地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

サマリー

網膜色素上皮細胞は乾燥加齢による黄斑変性症の高度なフォームのセル置換療法として役立つことができます。このプロトコルでは、地理的な萎縮の目の大きいモデルと病気のこのモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植の世代について説明します。

要約

地図状委縮 (GA)、乾燥 - 加齢黄斑変性症の末期は重要な網膜の構造 (例えば、光受容体) の後続の変性につながる網膜色素上皮 (RPE) 層の損失によって特徴付けられる原因重度の視覚障害。同様に、RPE 損失と視力の低下に見られる長期的なフォローを高度な湿式加齢による黄斑変性症 (AMD) 硝子体内抗血管内皮増殖因子 (VEGF) の治療を受ける患者の。したがって、一方で補充療法として役立つことができる無制限のソースから網膜色素上皮細胞を効率的に導出する基本です。一方、動作と必然的病気のモデルに派生セルの統合手術を評価することが重要だし、イメージングの方法として近い人間に適用することが可能。ここで、提供 GA の前臨床モデルの生成を説明する私たちの前の出版物に基づく詳細なプロトコル アルビノのウサギの眼を使用して人間の萌芽期の幹細胞の評価由来網膜色素上皮細胞 (hESC RPE) のために、臨床的に関連する設定。素朴な目や過ヨウ素₃目に分化した hESC RPE 移植-25 G transvitreal パルス プラナ法を用いた GA のような網膜変性を誘発します。マルチ モーダル高解像度非侵襲的なリアルタイム イメージングによる退化および移植の分野の評価が実行されます。

概要

このプロトコルでは、網膜の網膜色素上皮移植の hESC の統合の評価を可能にする地理的な萎縮 (GA) の大きな眼の前臨床モデルの生成について説明します。詳細はここで説明する方法は、外側の網膜の損傷と GA のような表現型の作成と同様に悪名高く¹からの網膜色素上皮細胞の濃縮、純粋、および機能人口の生産を示す 3 の最近の出版物で使用されています。生理食塩水 (すなわちBSS と PBS) または過ヨウ素₃ウサギ目報^2,3での網膜の注入によって誘起されます。さらに、悪名高く RPE のサブ網膜サスペンション移植視細胞救助能力²広範な機能性単分子膜を形成することを示しました。

いくつかの利点は、ウサギの眼の病気の GA モデルの生成用を伴います。まず、サイズ ウサギ目の大人の人間の目のボリュームは 70% です、小さなネズミ目 (1,000 細胞/μ L対50,000 細胞/μ L)⁴で日常的に使用されるより大いに低い細胞密度を用いた臨床的に意味のある移植を可能^,5. 第二に、齧歯動物の手術は通常経脈絡膜網膜障壁を妥協し、潜在的炎症反応と拒絶の可能性⁶をトリガーを通じて。両方の要因一緒にべると移植細胞と乱れたネイティブ網膜組織の移植細胞の全体的な統合の凝集につながる可能性があります。ただし、ウサギの目の大きいモデルは、臨床の現場と同じ計測手技を実行できます。第三に、大きな目のモデルは、高解像度生体内イメージングおよび移植細胞および時間^1,2,3を覆っている網膜の監視できます。したがって、正常と病気の網膜と網膜サブ空間の研究に関心を持つ人のための齧歯動物に魅力的な代替手段であるべき臨床的に関連する、コスト効率の高い臨床モデルをについて説明します。

プロトコル

次のプロトコル カロリンスカ Instituet の動物のケアのガイドラインに従います。ニュージーランドのアルビノのウサギ (資材表) を使用してすべての動物実験は、地域の動物倫理委員会 (取り入れ Norra Djurförsöksetiska Nämnd) によって承認されている (許可: dnr 56/15)。悪名高く (2011/745-31/3 dnr) の使用、転送と悪名高く RPE (dnr 2013/813-31/2) の操作はまたスウェーデンの立法、カロリンスカ研究所の規程に基づき、地域の人間の倫理委員会 (によって承認されています。Regionala Etikprövningsnämnden 私ストックホルム)。

