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方法論記事

統合欠陥レンチウイルスベクターにパッケージ化された転写調節睡眠美容システムによって効率的な体外転位法

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DOI：

10.3791/56742

⸱

2018年1月12日

 ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、転写調節の眠れる森の美女システムによって人間のゲノムへの興味の遺伝子の安定した統合を実現する方法について説明します。統合導入された細胞の分子アッセイ、ひと細胞の体外伝達不良レンチウイルスベクターの作製が報告されます。

要約

眠れる森の美女(SB) トランスポゾンは遺伝子導入および機能ゲノム解析の実証済みの有効性と非ウイルス性統合システムです。SB トランスポゾン機械を最適化するためには、転写規制多動トランスポザーゼ (SB100X) やトランスポゾンの T2 ベースを採用します。通常、トランスポザーゼとトランスポゾンは一過性トランスフェクション プラスミッドによって提供される、SB100X 式が構成のプロモーターによって駆動されます。ここでは、SB100X 式を制御し、安定した統合により、「カットアンド ペースト「アンチモン (五井) 興味遺伝子のいくつかの物理的および化学的遺伝子導入方法に耐性がある人間の細胞に SB コンポーネントを提供する効率的な手法について述べるメカニズム。多動トランスポザーゼの式は 1992 年以来の遺伝子発現の制御に広く用いられる、テトのシステムによって厳しく制御されています。興味の遺伝子は、反転の繰り返し (IR) T2 トランスポゾンによって挟まれています。SB の両方のコンポーネントは、欠陥レンチウイルスベクターは一過性 HEK293T 細胞で生産される統合パッケージ化されます。ヒトの細胞、細胞株あるいは人間のティッシュから初代培養細胞は体外一過性のウイルスのベクトルを導入です。培地にドキシサイクリン (dox、テトラサイクリン アナログ) の追加が、トランスポザーゼ式の微調整は、測定し、扱われた細胞のゲノムの興味の遺伝子の長期的な統合の結果します。このメソッドは効率的で (例えば、HeLa 細胞) と初代培養細胞 (例えば、人間プライマリ ケラチノ サイト) に適用される、従って遺伝子工学や遺伝子治療のための貴重なツールを表します。

概要

T2 ベース トランスポゾンと結合した多動 SB100X トランスポザーゼは既に臨床遺伝子療法アプリケーション1,2,3, ゲノムの変更4、5で使用されていて、誘導多能性幹細胞 (iPSC)6,7をプログラムし直します。通常、SB コンポーネント一過性トランスフェクション プラスミドによって提供されます、強い構成プロモーター ドライブ、トランスポザーゼの式。ただし、トランスフェクションの向上新しい方法にもかかわらず二成分系の配信のまま多くのアプリケーションのための挑戦です。したがって、新しい配信プロトコルの開発は、関心が高まっています。トランスフェクション法プラスミド8と mRNA9、ほかウイルス配信によるアデノ ウイルス10、11、アデノ随伴ウイルス (AAV)12、バキュロ ウイルス13、gammaretroviral14レンチウイルスベクター15は過去に提案されています。特に、選択肢のシステムはウイルスのベクトルの統合がなければ SB コンポーネントの一時的な配信を保証しなければなりません。それにもかかわらず、構成式のトランスポザーゼは、トランスポゾンの手に負えない rehopping の危険があるため安全上の懸念を発生させます。

したがって、洗練されたテトのシステムによる SB100X の転写調節機構は、初挑戦です。単純ヘルペス ウイルス 1 (HSV-1)16, Timidine キナーゼ (TK) 遺伝子の最小プロモーター (-81) とオリジナル開発最小限サイトメガロ ウイルス (CMV) のプロモーターを置き換えることによって得られる変更されたテト応答性プロモーターのクローンの上流、SB100X cDNA (pTetOTKSB100X)。変異の逆テトラサイクリン トランス rtTA2s-M217は異なるプラスミドの複製 (ホスホ グリセリン酸プロモーター、PGK) 強い構成プロモーターの制御下で表されます (pCCL PGKrtTA2S・ m 2)。Dox を培養培地に加え、rtTA2sがバインドされます-M2 の変調器は、複雑なまたは、SB100X 式18の堅く調整された誘導の Tet プロモーターをテザーします。

