点滅表面増強ラマン散乱の観測と解析

Yasutaka Kitahama

doi:10.3791/56729

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方法論記事

点滅表面増強ラマン散乱の観測と解析

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DOI：

10.3791/56729

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2018年1月11日

Yasutaka Kitahama¹

¹Department of Chemistry, Kwansei Gakuin University

この記事について

サマリー

このプロトコルを記述する点滅表面増強ラマン分析発電法を用いた銀表面の単一分子のランダム・ウォークによる散乱します。

要約

銀 nanoaggregate 接合部での単一分子から点滅表面増強ラマン散乱 (SERS) が観察されます。SERS 活性を準備する方法のプロトコルを表示するここでは、銀の nanoaggregate、顕微鏡画像の特定の点滅しているスポットのビデオを記録し、点滅の統計情報を分析します。この分析では、べき乗則はその期間を基準にして明るいイベントの確率分布を再現します。暗いイベントの確率分布は、指数関数との力法律によって取り付けられています。べき乗則のパラメーターは、明るいと暗い状態での分子の挙動を表します。ランダムウォークモデルおよび銀表面全体に分子の速度を見積もることができます。それは平均、自己相関関数、および超解像 SERS のイメージングを使用する場合でもを見積もるは困難です。将来は、点滅の起源は、単独でこの分析法による確認ができないため電力法解析スペクトルイメージングを組み合わせる必要があります。

概要

表面増強ラマン散乱 (SERS) は、機密性の高い貴金属表面ラマン分光です。金属表面上の単一分子の情報を調べることができますラマンスペクトル、分子内の機能グループの振動モードを鋭いピークの位置に基づく分子の構造に関する詳細情報を提供しますのでSERS¹^,²^,³を使用しています。分子レベルで吸着と銀 nanoaggregate から点滅信号が観察される¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶、およびスペクトル変動¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^、 ⁹^,¹⁰^、¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴。点滅は、ナノサイズの銀 nanoaggregate ジャンクションで強化された電磁 (EM) フィールドがランダムに出入りする単一分子誘起することができます。したがって、点滅と、表面増強ラマン散乱強度および bi 検体²^,³^,¹⁷のポアソン分布を用いた手法と比較して、単一分子検出のための簡単な証拠と見なされます。ただし、Ag 表面上の分子の挙動に依存が強く、点滅と変動のスペクトルの詳細なメカニズムはまだ論争を呼びます。

従来、SERS の点滅が分析されて拡散係数と、強化された EM フィールド¹²^,¹³^,^{14 出入りする分子の濃度を計算することができます自己相関関数を使用して}.さらに、全磁力の不安定性を表す、正規化された標準偏差のスコアは、信号¹⁵時間プロファイルから派生しています。ただし、これらの分析方法は、いくつかの分子の挙動に基づく可能性があります。対照的に、SERS の点滅の超解像イメージング、強化された電磁界での単一分子の挙動は、識別された¹⁶をすることができます。ただし、これらのテクニックは、強化された EM 分野のみでこのようなパラメーターを取得できます。平均⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,^{8 よりもむしろ力法律として (例えば、SERS の点滅) の広い範囲での単一分子のランダムな動作を表現できます。} ^,⁹^,¹⁰^,¹¹, 半導体単一量子ドット (QD)¹⁸^,¹⁹から点滅蛍光に似ています。電力法分析⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹, 分子の挙動を使用して(強化された電磁界) で明るい状態と暗い状態¹⁰; の両方に推定することができます。つまり、全体の銀表面上の分子の挙動を推定できます。

この技は、銀コロイドハイパーラマンが使用される⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹。これらハイパーラマンは、ある特定の波長で興奮しているとき強く強化された電磁界に影響を与える各種の局在表面プラズモン共鳴 (LSPR) バンドを示します。したがって、SERS 活性銀ナノ粒子コロイド懸濁液といくつかのデータに存在するがすぐに得られます。単純なナノ構造、ある特定のサイズ、形状、および手配の場合点滅 SERS の LSPR の依存性は、他の依存の⁷; を隠すことができます。すなわち、LSPR に良し悪しのナノ構造を使用する場合、パラメーターは定数になります、他の依存したがって隠されています。銀コロイドハイパーラマン⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,から点滅 SERS の様々な依存症を発見するパワー法解析が使用されています⁹^,¹⁰^,¹¹。

