抗血清に対応するし、定量化のためマウントします。

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結果

このプロトコルでは、RTX 神経障害、具体的には IENF の変性、感覚器障害 (図 2) に関連付けられているを含む小径ニューロンに影響を与える新規マウスモデルをについて説明します。ここ記載されているプロトコルに従い、動物は熱消、D7 のポスト RTX 噴射で機械的アロディニアを展示しました。この小さな繊維神経障害モデルを RTX の 3 つの用量の確立: i. p. のルートで 200、50、および 10 μ g/kg を投与します。RTX 線量 (50 μ g/kg) は、重要とみなされ、予備的考察その高線量を示した RTX (200 μ g/kg) 引き起こされる高いマウス致死率 (図 3)。

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ディスカッション

診療所の小さな繊維の神経障害の効果的な治療は、機能回復と患者の生活の質を促進するため必要です。現在、ターゲットに小径神経細胞傷害の分子機構の包括的な理解の不足のために小さな繊維神経障害による感覚障害治療ガイドの欠如があります。神経障害の以前のモデルに通常両方大と小口径の感覚神経が影響を受ける例えば、化学療法による末梢神経障害12,32,33と機械による末梢神経障害34,35のモデル。したがって、運動麻痺の大径感覚神経の損傷貢献完全に除外できなかったこれらの神経障害モデルの行動テストで。この議定書では、マウスの小さな光ファイバー神経の障害であり、IENFs 変性の病理組織学的および機能的な証拠を提供することによって細径感覚神経にのみ影響の新しいモデルについて説明します。

RTX は、...

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開示事項

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謝辞

この作品は、省の科学と技術 (106-2320-B-037-024)、高雄医科大学 (KMU M106028、KMU S105034) トップ大学助成金 (TP105PR15)、台湾、高雄医学大学の目的からの補助金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
化学試薬
レシニフェラトキシンΣR8756
Tween 80ΣP1754
3,3'-ジアミノベンジジンΣ D8001
アビジン-ビオチン複合体ベクターPK-6100
名前会社カタログ番号コメント
Primary Antisera
PeripherinChemiconMAB-1527
ATF3Santa CruzSC-188
PGP9.5UltraCloneRA95101
NameCompanyカタログ番号コメント
二次抗血清
ビオチン化ヤギ抗ウサギIgGベクターBA-1000
キサスレッドコンジュゲートヤギ抗マウスJackson ImmunoResearch115-075-146
イソチオシアネート(FITC)結合ロバ抗ウサギジャクソン免疫研究711-095-152
名前会社カタログ番号コメント
Equipment
ホットプレートIITCモデル 39
フォン フレイ フィラメントSomedic Sales AB10-600-0001
名前会社カタログ番号コメント
Material
Shandon カバープレートサーモ科学72110017
スライドラックThermo scientific73310017
テ

参考文献

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