2 番目の主要な課題は、物理的・化学的手法によるひと初代培養細胞の非能率的なトランスフェクションから発生します。ひと細胞のトランスフェクション、SB100X、rtTA2sに耐性トランスポザーゼを効率的に配信-M2 式カセットが 2 つ統合欠陥レンチウイルスベクター (IDLVs)19にパッケージ化: IDLVTKSB と IDLVrtTA2s-M2。ウイルスのベクトルは一過性 HEK293T 細胞20と Vescicular 性口内炎ウイルス (VSV G)、感染症の広範なスペクトルを与えるの糖蛋白質 G の新規第 3 世代ベクトルとして生産されています。ベクトル粒子は遠心によって濃縮され、HIV 1 ギャグ p24 イミュノキャプチャー滴定します。細胞と細胞を変換するには、ベクトル粒子は polybrene 複合体し、dox の有無と標的細胞培養が。薬物依存性活性化導入された細胞における SB100X の発現は、定量的 RT-PCR (qRT PCR)18によって測定されます。

テト規制 SB100X 式を示した一度ターゲット細胞のゲノムに (例えば、緑色蛍光タンパク質 GFP) 五井の転位は明らかに Bak とミケルセン21描き出しました分子イベントに従います。IDLV 3 分の 1 は、五井 T2 トランスポゾン IRs (IDLVT2) 間のクローン作成の式カセットが構築し上記のようにパッケージを運ぶベクターします。最後に、効率的に生体外で人間の細胞 (例えば、プライマリ ケラチノ サイト) 変換し、ドキシサイクリン18存在下で五井を統合する 3 つの IDLV ベクトルを使用できます。

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プロトコル

1. プラスミドを採用

注: プラスミド pCCL PGKrtTA2S-M2 親切教授 Zappavigna (大学のモデナとレッジョ ・ エミリア、モデナ、イタリア) で提供されました。非常に活発なトランスポザーゼのコード配列を運ぶ pCMVSB100X プラスミドと pT2/BH トランスポゾン プラスミド親切教授 Z. Ivics (ポール Ehrlich の協会、ドイツのランゲン)、教授 Z. Izvak (Max Delbruck 分子医学センター、ベルリンで提供されました。ドイツ)。

  1. エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) すべてクローン選択と制限酵素のクローニング法またはクローンを作成するのには、フラグメントの PCR 増幅に従ってください。
    注:表 1はこのプロトコルで採用されているプラスミドのすべてをまとめたものです。説明とそれぞれのプラスミッドのための参照を提供しています。

