腹腔内のブドウ糖負荷試験、肥満や呼吸器アウトカムに対する代謝が異常の影響を研究する肺機能の測定や肺の固定

Summary

肥満の発生率が上昇していると慢性肺疾患のリスクを増加させます。根本的なメカニズムと予防戦略、明確に定義された動物を確立するには、モデルが必要です。ここでは、我々 は (ブドウ糖負荷試験、体の脈、肺固定) マウスにおける肺の成果に対する肥満の影響を研究する 3 つの方法を提供します。

Abstract

肥満と呼吸器系疾患は、主要な健康上の問題です。肥満は、こうして社会経済的負担の増大を表す 2030 以上 10 億肥満の個人の世界的な数が期待される新たな流行をなっています。同時に、肥満関連の合併症、糖尿病と同様に心や慢性肺疾患などが継続的に増加しています。肥満は喘息の増悪のリスクの増加に関連付けられている、呼吸器症状、およびコントロール不良の悪化肥満や慢性肺疾患の発症機序における摂動代謝の機能的役割がしばしば過小評価、その分子メカニズムのとらえどころのないままです。この記事は、代謝と同様に肺の構造と機能に対する肥満の影響を評価する手法を提示する目指しています。ここでは、マウスの調査の 3 つの技術について述べる: 腹腔内グルコース耐性 (ipGTT); 糖代謝に対する肥満の影響を分析するための (1) の評価(気道抵抗 (Re) と呼吸器系コンプライアンス (Cdyn) 肺機能に対する肥満の影響を分析するための測定 2)(3) の作製とその後定量組織学的評価のため肺の固定。肥満関連肺疾患は、おそらく、潜在的悪影響肺機能および治療への反応に影響を与える全身の炎症と代謝不全から生じる多因子性。したがって、分子メカニズムと新しい治療法の効果を検討する標準化された方法論が不可欠です。

Introduction

よると、世界保健機関 (WHO) 2008 年に、20 歳以上、以上 14 億の大人たち、ボディマス指数 (BMI); 25 以上を太りすぎさらに、以上 2 億人、ほぼ 3 億女性肥満 (BMI≥30)¹。肥満やメタボリック シンドロームは、多数の病気のための主要な危険因子です。肥満と併用の白色脂肪組織増加中質量密接にリンクされているタイプ 2 糖尿病^2,3, 冠状動脈性心臓病 (CHD)、心不全 (心不全)、心房細動^{4 を含む心臓血管疾患}変形性関節症⁵、呼吸器系疾患の病態における機能的な役割のままかり。ただし、疫学的研究は、肥満が労作時呼吸困難、睡眠時無呼吸症候群 (OSAS) 肥満低換気症候群 (OHS) 慢性を含む慢性の呼吸器の条件に強く関連付けられているを示しています。閉塞性肺疾患 (COPD)、肺塞栓症、誤嚥性肺炎、気管支喘息^6,7,8,9。リンク肥満と摂動代謝潜在的なメカニズム、例えば、インスリン抵抗性、タイプ II 糖尿病は、慢性肺疾患の病態だけでなく構成重量の機械および物理的な結果も換気益亜急性炎症状態が慢性化^10,11を誘発します。肥満と効果的な予防戦略と治療アプローチの欠如と相まって、過去 10 年間の間に肺疾患の増加肥満関連肺を管理するための新しい道を定義する分子メカニズム解明のための必要性を強調します。病気。

ここでは、肥満とマウス モデルにおける肺の構造と機能への影響を調査するための重要な基礎である 3 つの標準的なテストについて述べる: (1) 腹腔内グルコース耐性 (ipGTT) (2) 気道抵抗 (Re) の測定と呼吸システム コンプライアンス (Cdyn);(3) の作製とその後定量組織学的評価のため肺の固定。IpGTT は、メジャー グルコース取り込みと代謝に及ぼす肥満への堅牢なスクリーニング テストです。方法のシンプルさは、研究所間標準化、その結果の比較可能性をできます。代謝表現型¹²の詳細な分析、血糖クランプや膵島の研究より高度な方法を使用できます。ここでは、肺の結果にさらなる研究のための基礎として全身性および代謝障害の肥満準の状態を定義する耐糖能を評価します。肥満と代謝性疾患の肺機能に及ぼす影響を評価するためには、気道抵抗 (Re) と呼吸器系コンプライアンス (Cdyn) を測定しました。肺疾患の特徴、気ままなとして拘束された肺機能の評価手法も利用できます。動物を自由に移動で気ままな脈波呼吸パターンを反映して、自然な状態を模倣しています。対照的に、動的肺力学を評価するために解像度、および深く麻酔下マウスにおける cDyn の入力インピー ダンス測定などの侵襲的な方法より正確な¹³です。慢性の呼吸器疾患が肺組織の組織学的変化が反映されているので、さらなる分析のための適切な肺固定が迫っています。ティッシュの固定および準備の方法の選択は、勉強になります、例えば、気道や肺実質¹⁴肺のコンパートメントに依存します。ここでは、喘息発症に対する肥満の影響を研究する導電性の気道の定性的および定量的な評価を可能にする手法について述べる。