1. ヨウ素酸ナトリウム (ナイオ₃) の大きな眼の動物モデル注入網膜

1. ケタミン 35 mg/kg の混合物で腿に筋肉内投与し、生理食塩水に 30 G の注射器を使用して 5 mg/kg キシラジン動物を麻酔し、0.75% 2.5% とシクロペントラート フェニレフリンのミックスを使用して局所点眼薬で瞳を広げます。適切な anesthetization を確認した動物がその後ろ側の脚のハードのピンチに反応しない場合。
2. 外科医 (図 1 a) に直面して頭手術顕微鏡下でウサギを配置します。ふたリトラクターを使用すると、汚染のリスクを最小限に抑えるための滅菌布でまぶたと瞬膜の膜を削除できます。使用は平衡塩類溶液 (BSS) 両方の目で麻酔中の乾燥を防ぐためです。
3. マイクロサージャリー、2 ポートを使用 (または省略可能な 3 ポート) の 25 G transvitreal 顕微鏡計測器 (図 1 b) の挿入のための非バルブ付きトロカールとプラナ法のパルスします。多機能硝子体手術マシンが注入カニューレ、endoillumination、vitrector、および endolaser を接続するためのポートです。網膜下注射、endoillumination だけは必須、2 ポートのセットアップに十分なるです。上の左のトロカールを介して、endoillumation を挿入し、網膜注入カニューレ上部右トロカールを使用します。
   1. 3 ポート セットアップ BSS 注入カニューレの低い時間トロカールを使用します。かどうか (、vitrector) などのオプション機器は、上部右のトロカールを挿入を使用する。
   2. 爪鉗子を使用してつかむ、挿入部位を覆う結膜を転置する角膜輪部から 1 ~ 2 ミリ上 2 トラカールを挿入します。
   3. トロカールは、30 ~ 45 ° 角膜輪部の平行角度で挿入された transsclerally、トロカールの先端の真ん中に進むことを確認します。目、目の後方のポールを目指して進出し、トロカール 90 ° を回します。この手順は、sclerotomies から手術後の漏洩を避けるため、また眼内炎 (目のすなわち、細菌伝染) のリスクを減少させます。トロカールの位置については、図 2 bを参照してください。
   4. 眼とコンタクト レンズ (図 1 a) のジェルとして合成の涙で、網膜を視覚化する角膜のシングルユース フラット コンタクト レンズを置きます。
   5. (アシスタントが運営) 延長チューブに接続して 1 mL 注射器に polytip の 38 G カニューレ (外科医によって運営) 500 μ L のナイオ₃を描画します。
   6. 上部左のトロカールを介して endoillumination プローブと上部右トロカールを介して注入カニューレを挿入し、網膜、視神経乳頭のすぐ下を目指してに向かって硝子体空間を介してカニューレを進めます。
   7. 焦点のホワイトニングが表示されるまでゆっくりと網膜をタッチするカニューレの先端を許可します。注射そのものは、網膜下の配信を可能にする網膜に浸透します。これは、出血を引き起こす可能性がありますので、網膜を浸透カニューレてはいけないです。
   8. 5 s の期間にわたって subretinally ナイオ₃の 50 μ L を注入します。基になる脈絡膜と網膜の間自然へき開面があるのではっきりと見える半透明ブレブ徐々 に注入中になります。
   9. 注入中には、ゆっくり針を撤回だが逆流を最小限に抑えるためにブレブで先端を維持を確認してください。
   10. Endoillumation と注入カニューレを除去した後爪鉗子を用いたトロカールを削除し、30 で軽く圧力をかけ先端または鉗子の鈍い端を使用して自己密封式縫合レス sclerotomies s。
4. 脱水症状を防ぐために皮下生理食塩水 10 mL を与える post-surgically。手術後のステロイド外用剤や抗生物質を与えていません。鎮痛薬は、手術後 0.5 mL ブプレノルフィン 0.3 mg/ml 皮下後外科として日を与える。
5. 使用後は、すべての楽器を浸漬した秒のカップルのためまず 70% エタノールで第二に 45% のエタノールで洗い、最後に蒸留水します。ペーパー タオルでそれらをきちんと乾燥します。
6. 彼らは十分な意識を取り戻すし、それらのすべて 1 つの希を配置するまで動物に出席します。必要な場合 (例えば、免疫組織化学用)、100 mg/kg のペントバルビ タールの静脈注射によって動物の安楽死 (材料の表を参照してください)。
7. HESC 網膜色素上皮細胞の移植を続行する 7 日を待ちます。