2. ウイルスのベクトル生産

注: すべてのウイルスのベクトルは、機関の規則や規制によると、BSL2 のバイオセイフティ封じ込めのレベルでバイオハザード フードで生産されます。

  1. ダルベッコ変更イーグル培地で培養付着 HEK293T 細胞 10 %hyclone 血清、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン、2 mM グルタミンと補われます。
  2. 日 0: 5 の 15 cm プレート/ウイルスの準備と種子 5.5x106セル培地 30 ml を準備します。
  3. 1 日目: トランスフェクション
    1. トランスフェクションを開始する前に 2 x HEPES バッファー生理食塩水 (HBS) の 100 mL を準備します。
      塩化ナトリウム (5 M) 5.6 mL
      HEPES (1 M) 10.0 mL
      Na2HPO4 (0.5 M) 0.3 mL
      滅菌水の 84.1 mL
      PH 7.1 37% に調整 HCl。
      注意: 2 x HBS が 4 ° C で保存することができます。正確な pH は、効率的な transfection のため非常に重要です。最適の pH 範囲は、7.10 に 7.12 です。
    2. 培地を取り除き、トランスフェクション前に新鮮な中 4 h 22.5 mL/プレートの追加。
    3. 次の量/プレートによると pRSV Rev (表 1) pMD2.G 封筒エンコーディング プラスミド、pMD.Lg/pRRE.D64VInt 包装プラスミド伝達プラスミド HEK293T 細胞を transfect:
      プラスミド 25.00 μ g を転送します。
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 μ g
      pMD2.G 8.75 μ g
      pRSV Rev 6.25 μ g
      注: プラスミッド DNAs Maniatis22エンドトキシン フリー プラスミド精製キットを使用して記述されている協調プロトコルを用意しています。
      1. 1.125 mL の滅菌水に DNA (4 プラスミドの混合) の 56.25 μ g を再懸濁します、2.5 M CaCl2 (溶液) の 125 μ L を追加します。
      2. 2 x HBS の 1.250 mL を 15 mL の滅菌円錐形遠心分離機管 (B 液) に追加します。
      3. ソリューションを追加 (1.250 mL) B (1.250 mL) 滴下バブリング中 1 または 2 mL ピペットで (トランスフェクション ソリューション、容量 2.500 mL)。
      4. 室温 (RT) で 20 分間インキュベートします。
      5. P1000 マイクロ ピペットを使用して、配布すべて単層細胞へのトランスフェクション解決策 (2.500 mL) の滴下。
    4. 37 ° c、5% CO2細胞文化のインキュベーターで一晩インキュベートします。
  4. 2 日目: メディアを削除し、新鮮な媒体の 15 mL を追加 (手順 2.1 を参照してください)。
  5. 3 日目: 収集し、レンチ ウイルス粒子を含む上清を集中します。
    1. すべてから上清 (〜 70 mL) を収集 (n = 5) transfected セル板は PES フィルターし、2 polyallomer 管 (1 インチ x 3.5 インチ) を満たす 0.45 μ m を介してフィルタ リング/ウイルス準備。
    2. ブレーキ付けの 15 ° c、2.5 h の 106,000 x g で超遠心法によるベクトル粒子を集中します。
    3. (チューブのペレットの再懸濁を避けるため) に遠心をそっと停止直後に 10% の漂白剤を含むコンテナーに上澄みを注ぐし、1 × pbs 100 μ L に 2 やっと目に見えるペレットを中断 (+1 %bsa)。これは正常、ペレットが明確で非常に小さいです。作りたて、または因数の集中のベクターを使用し、-80 ° C でウイルス製剤を格納
      注意: 上清には、バイオハザード廃棄物を破棄する前に徹底的に漂白する必要がレンチ ウイルス粒子が含まれています。
  6. ウイルスのベクトル準備を滴定しなさい、製造元のプロトコルに従って HIV 1 ギャグの p24 イミュノキャプチャー キットを使用します。
    注: ウイルスのベクトル生産の標準化、リポソームを用いた試薬を採用することができます。それにもかかわらず、ウイルスのベクトル力価は高いトランスフェクション効率とプラスミド DNA の純度に依存です。

3. ひと培養細胞 (HeLa 細胞など) の伝達

注: HeLa 細胞を 2 mM グルタミン、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン, 10% 牛胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地で培養しています。表 1は、このプロトコルで採用されているベクトルのすべてをまとめたものです。各ベクトルについて説明します。HeLa 細胞の情報伝達は、2 つの IDLV ベクトルの最高用量の組み合わせで SB トランスポザーゼの転写制御の検証をことができます。IDLV 線量の変動ベクトル粒子の滴定およびターゲット細胞型に関連します。