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プロトコル

1. サンプル準備

銀コロイドのナノ粒子の作製²⁰
1. 銀コロイドのナノ粒子を作製するには、0.030 g 硝酸銀と 0.030 g 200 mL 丸底フラスコに水 150 mL にクエン酸ナトリウム二水和物を溶かします。
2. (ジムロート) 還流凝縮器とフラスコを組み合わせます。
3. 磁気スターラー、攪拌棒でフラスコ内でソリューションをかき混ぜます。60 分 150 ° C で油浴中でフラスコの攪拌溶液を熱し。
  注: ソリューションは、黄色、乳白色、グレーになります。
4. 室内の温度の懸濁液を冷却し、冷蔵庫にアルミ箔で覆われたフラスコの懸濁液を維持します。
  注: プロトコルをこの時点で一時停止できます。コロイド状ナノ粒子を使用して、1 ヶ月以内、冷蔵庫で保存した後。
マルチカラーのサンプルの調製点滅発光¹¹
1. 顕微鏡のスライドを準備ができて、石鹸でガラス板を手で洗って水ですすいでください。
2. ガラス板に 0.1% ポリ L リジン水溶液を追加し、送風機とソリューションを削除します。
3. ガラス板に銀コロイド懸濁液を追加および送風機を懸濁液を削除します。
4. 液体ブロッカーペンでガラス板のドロップ領域を囲みます。
5. ガラス板に蒸留水をドロップし、顕微鏡スライドを作成し、水が蒸発するを防ぐ別のガラス板でそれをカバーします。
単調な色点滅 SERS のサンプルの調製⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰
1. 顕微鏡のスライドを準備ができて、石鹸でガラス板を手で洗って水ですすいでください。
2. 銀コロイド懸濁液の thiacyanine または thiacarbocyanine の色素を混ぜて (25 または 4 μ M、それぞれ)、塩化ナトリウム (10 mM) の水溶液 2 の容積比で: 1:1。
3. ガラスプレート上にサンプルサスペンションをドロップし、送風機とサスペンションを削除します。
4. 液体ブロッカーペンでガラス板のドロップ領域を囲みます。
5. 銀ナノ粒子を固定化するガラス板に塩化ナトリウム (1 M) の水溶液をドロップし、顕微鏡スライドプレートを作成し、ソリューションを蒸発から防ぐために、別のガラス板でそれをカバーします。

2. 点滅銀ナノ粒子の観察

サンプルの照明
1. 倒立顕微鏡のステージ上の 1.2 または 1.3 プロトコルを使用したサンプルのガラスプレートを配置します。
2. 様々な色の斑点 (青、緑、黄、および赤) 対物レンズ (60 X) を使用してガラス板上に暗視野コンデンサーとフォーカスを白色光を使用してサンプルのガラスプレートを照らします。
3. ダイオード励起固体 (DPSS) 連続波 (cw) レーザー干渉フィルターを通してから試料表面に対して 30 ° の角度で配信、弱毒ビームを用いたサンプルガラス板を照らします。
4. 周辺の同じ色に単調な色の斑点として銀ハイパーラマンを観察するレーザ光を照射して、レーザー照射面積をビューの中央に移動、z 方向の段階を調整することによってガラスプレート上のスポットに焦点を当てます。
点滅の観察
1. ロングパス・フィルターを対物レンズの後に挿入し、試料表面に対して 30 ° の角度で干渉フィルターを通して配信 DPSS cw レーザー光を用いたサンプルガラス板を照らします。
2. 図 1に示すように、点滅してスポットを見つける (また見なさい図 S1補足資料で) x 方向と y 方向でステージを移動することによって。
3. 20 分間の 61-120 ms の時間分解能を持っている冷却デジタル電荷結合素子 (CCD) カメラに結合、倒立顕微鏡で点滅している地点のビデオを記録します。

3 点滅表面増強ラマン散乱の解析

時間プロフィールビデオからの導出
1. CCD カメラを制御するソフトウェア、ビデオのファイルを開きます。
2. 点滅スポット、暗い領域を選択すると、別にビデオイメージのスポットとの領域をカバーする領域をドラッグします。
3. 点滅スポットやビデオの暗い部分から信号強度の時間分布を導出するには、分析、時系列解析を選択し、時系列解析] ウィンドウで[計算] をクリックします。
4. テキストファイルとしてデータを保存します。
時間プロファイルの解析
1. 時間プロファイルのベースラインは、暗い領域および/または図 2 aと2 bに示すように、多項式関数でフィッティングから時間プロファイルを引いて平らにします。
2. 図 2と2 Dに示すように約 2000 点、私_基本基準強度の標準偏差は、σ, から成る平均基準強度を評価します。
3. 私_基本+ 3 σ、しきい値よりも大きい強度を使用してイベントを暗いから明るいイベントを区別し、各イベントの存続期間を記録します。図 3、たとえば、3.5476 を 0 からイベント記録暗いイベントとして s (持続時間t = 3.5476 s)、4.0981 に 3.5476 からイベントを記録および明るいイベントとして s (持続時間t = 0.5505 s)。表 1に示すように、手順を繰り返します。
4. 表 2の最初と 2 番目の行で表さ各期間の明るい部分と暗いイベントの数をカウントします。
5. 期間tよりも短い間隔でイベントを除いて、各期間のイベントの数を合計します。各期間のイベントの数をたとえば、合計表 2の 2 番目と 3 番目の行に示された、( tのイベントを除いて 0.0612 = s) 41 + 18 + 9 +...;その結果tの総和に等しい = 0.1223 s、すなわち103。
6. 各期間合計で割ります、正規化します。表 2に示された、たとえば、分割期間tの合計 = 0.0612 期間 0.0612 s で s。結果は 3,351.5791 です。次に、表 2の 4 行目の結果の合計で結果を分割します。確率分布は、0.64494 に派生します。
7. 明るいイベントP、_上(t) 対数-対数グラフで自分の時間tに対して確率分布をプロットし、ログ₁₀P_の(t)_{10 のログ}()、電源法指数 α_に特定のスポットで点滅を推測します。P_の(t) が取り付けられている場合、近似直線は、図 4Aの点線で示すように、 P_の(t) の小さな値でプロットから逸脱。
8. 暗いイベントP_オフ(t) 対数-対数グラフではtの期間に対する確率分布をプロットし、ログ₁₀(ログ₁₀P_から(t) に合わせてください電源法指数 α の_オフと、切り捨て時間τ同じ点滅からスポットを推測します。P_オフ(t) が取り付けられている場合、 P_オフ(t) の小さな値でプロットから逸脱する近似曲線。
9. ビデオで他の点滅しているスポットを 3.2.1 に 3.2.8 を繰り返します。