2. 網膜下移植扱われる動物の hESC RPE 細胞の

1. 挿入時間下腹部の縁から 1-2 mm 1 週間、悪名高く RPE 移植前に 30 g の注射針を使用して麻酔下の動物トリアムシノロン硝子体内の 2 mg (100 μ L) を管理し、再管理すること 3ヶ月。先端レンズの接触を避けるために目の極を指すことを確認します。
2. 前述¹hESC 網膜色素単分子膜の文化.
3. 24 ウェル合流 hESC RPE 単層の細胞分化メディア (材料の表を参照) を削除し、それぞれを洗う 500 μ L の PBS Ca^{2 +}と Mg^{2 +}なしでも。2 洗浄の合計のためもう一度この操作を繰り返します。
4. 上澄みを廃棄、好評につき、トリプシンを 500 μ l 添加し、37 ° C で 12 分間インキュベート
5. プレートを傾けるし、トリプシン (セルのプレートに接続されている必要がありますまま) を慎重に取り外します。穏やかなピペッティングまたは単一細胞懸濁液を得るに必要な場合をも削りによって新鮮な 37 ° C prewarmed 分化メディアの 800 μ L のセルを収集します。
   注: は、細胞塊が認められた場合、40 μ m セル ストレーナーを使用します。
6. 製造元の指示に従って、トリパン ブルーの 0.2% を使用して検定商工会議所でのセルを数える。
7. 室温でメディアと遠心分離機の細胞の分化、5 分 300 x g の 5 mL を追加します。
8. 上澄みを廃棄し、新鮮なフィルター滅菌 PBS (25 mm シリンジ フィルターを通過) を 1,000 細胞/μ L の最終濃度でペレットを再懸濁します。
9. 因数 600 μ 因数や氷まで、手術中に前の細胞の懸濁液。
10. 30 G の注射器を使用して生理食塩水で 35 mg/kg、ケタミン 5 mg/kg とキシラジンの混合物で腿に筋肉内投与で動物を麻酔します。0.75% 2.5% とシクロペントラート フェニレフリンのアミックスを使用して局所点眼薬で生徒を広げます。適切な anesthetization を確認した動物が戻ってその足でハードのピンチに反応しない場合。
11. 外科医が直面している頭にウサギを配置します。ふたリトラクターを使用すると、汚染のリスクを最小限に抑えるための滅菌布でまぶたと瞬膜の膜を削除できます。両方の目で麻酔中の乾燥を防ぐために BSS を使用します。
12. マイクロサージャリー、2 ポートを使用 (または省略可能な 3 ポート) の 25 G transvitreal 手順 1.3 と図 2で説明したように、同じ位置に配置のトロカールとプラナ法のパルスします。以前の sclerotomies が表示されている場合実行トロッカー挿入だけ隣接するが、これら術後の漏れのリスクを最小限に抑えることではなく。
    1. 眼とコンタクト レンズ (図 1 a) の連絡先ゲルとして合成の涙で、網膜を視覚化する角膜のシングルユース フラット コンタクト レンズを置きます。
    2. 適切なヒント (を参照してください手順 1.3.5 と 1.3.6) を配置後、軽く混合 hESC RPE の懸濁液 (50,000 セル) の 50 μ L を subretinally 注入します。特徴的な「金属」遠藤照明反射によって区別ナイオ₃前処理領域の中心を目指してください。麻痺の網膜は、簡単にはっきりと見えるブレブを作成を分ける必要があります。ウサギ/後滅菌 H₂O の間で針を使用針セル目詰まりを避けるためにフラッシュに凝集します。目詰まり時の針の変更に気づいたです。
    3. 注入中には、ゆっくり針を撤回だが逆流を最小限に抑えるためにブレブで先端を維持を確認してください。
    4. Endoillumation と注入カニューレを除去した後爪鉗子を用いたトロカールを削除し、30 で軽く圧力をかけ先端または鉗子の鈍い端を使用して自己密封式縫合レス sclerotomies s。
13. 脱水症状を防ぐために皮下生理食塩水 10 mL を与える post-surgically。手術後のステロイド外用剤や抗生物質を与えていません。鎮痛薬は、手術後 0.5 mL ブプレノルフィン 0.3 mg/ml 皮下後外科として日を与える。
14. 使用後は、浸すことによってそれら、秒のカップルのためまず 70% エタノールで第二に 45% のエタノールですべての楽器を洗浄し、最後に、蒸留水します。ペーパー タオルでそれらをきちんと乾燥します。
15. 彼らは十分な意識を取り戻すし、それらのすべて 1 つの希を配置するまで動物に出席します。(例:免疫組織化学のため)、必要な場合 100 mg/kg のペントバルビ タールの静脈注射によって動物の安楽死します。