  1. 0 日目: 種子 2 x 105セル 6 ウェル プレートの各ウェル用培地 3 mL に。4 井戸を準備します。
  2. 1 日目: HeLa 細胞の伝達。
    1. 各条件について、1 mL 中の最終巻にレンチウイルスベクターを希釈 (上記のメモを参照してください) polybrene (最終濃度 8 μ g/mL) の 10 μ L の存在。
      1 位よく希釈: 導入された細胞 (マイナス コントロール) を模擬します。
      希釈も #2: IDLVTKSB ベクトル (2,600 p24 の ng)。
      井戸 #3 #4 希釈: IDLVTKSB ベクトル (2,600 p24 の ng) + IDLVrtTA2s-M2 ベクトル (9,600 p24 の ng)。
    2. HeLa 細胞が 0 日でメッキされた、各ウェルからメディアを取り出して、よく対応するレンチウイルスベクターの希釈液を追加します。
    3. Spinoculate 20-25 ° C と 37 ° C、5% CO2で細胞文化のインキュベーターに振込み 6 ウェル プレートの 45 分の 754 x g で 6 ウェル プレート。
    4. 6 時間後すべての井戸で新鮮な培地で中含まれているベクトルを置き換える、ドキシサイクリンをよく #4 で 1 μ M に追加します。48 h の 37 ° C で細胞文化のインキュベーターに皿を置きます。
  3. 3 日目: RNA の抽出細胞ペレットの準備。
    1. 細胞をデタッチする前にトリプシン作業溶液 (1 x) を準備します。
      2.5% トリプシン (10 x) 5.0 mL
      500 mM EDTA (最終濃度 5 mm) 0.5 mL
      mL の PBS 44.5 x 1
    2. 使用する前に 37 ° C で暖かいトリプシン作業ソリューションです。4 ° C でトリプシン作業ソリューションを格納します。
    3. 培地を取り除き、洗浄 1 × PBS のセル。各ウェルに 37 ° C に予め温めておいたトリプシン作業溶液 0.5 mL を追加し、37 ° c (細胞文化のインキュベーター) で 7 分間加温します。
    4. 血清を含む 0.5 mL を追加し、孵化後トリプシンと遠心分離機管の収集の細胞を不活化する各ウェル中。3 mL の 1x PBS も一度それぞれを洗い、240 x g で 5 分間細胞懸濁液を遠心分離します。
    5. 5 ml の 1x PBS、240 x g で 5 分間遠心分離機の細胞を洗浄し、上清を捨てます。新鮮細胞ペレットを使用または-80 ° C で保存半定量的 RT-PCR を実行するペレットからの総 RNA の抽出 (手順 6 を参照)。

4. ひと初代培養細胞 (ケラチノ サイトなど) の伝達

注: プライマリ ヒト角が致死的照射 3T3 J2 セル (送り装置の層)23、ヤン Barrandon (スイス連邦工科大学、ローザンヌ、スイス連邦共和国) からの優しい贈り物にシードされます。