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結果

プロトコル 1.2 により作製したポリ L リジンと銀のハイパーラマンからは、 1 図¹¹に示すように SERS と表面増強蛍光から色とりどりの点滅しているスポットを観察します。対照的に、表面増強ラマン散乱から単調な色の点滅の斑点は、プロトコル 1.3⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰で作製した色素分子銀ハイパーラマンの観察されました。「否定的な」結果の 2 つ種類があります: 連続的な結果、または結果表面増強ラマン散乱が観測されません。前者と後者の結果は、それぞれコロイド銀表面分子の高または低濃度によって引き起こされる可能性があります。

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ディスカッション

銀 nanoaggregate ジャンクションからセールが出力されます。したがって、我々はコロイド状ナノ粒子、クエン酸アニオンで覆われているよりもむしろハイパーラマンを準備する必要。銀の集計は、ポリ-L-リジン、NH₃⁺し、サールの起源の付加によって作成されるエフェクトを塩漬けから形成されているまたは塩化ナトリウム、補足資料の図 S2のようにから Na⁺陽イオン。さらに、広域で多くのスポットを照らす、やり場のないレーザー光は顕微鏡に接続されていないレンズを通して、試料表面に対して 30 ° の角度で配信されます。観測したい領域が点灯しない可能性があります。調整し、高い倍率で観察領域を照射するレーザーの領域に移動します。この最適化後は単調な色の斑点が同じ色環境で表示されます。表面増強ラマン散乱観察を点滅のための重要なステップです。

ここでは、電力法解析のため注意が必要な事項が説明されています。まず、明るい部分と暗いイベントの定義のしきい値点滅の分析に影響を与えます。しきい値を増加する...

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開示事項

著者は、何を開示します。

謝辞

著者は、この作品の実りある議論するため尾崎幸洋教授 (関西学院大学)、伊藤哲夫博士 (国立科学研究所の高度な産業と技術) をありがちましょう。この作業は、教育省、文化、スポーツ、科学および技術 (第 16 K 05671) から科研費 (費補助金科学研究 C) によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前	会社	カタログ番号	コメント
硝酸銀、99.8%	和光	194-00832
クエン酸三ナトリウム二水和物、99. %	和光	191-01785
ポリ-L-リジン水溶液、0.1%	シグマ-アルドリッチ	P8920
3,3'-ジスルホプロピルチアシアニントリエチルアミン	林原生化学研究所	NK-2703	チアシアニン染料の一種
3,3'-ジエチル-5,5'-ジクロロ-9-メチルチアカルボシアニンヨウ素塩	林原生化学研究所	SMP-9	チアカロボシアニン染料の一種
塩化ナトリウム, 99.5%	和光	191-01665
ディムロスコンデンサー	いわき	61-9722-22	AS ONEからパーチャス
マグネチックスターラー	コーニング	DC-420D
オイルバス	アドバンテック	OS-220
ガラス板	松波	S-1112	顕微鏡スライド
ブロワー	宝山	Z-288	エアダスター
リキッドブロッカーペン	大同産業		リキッドブロッカー(スーパーパップペン).免疫組織化学アプリケーション用に設計されたすぐに使用できる疎水性バリアペン
倒立顕微鏡	オリンパス	IX-70
対物レンズ	オリンパス	LCPlanFl 60×	NA 0.7
暗視野コンデンサーオ	リンパス	U-DCD	NA 0.8–0.92
冷却デジタルCCDカメラ	浜松	ORCA-AG	ソフトウェアで制御アクアコスモ
冷却デジタルCCDカメラ	浜松	アクアコス	の点滅スポットから時間プロファイルの導出にも使用
カラーCCDカメラ	ELMO	TNC-C920	分析に使用されていません
DPSSレーザーRGB	レーザーシステム	NovaPro532-75	&ラムダ; = 532 nm; 60 mW (600 W/cm2 の電力密度に対応)
干渉フィルター	Semrock	LL01-532-12.5
ロングパスフィルター	Semrock	BLP01-532R-25
++によってプログラムされた	明るい/暗いイベントの区別とカウントのためのソフトウェア	メイド
則によるフィッティングのためのソフトウェア	LightStone	Origin6.1

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参考文献

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