酸性細胞外 pH 培養系の確立

サマリー

酸性腫瘍微小環境は、腫瘍の進行に重要な役割を果たしています。がん細胞のin vitro での酸性細胞外 pH の効果を評価するためには、単純な酸性文化体制を確立しました。

要約

腫瘍微小環境、低酸素や栄養飢餓などの条件は、癌の進行や悪性腫瘍で重要な役割を果たします。ただし、腫瘍の積極性とそのメカニズムの解明に酸性細胞外 pH の役割は検討されていない広く低酸素や栄養飢餓状態と比較しています。さらに、酸性細胞外腫瘍微小環境を模倣するように明確に定義された培養法は完全に報告されていません。

重炭酸塩や増加の乳酸培養液中で HCl 濃度酸性細胞外 pH による削減を維持するために単純な体外培養法をご紹介します。培地の pH は少なくとも 24 時間持続され、72 h PANC-1 および AsPC 1 膵臓癌細胞の文化を次によって徐々 に減少します。本研究では 3 つの異なる酸性メディア条件高い pH 応答性遺伝子MSMO1 INSIG1、 IDI1などと比較して低酸素や栄養飢餓.これらの遺伝子の発現は、酸性 pH のマーカーとして使用できます。これらの簡単なテクニックは、酸性腫瘍微小環境下で腫瘍の悪性度の基になるメカニズムを解明するために有益です。したがって、細胞の酸性 pH 文化体制によりがん細胞のみならず、その他酸性障害など糖尿病性ケトアシドーシスに関連して、腎の尿細管細胞など、細胞の細胞の酸性 pH 応答の発見乳酸アシドーシス、腎の尿細管性アシドーシス、呼吸性アシドーシス。

概要

腫瘍微小環境は、腫瘍の進行と癌細胞代謝^1,2,3で重要な役割を果たしています。がん細胞が低酸素血症、栄養不足、酸性細胞外 pH (pHe) など条件にさらされること。ただし、腫瘍の進行の pHe の役割は明らかにされていないとして広く低酸素や栄養飢餓のように。腫瘍組織内 pHe を酸性、およそ pH 6.8^4,5に到達になることができます。酸性の pH はプロトン (H⁺) の好気性と嫌気性解糖系の排泄から発生し、増殖癌による乳酸細胞^5,6.

最近の研究で明らかに酸性 pHe 誘起ヒストン脱アセチル化、脂肪酸酸化、酸性リソソーム酸性厳しい^7,8,9,10への適応のための放出。しかし、ど....

プロトコル

1. 酸性の培地の準備

1. コントロール (pH 7.4) の作製と低 pH (ペーハー 6.8) 培
   1. 500 mL の水に L-グルタミンなし DMEM 粉末 4.75 g を溶解します。
   2. 耐圧ボトルで 0.33 M NaHCO₃ソリューションを準備します。
      注意: NaHCO₃ CO₂ガスを加熱すると熱分解を発するので圧力のタイトなボトルを使用することが重要です。
   3. オートクレーブ媒体およびソリューション。25 ° C に冷却するこれらのバッファーを許可します。
   4. 200 mM L-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシンの 5 mL の 5 mL を加えると炭酸なし DMEM の 500 mL に牛胎児血清の 50 mL。
   5. コントロール (pH 7.4) 中 2.4 mL 炭酸なし DMEM の 100 mL あたり 0.33 M NaHCO₃ソリューションを追加します。低 pH (ペーハー 6.8) 中炭酸なし DMEM の 100 mL あたり 0.33 M NaHCO₃溶液 0.6 mL を追加します。
   6. 37 ° C で 24 時間後 5% 以下の培地の pH をチェック CO₂。
      注: NaHCO<....

結果

適切な重炭酸濃度を決定するには、0 - 8 mM NaHCO₃ (培養液に最終濃度) の範囲で DMEM を作製し、pH 6.4 7.4 (図 1) に至ると培地を準備することに成功しました。固形腫瘍^4,5pH 6.8 を細胞外 pH に達することを示す以前のレポートによると 8 mm NaHCO₃ (pH 7.4) 制御媒体と 2 mM NaHCO₃ (Ph6.8) 媒体として酸性 pH DMEM をご用意しました。酸性の培地の pH は、24 時間持続され、約 6.6 72 時間培養中の pH PANC-1 と AsPC 1 細胞 (図 2) には漸減します。次に、乳酸や ph 6.8 制御媒体 (pH 7.4) を調整するために必要な塩酸の量を決定するコントロール中に.......

ディスカッション

ここでは、簡単な酸性 pH 文化システムとその評価プロセスについて説明しました。中程度の酸性化、すなわち、減らされた重炭酸濃度、乳酸添加と HCl 添加の 3 つの方法の組み合わせでは、pH 応答メカニズムを徹底的に調査し、他の腫瘍に対する細胞の反応を比較できました。低酸素や栄養飢餓などアイソレータケージ条件。

このメソッドのキーは、培養液中の重炭酸塩、乳酸、HCl の適切な濃度を決定することです。最初にこのメソッドを実行するときに重炭酸塩濃度と培地の pH を測定 NaHCO₃培地での適切な量を決定することが重要です。37 ° C で 24 時間後の培地の pH を測定する必要があるこのプロセス中に下に 5% CO₂CO₂の中の温度と平衡状態として大きく影響培地の pH。重炭酸塩は簡単にフラットになると、重炭酸塩のオートクレーブは頻繁推奨します。細胞密度と細胞密度は、成長の癌細胞の数が多いは簡単にコントロールのサンプルでも培養液を酸性化の重要な要因です。さらに、レスポンスを酸性細胞外 pH セルの.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム」ニッスイ」2	ニッスイ	05919
ウシ胎児血清	サーモフィッシャー	10438
NaHCO3	和光	191-01305
L-グルタミン溶液	サーモフィッシャー	25030-081
ペニシリン-ストレプトマイシン混合液(安定化)	ナカライ	09367-34
0.5g/l-トリプシン/0.53mmol/l-EDTA 溶液 フェノールレッド	ナカライ	32778-05
0.5%-トリパン ブルーステイン ソリューション	ナカライ	29853-34
乳酸溶液	シグマ アルドリッチ	252476
塩酸溶液	シグマ アルドリッチ	H9892
RNeasy プラス ミニ キット	キアゲン	74134
スーパースクリプト IV ファーストストランド合成システム	サーモフィッシャー	18091
パワー SYBR グリーン PCR マスターミックス	アプライドバイオシステムズ	4368702
Name	会社	カタログ番号	コメント
細胞株
PANC-1	ATCC	CRL-1469
AsPC-1	ATCC	CRL-1682
KMS-6	JCRBセルバンク
TIG	JCRB セルバンク
MRC9	ATCC	CCL-212
HUVEC	ATCC	CRL-1730
Name	企業名	カタログ番号<	strong>コメント
Equipment
NanoDrop One 微量 UV-Vis 分光光度計 Wi-Fi	サーモフィッシャー	ND-ONE-W
QuantStudio 5 リアルタイム PCR システム	サーモフィッシャー	CRL-1682

JCRB0432