  1. ダルベッコ変更イーグル培 10% ドナー牛血清、50 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン、4 mM グルタミン (3T3 中) とスイス マウス 3T3 J2 細胞を成長します。
  2. ウシ胎児血清 (10%)、ペニシリン ・ ストレプトマイシン (1%)、グルタミン (2%)、インスリン (5 μ g/mL)、アデニン (を含む cFAD 媒体、ダルベッコの変更イーグル中規模およびハムの F12 メディア混合物 (1:3) 致死的照射 3T3 J2 セルにメッキ ケラチノ サイトを成長します。0.18 mM) ヒドロコルチゾン (0.4 μ g/mL)、コレラ毒素 (0.1 nM) とトリヨードサイロニン (2 nM)。
  3. 日 0: 3 x 10 の種5致死的照射 3T3 J2 セル、以前 3T3 中長期 1 × 105セル/mL、6 ウェル プレートの各ウェルの最終濃度に希釈します。9 井戸を準備します。
  4. 1 日目: プライマリ ケラチノ サイトの伝達
    注: ケラチノ サイトの伝達により、SB トランスポザーゼの発現制御機構の定量化 IDLV ふたつの最高用量の組み合わせで (qRT PCR) と (cytofluorimetric、標的細胞に五井 (GFP) の統合を確認するには分析)。
    1. 細胞をデタッチする前にトリプシン作業ソリューションを準備します。
      0.5% トリプシン-EDTA (10 x) 5.0 mL
      500 mM EDTA (最終濃度 5 mm) 0.5 mL
      mL の PBS 44.5 x 1
    2. 使用する前に 37 ° C で暖かいトリプシン作業ソリューションです。4 ° C でトリプシン作業ソリューションを格納します。
    3. 10mj/cm ^2 表皮細胞接着を外す、培地を取り除き、洗浄 1 × PBS のセル、各ウェルに予め温めておいたトリプシン実用的なソリューションの 1 つの mL を追加します。細胞文化のインキュベーターで 15 分間 37 ° C で孵化させなさい。
    4. 、孵化後井戸の細胞を再懸濁します徹底的に血清を含む 2 mL を含む遠心チューブに細胞懸濁液を転送中 (多くの細胞がまだ接続されている場合は 37 ° C での追加分の孵化)。それぞれ 1 × PBS または新鮮な培地 3 mL にも一度すすぎ、洗浄液を細胞懸濁液を遠心管に追加します。
    5. 580 x g で 5 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。
    6. 5 ml の 1x PBS、580 x g で 5 分間遠心分離機の細胞を洗浄し、上澄みを廃棄します。
    7. 15 mL ポリプロピレン チューブに 1.6x105のケラチノ サイト cFAD 媒体、条件ごとに 1 つの希釈の 1 mL を希釈します。
    8. レンチウイルスベクター cFAD 中 polybrene (最終濃度 2 mL の最終巻で 8 μ g/mL) の 20 μ L の存在下で 1 ml を希釈するには。
      #3 #2 #1、井戸の希釈液の調製: 導入された細胞 (ベクトルなしネガティブ コントロール) を模擬します。
      井戸 #4 #5 希薄: IDLVTKSB ベクトル (13,000 p24 の ng) + IDLVrtTA2s-M2 ベクトル (48,000 p24 の ng)。
      井戸 #6 希釈 #7, 8 #, #9: IDLVTKSB ベクトル (13,000 p24 の ng) + IDLVrtTA2s-M2 ベクトル (48,000 p24 の ng) + IDLVT2 ベクトル (9,160 p24 の ng)。
    9. 細胞懸濁液を各レンチウイルスベクター希釈 (1 mL) を追加することによって対応する表皮細胞懸濁液 (1 mL 中 1.6x105ケラチノ サイト) に変換します。
    10. 0 日目とそれらの上にプレート導入ケラチノ サイト (1.6x105ケラチノ サイト 2 mL 中) でシードされ致死的照射 3T3 J2 セルからメディアを削除します。井戸を伝達した後、次のいずれかに進みます。
    11. 25 の ° c で 30 分間インキュベートし、6 h の携帯文化のインキュベーターで 37 ° C にセルを転送します。
      注: はない spinoculate プライマリ ケラチノ サイト、生存率や増殖として強く受けます。
    12. 6 時間後に、各ウェルに cFAD 培地 1 mL を追加します。#9、#8 #5 井戸で 1 μ M ドキシサイクリン (最終濃度) を追加します。37 ° c. へのセルを返す
  5. 2 日目: 10 ng/ml の EGF KC 中の 3 mL cFAD 媒体に置き換えます。
  6. 3 日目: Trypsinize (4.4.6 に 4.4.1 を参照) の前に #1、#4、および前述の #5 井戸から血球を洗浄.QRT PCR 解析の総 RNA を抽出する-80 ° c 細胞ペレットを凍結 (手順 7 を参照)。
  7. 4.4.5 に 4.4.1 のステップで説明されているようによく #2、#6 と #8 から細胞を trypsinize し、GFP 発現の cytofluorimetric 分析を実行 (手順 5. を参照)。
  8. 少なくとも 3-4 doublings、未統合 IDLVT2 ベクトル (送り装置の層のメッキ人間プライマリ ケラチノ サイトの 5 日) を希釈するための十分なため井戸 #3 #7、#9 から文化を維持します。
  9. 6 日目: 約 5 日間伝達の記事、trypsinize #3、#7、GFP の表現の cytofluorimetric 解析を実行する #9 の井戸から (手順 4.4.1 に 4.4.5 参照) 細胞 (手順 5. を参照)。
    注: 一次電池の種類によって、収集されたサンプルの変動による、実験タイミングと伝達効率が強く影響されました。