Protocol

動物のすべてのプロシージャは地方自治体によって承認されたプロトコルに準拠して実施された (nrw 州、アリゾナ州の土地: 2012.A424)、ドイツの動物福祉法および、実験のために使用される動物の福祉に関する法令に従い、他の科学的な目的。肺機能解析肺構造に影響を与える可能性がありますので、したがってそれに続く組織学的分析解像度と強度のため肺の固定と Cdyn 準備の測定は異なった動物で行わなければなりません。ただし、解像度、次の ipGTT Cdyn の測定が可能です。IpGTT 中のストレスを妨げる可能性がありますので、肺機能に必要な麻酔は ipGTT、体重減少から回復するマウスお勧め後約 2 週間の回復期間をテストし、血液パラメーター¹²に変更します。

1. 腹腔内ブドウ糖負荷試験 (ipGTT) のための準備

注: 空腹時の 12 時間後完全な ipGTT は約 2 時間かかります。

1. ストレスは血糖値に大幅影響を与えるので、マウスの両方の適応だけでなく、科学者のトレーニングを実行することを確認します。
2. 静かでストレスのない条件下で実験エリアに動物を転送します。
3. マウスの肥満を誘発する hypercaloric 食事療法の適用を検討してください。さらにアドバイスは、ディスカッションを参照してください。
4. 12 h の速い動物は、水へのアクセスを制限することがなく一晩します。次の日、断食の 12 h 準備血糖測定器は、メーカーによると後 's (材料の表参照) によるプロトコル テスト ストリップ ポートに新しいテスト ストリップを挿入します。
5. そっとしっぽでマウスを維持しながら滅菌はさみを使って尻尾先端を切開し、すぐに血ブドウ糖メートルのテスト ストリップを自由に流れる血の滴 (最小サンプル サイズ 0.5 μ L) を適用することによって絶食時の血糖を測定します。
   注: 十分な血液サンプルの後画面にカウント ダウン タイマーを開始します。後 4 s、テスト結果が表示されます。
6. その後、重量を量るし、個別にカラー マーキングを使用して動物のラベルします。
7. 2 g グルコース/kg 本体重量を介して腹腔内注入を管理します。注入量が 0.1 mL/10 g 本体重量 (27 G 針と 1 cc 注射器) であることを確認します。
8. その後、新しいテスト ストリップに自由に流れる血の滴を適用することによって、15、30、60、120 分後血糖値を測定します。
   注: 尻尾先端病棟の優しいマッサージによって血流を増加できます。尾巻き encrusts 場合、0.9% 塩化ナトリウム溶液を浸した滅菌綿棒を使用してそれをきれいに。
9. 水の測定値との間に無制限のアクセスとホームの檻の中で残りの部分に動物を許可します。

2. 肺機能分析測定解像度と cDyn

注: 解像度と cDyn の妨げられていない測定用マウスの深麻酔下で換気する必要があります。ストレス フリーの動物取扱と麻酔の適切な監視が不可欠です。生殖不能の技術を使用して一般的な手順、ホーホストラーテン ミラーらによって記事をご覧¹⁵