3生体内で網膜と網膜イメージング。

1. スペクトル領域光干渉断層レントゲン写真撮影 (SD-10 月) デバイスを使用し付属のソフトウェア (材料の表を参照) の製造元の指示に従って、扱われた動物の断面 b-スキャンを取得します。画質劣化を避けるために、すべての 30-60 s 局所生理食塩水でフラッシュすることにより、角膜を湿った保つことことを確認します。
   1. ウサギ網膜へ楽器の光源から遮るもののないパスを取得する調整可能なマウントに (手順 1.1 および 2.10 参照) 麻酔は、瞳孔拡張動物を配置します。
   2. 同時赤外線共焦点走査レーザー眼底検査で少なくとも 3 OCT スキャン注入領域の上下、中央部分を表す (IR cSLO) 反射率参照画像を取得します。
   3. アン顔に青、緑、赤外線、およびマルチカラー レーザー反射率 (すなわち、複数同時のレーザーの色)、それぞれ cSLO と眼底画像を取得します。
   4. SD 10 月装置の青色光レーザー機能を使用して青い光蛍光 (BAF) 画像をキャプチャします。

結果

BAF、IR cSLO、および通常のアルビノのウサギ網膜の SD-10 月の代表的な生体内のイメージは図 2のとおりです。SD 10 月楽器によってキャプチャされた光の反射の特徴的なレベルでさまざまな網膜層に注意してください。

サブ網膜鉱物を作成するセットアップを示す図 1 a 図 1 b: ふたリトラクターを配置すると、レンズを避けるために 3 のトロカール (図 1 b) 角膜輪部から 1-2 mm の挿入を許可するようにまぶたを施すタッチ、そして 30-45 ̊ 角膜輪部の平行角度で。トロカールは、軽くて、強膜を介して注射針ほかの省略可能な注入カニューレの導入を可能になります。手術の手順は、実...

ディスカッション

このプロトコルでは hESC RPE 統合生体内評価 GA とその臨床使用の大きな目モデルの生成を説明します。

クリニック⁷に GA と関連疾患の再生治療の翻訳、開発し、忠実に移植とイメージングの臨床方法をキャプチャする方法を最適化することが重要です。ウサギは、この側面の魅力的な: 眼内手術および標準の画像の使用を許可する比較的大きな目があり安くて簡単に収容された大きな目の他の動物と比較されます。

サブ網膜の損傷を誘発するまたは悪名高く網膜色素上皮を移植するサブ網膜の鉱物の作成の標準 transvitreal 25 ゲージ pars プラナ硝子体手術テクニックの使用について述べる。当初、我々 はプロシージャの間に、硝子体手術を行った場合に、注入ポート (トロッカー) を使用するつもりでした図 1 bで示すよう 3 ポート設定を使用しました。しかし、以来、我々 はサブ網膜注射を適用するため必要があると硝子...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NutriStem hESC XF分化培地–bFGF と –TGFb	Biological Industries	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
セルストレーナー 40 μm ナイロン	VWR	732-2757
針 30 G 0.5'’;0.3 mm x 13 mm	BD Microlance	304827
Acrodisc 25 mm シリンジフィルター	Acrodisc	PN4612
0.4% トリパンブルー	サーモフィッシャーサイエンティフィック社	15250061	0.2%
NaIO3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
70% Ethanol	SolvecoAB	1047
ケタミノール、100 mg/mL	Intervet、Boxmeer	511519	35 mg/kg ケタミン
Rompun vet、20 mg/mL	Bayer Animal Health	22545	5 mg/kg キシラジン
Triescence、40 mg/mL	Alcon Nordic A/S	412915	2 mg ウイルス内
Cyklopentolat-phenylephrine、0.75% + 2.5%	APL	321968	各眼
Viscotears	Laboratoires Théa	597562
局所生理食塩水	Apotea AB	7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL	Omnidea	77168	使用 100 mg/mL ペントバルビタール
エクステンションチューブ (ハンマー)	MedOne Surgical Inc	3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula	MedOne Surgical Inc	3219	25 G/38 G
Single Use Flat Lens	Volk
Barraquer Colibri lid retractor	AgnTho's AB	42-020-030
ノンバルブトロカール	Alcon Nordic A/S	8065751448
爪鉗子	Bausch &Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS 硝子体切除機	Alcon Nordic A/S	8065740238
Accurus 25+ ゲージ 硝子体切除術 TotalL Plus	Pak Alcon Nordic A/S	8065751493
SD-OCT デバイス	ハイデルベルク エンジニアリング	スペクトルリス HRA+OCT	使用 ハイデルベルク アイ エクスプローラー バージョン 1.9.10.0
24 ウェルプレート	Sarstedt	83.3922
ノイバウアー血球計算盤	VWR	631-0925
ニュージーランド アルビノウサギ	LidköRabbit Farm, Sweden
hESC-RPE細胞			参照番号1
>Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml	Dechra	660500	0.5 mLのブプレノルフィンを皮下投与してください