5 導入された主なケラチノ サイトの Cytofluorimetric 分析

注: フローサイト青色レーザーで構成されている (488 nm)、赤レーザー (633 nm) のフィルターには GFP と APC の蛍光性の検出を採用し、(材料表参照)。

  1. 3T3 J2 送り装置の層からケラチノ サイトを識別するラベル導入ケラチノ サイト 3 日目と日 (4.7 と 4.9 の手順を参照してください) 6 戸建マウス モノクローナル APC-共役対策フィーダー抗体。
    1. 各サンプルのバッファーを染色の 4 mL を準備します。
      5% FBS 200 Μ L
      500 mM EDTA (最終濃度 = 2.5 mM) 20 μ L
      PBS 1 × 3780 μ L
    2. 1 ml のバッファーを染色の剥離細胞を洗います。580 x g で 5 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。
    3. 管内流れの cytometry の獲得のため、染色バッファーの 100 μ l 5 x 10 の4細胞を再懸濁します、反フィーダー抗体 (1:50) の 2 μ L を追加します。よく混合し、暗闇の中で氷の上で 30 分間インキュベートします。
    4. 30 分後染色バッファーの 2 mL で洗浄します。580 x g で 5 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。200 μ L のバッファーを染色で再懸濁します。
    5. Cytofluorimetric 分析18によって APC と GFP の信号を取得します。APC-セル人口の GFP+細胞画分は、導入されたケラチノ サイトを示します。
      注: 必要に応じて、PBS 1 で 2% パラホルムアルデヒドでフローサイトメトリーの前にステンド グラス サンプルを修正 x と実行まで暗闇の中で 4 ° c 店。
  2. GFP+の割合の比率をプロットすることによって流れの cytometry データを分析エンドポイント (5 日間) と GFP+の割合でセルセル 2 日後に伝達、IDLVT2 導入の残留レベルを正規化セルです。

6. 半定量的 RT-PCR

注: は、PCR サーマルサイクラーを使用します。

  1. 合計からの RNA の導入または製造元のプロトコルによると、RNA 精製キットを使って細胞をコントロールを抽出します。
    注意: 総 RNA は-80 ° C で保存することができます。
  2. 100 を使用して 20 μ L 反応に cDNA を合成の総 RNA と逆転写酵素キット、製造元のプロトコルによると ng。
    注意: cDNA が-20 ° C で保存することができます。
  3. SB100X、rtTA2sの特定の設計プライマー-M2 と GAPDH (ハウスキーピング遺伝子)。
    提案されたデザイン:
    SB 転送プライマー: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
    SB 逆プライマー: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
    rtTAM2 転送のプライマー: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC 3'
    rtTAM2 逆プライマー: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
    GAPDH 転送プライマー: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
    GAPDH 逆プライマー: 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'
  4. 最終反応量は 50 μ L の PCR を実行します。特に、各 PCR チューブに次の反応を組み立てます。
    (ステップ 6.2) から cDNA (1:5 希釈) 1.00 μ L
    プライマー (10 μ M 株式) を転送 1.00 μ L
    逆プライマー (10 μ M 株式) 1.00 μ L
    dNTPs (10 μ M 株式) 1.00 μ L
    バッファー (+ MgCl2) (10 倍株) 5.00 μ L
    Taq のポリメラーゼ (5 U/μ L 在庫) 0.25 μ L
    滅菌水 40.75 μ L
  5. 熱 cycler の次のプログラムを使用して: 1 サイクル 95 ° C で 5 分間、進む 95 ° C、30 s、58 ° C、30 s、および 30 のための 72 ° C rtTA2sSB100X 34 サイクルの s、32 サイクル-M2、と GAPDH の 25 サイクル。
  6. 1% の agarose のゲルを準備します。ビーカーやフラスコ (10 x の在庫滅菌水で希釈)、x TBE 1 の 100 mL の寒天 1 g を溶解します。旋回毎分 agarose が完全に溶けるまで電子レンジで溶かします。約 50 ° C に達するまで溶かしたアガロースを冷却し、臭化エチジウム (10 mg/mL 在庫) の 5 μ L を追加します。ゲル鋳造用の櫛で組み立てられたゲル トレイに溶かしたアガロースを注ぐ。
  7. Agarose のゲルのサンプル (各 10 μ L) を読み込むし、電気泳動を行います。
  8. 必要な場合ゲル画像を取得し、PCR バンドのデンシトメトリー分析を実行します。