1. 実験の各セットの前に脈を調整し、ソフトウェア内で研究設定を準備 (材料の表を参照してください)。
2. 手術前に麻酔キシラジン (10 mg/kg 体重) とケタミン (100 mg/kg 体重) の腹腔内投与で動物が深く (27 G 針と 1 cc シリンジ)。注入量が体重あたり 0.1 mL/10 グラムであることを確認します。
   注: ケタミンは、マウスの適切な鎮痛効果、追加の痛みの治療は必要ありません。侵襲的な気管カテーテル/脈プロシージャは約 5-7 分、その後、データ集録を開始することができます。
3. 体温を維持するために加熱パッドの仰臥位の位置にマウスを配置します。
4. 麻酔下での乾燥を防ぐために軟膏で目をカバーします。
5. つま先ピンチ応答を用いた麻酔の深さを常に監視します。
   注: 麻酔薬の追加投与は麻酔外科平面を維持するために必要かもしれない。
6. 70% エタノールで甲状腺領域の外科領域の毛皮を湿らせます。
7. 慎重にピンセットで持ち上げて、鈍はさみ (図 1 a) を使用して目視検査の下の皮膚をクリッピングによって胸骨の頚静脈切欠きとオトガイの塊茎 symphyses 間約 1 cm の正中の皮膚を切開します。
8. 基になる皮下脂肪と甲状腺を視覚化します。
9. 地峡と甲状軟骨と胸骨甲状筋 (図 1 b) の郭清で両方の甲状腺葉を慎重に鈍的に分離することで気管を公開します。すべての血管を傷つけるし、心血管系への悪影響が生じるので、出血を引き起こすしないように注意し、最終的に測定。
10. その後、気管と食道の鈍い鉗子を使用して 4-0 の編みこみ手術縫合糸を渡します。慎重にマイクロはさみで気管軟骨間喉頭の近くに気管を切開します。
11. ビジュアル コントロール (図 1) の下で気管チューブ (0.04 インチ/1.02 mm 径) を挿管します。システムで任意の漏れを避けるために手術縫合糸で結紮を介してチューブを修正します。
12. 次に、体室の温水ベッドに動物を移動フェイス プレート (図 1) に気管チューブを接続し、換気コント ローラー (図 1E) のフロント パネルに換気ボタンを押して電源を入れます。
13. 換気量と同時期の胸郭運動を観察することによって、換気を調査します。気管チューブの適切な位置を確認するため、胸郭の両側が同時に移動することを確認します。
14. 圧力を見るコンピューターの画面 (図 1 f) 信号。換気曲線が均一であることを確認します。ない場合は、動物を切り離す手術側を確認してください。血や粘液は、気管チューブをブロックの注意してください。
    注: 20-25 g の体重と大人動物は、図 2に示すように、人工呼吸器の設定は製造元の推奨事項に従って示されます。
15. 換気中に経肺動脈圧の変化を制御するため肺のレベルに近い深さで食道に食道チューブ (0.04 インチ/1.02 mm 径) を挿入します。チューブを配置しながら画面を見る。最大圧力たわみと最小限のハート アイテムを画面上で見ることができるチューブを配置します。
16. 手術後に、測定のため動物を準備します。ケタミン (100 mg/kg 体重) 27 G 針と 1 cc シリンジを使用してを介して腹腔内注射麻酔を膨らませてください。注入量が体重あたり 0.1 mL/10 グラムであることを確認します。
    注: 気管支 hyperreagibility を評価するために, メサコリン誘発気道攣縮の副交感神経の非選択的ムスカリン受容体アゴニストを nebulize します。データ集録は、(図 3) の 4 つの異なるフェーズで実行されます。
17. Manufacturer´s プロトコルに従ってデータ集録を開始します。
    注: ソフトウェアは自動的に取得プロセスを通じてユーザーをガイドします。
18. ネブライザーに 10 μ L の PBS (車両) を適用し、順化の 5 分後にネブライザーを開始します。次に、3 分の応答位相解像度 (cmH₂O/mL/s)、cDyn (mL/cmH₂O) を測定します。最後に、3 分の復旧フェーズを次のネブライザーの前に動物に提供します。
19. 換気扇の上 (2.5 μ g/10 μ L、6.25 μ g ・ 10 μ、12.5 μ g ・ 10 μ L) メタコリン濃度の増加の 10 μ L の段階的適用によるソフトウェアに従ってください。
20. すべての測定を実行し、記録すると、頚部転位によって動物を犠牲に。

3. 成体マウスの定量的組織計量解析のため肺分離

1. 深くキシラジン (10 mg/kg 体重) とケタミン (100 mg/kg 体重) の動物を介して腹腔内注射の麻酔 (27 G 針と 1 cc シリンジ)。注入量は体重あたり 0.1 mL/10 グラムにする必要があります。
   注: 外科的寛容の状態に達すると後の準備 30 分固定のため、臓器灌流が続く約 5 分かかります。
2. 動物は、手術許容値 (負つま先ピンチ-応答) の状態に達したら、70% エタノールで動物を消毒して、動物をパッドにサージカル テープで固定.
3. 心臓穿刺、出血による動物を犠牲に。簡単に言えば、皮膚と鋏は使いよう 】 を使用して腹膜切開の内側と腹部を開きます。
4. 肝臓のダイヤフラム ヘッド病棟を検索し、慎重に横隔膜から肝臓を分離します。
5. 鈍のはさみを使用して横隔膜の小切開を行い、2 mL の注射器に接続されている点状 20 G 針で心臓の左心室。ゆっくりと動物を exsanguinate します。
   注: ゆっくりと慎重のデスメタルは心室の負圧、妨げられていない血流を阻害するために崩壊を防ぐために重要です。
6. 曲線、鈍のはさみを使用して胸郭の全体の長さに沿って胸骨切開を通して優しく胸郭を開くことによって肺を解剖します。
7. その後、胸腔 (図 3) を公開する胸郭を持ち上げます。心臓や肺を参照してくださいに胸腺を削除します。
   注: 右心室、肺血管系氷冷 PBS とし、[例えば4% (質量/体積) パラホルムアルデヒド (PFA)] 固定液の灌流が続く省略可能な注入は可能です。歯槽 septae を破裂し、このメソッドを使用して肺の構造に悪影響を与えるリスクがあることに注意してください。
8. まず肺を慎重に分析、心を削除します。
9. その後、気管と食道の鈍い鉗子を使用して 4-0 の編みこみ手術縫合糸を渡します。
10. 次に、慎重に気管軟骨の喉頭の近くに気管を切開、静脈カニューレ (26 G) を挿管し、20 cm H₂O の一定の圧力で圧固定によって肺を膨らませる定着性エージェント [例えば4% (質量を使用してPFA の/volume)]。
11. PFA 固定のため室温で 30 分の定着剤を残します。その後、気管を結紮し、カニューレを削除します。組織を損なうことがなく慎重に肺を切除し、一晩 4 ° C で定着性のエージェントにそれを格納します。
    注: また、ATS/ETS によるとコンセンサス ペーパー 2.5 %ga バッファー OsO4、ウラシルのソリューションを使用して適切な組織安定のため。さらにティッシュの準備、夏らによるコンセンサス ペーパーを参照してください。¹⁴

Results

腹腔内のブドウ糖負荷試験 (ipGTT) (図 4) の代表的な結果は、ヘマトキシリンとエオシンを示す肺関数テスト (図 5)、および代表画像ステンド肺 (図 6)。

IpGTT は、高脂肪食 (HFD) の 7 週間後 (青) 肥満のマウスで行われました。標準的な食事供給のマウス コントロール (ブラック) を務めた。肥満マウス腹腔内ブドウ糖注射液後に、増加した血中グルコース レベル 15 と 30 分を示した細胞のグルコース取り込み (図 4) が障害を示します。

肥満が肺機能に及ぼす影響を調...

Discussion

このレポートでは、糖代謝、呼吸器アウトカムに対する肥満の影響を分析する 3 つの異なる方法の 3 つのプロトコルを提供します。まず、ブドウ糖負荷試験はグルコースの細胞内取り込みを分析する機会を提供しています、インスリン抵抗性を示すことができます。第二に、全身脈は肺機能を測定する技術、それにより新しい治療法の有効性をテストすると便利です。第三に、標準化された固定プロトコルと構造変化に対する肥満の影響を評価するために定量的な形態解析のために不可欠です。

動物研究では食餌誘導性肥満

既存の方法と将来のアプリケーションに関しての意義: 肥満の結果、人間の食べる習慣を模倣する食餌誘導性肥満 (DIO) モデルは齧歯動物で広く使用されています。代謝性疾患を模倣した遺伝子組み換えマウスの使用と比較しては、DIO モデルは、病因・病理学・将来の治療法の選択肢の分析を有効にします。Heydemannら、による最近の検討は、糖尿病研究¹⁶の異なるマウス高脂肪食モデルの概要を示します。肥満...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GlucoMen LX	A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy	38969	血糖値計
GlucoMen LX Sensor	A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy	39765	Test stripes
Glucose 20%	B. Braun, Melsung, Germany	2356746
FinePointe Software	DSI, MC s´ヘルトーヘンボス、オランダ	601-1831-002
FinePointe RCシングルサイトマウステーブル	DSI、MC s´スヘルトーヘンボス、オランダ	601-1831-001
FPRC コントローラー	DSI、MC s´ヘルトーヘンボス、オランダ	601-1075-001
FPRC エアロゾルブロック	DSI、MC s´スヘルトーヘンボス、オランダ	601-1106-001Aerogen
ネブヘッド-5.2-4um	DSI、MC s´スヘルトーヘンボス、オランダ	601-2306-001
鉗子	FST、ブリティッシュコロンビア州、カナダ	11065-07
鈍いはさみ	FST、ブリティッシュコロンビア州、カナダ	14105-12
マイクロハサミ	FST、ブリティッシュコロンビア州、カナダ	15000-00
パーマハンド 4-0	エチコン、プエルトリコ、アメリカ	736H	外科用縫合糸
Roti-Histofix 4%	Roth	P087.1	4% Paraformaldehyd
Ketaset	Zoetis, Berlin, Germany	10013389	Ketamine
Rompun 2%	Bayer, Leverkusen, Germany	770081	Xylazine