7. 定量 RT-PCR (qRT PCR)

注: 商業配列検出システムを採用します。PCR プライマーと GAPDH のグリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼの 6 carboxyfluorescein (FAM) プローブは商業的に購入しています。

  1. レトロな転写、ステップ 6.2 を参照してください。
  2. プライマーを設計し、SB100X の特定プローブ ソフトウェアを使用します。
    提案されたデザイン:
    SB.2 転送のプライマー: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3'、
    SB.2 逆プライマー: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
    SB FAM をプローブ: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'
  3. 96 ウェル PCR マスター ミックスでリアルタイム PCR を行うし、最終的な反応量 25 μ L でプライマー + プローブ ミックスします。特に、各ウェルの次の反応を考慮してください。
    cDNA (1:10 滅菌水で希釈) 1.00 μ L
    マスター ミックス 12.50 μ L × 2
    プライマー + 20 x プローブ ミックス 1.25 μ L
    滅菌水 10.25 μ L
    メモ: は、3 通すべての反応を行います。ピペッティング エラーを防ぐためには、少なくとも n + 3 反応 (cDNA) なしのミックスを準備します。マルチ チャンネル ピペットを使用して因数。
  4. 次のプログラムを使用してリアルタイム PCR を実行: 95 ° C 10 分後 95 ° C の 40 のサイクルで 1 サイクル 15 s の 60 ° C で 1 分および 4 ° C で開催
  5. QRT PCR データを分析するには、一般的なデータ解析ソフトウェアを使用して、2 の-ΔΔCT定量化による同じ cDNA サンプルの GAPDH のレベルに SB100X の相対式 (RQ 値) を正規化します。

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結果

ここで説明されて手順を使用して規制される SB 成分を運ぶ 3 つの IDLV ベクトル (SB100X、rtTA2S-M2 と T2 GFP のトランスポゾン) パッケージ化され使用を効率的に配信し、しっかりと人間の細胞で SB 系を調節します。図 1 aは、体外伝達 HeLa 細胞 (表 2に報告される) 2 つの IDLV ベクトルの最高用量の組み合わせで SB トランスポザーゼの転写制御を行った方式を示しています。SB100X の転写制御だった qRT PCR (図 1 b) を用いて、オフ状態に対して相対的な量 (RQ) 値としてプロット (IDLVTKSB だけで RQ = 1)。導入された HeLa 細胞の背景 (IDLVTKSB) に SB100X 式の 8 活性化 (+ dox) が得られました。特に、rtTA2sTetTK プロモーターのタ...

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ディスカッション

ここでは、眠れる森の美女による標的細胞のゲノムに安定、五井を統合する広くアクセスできる方法論について述べる-転位を介する。SB システム nonviral ゲノムの編集法を提供するために開発されましたが、統合機械 (トランスポザーゼと T2 トランスポゾン) の効率的な配信は必須です。したがって、SB システムをほとんど transfectable の一次電池、使用する SB コンポーネントのウイルスの伝達は近年10,12,15で追求されました。ただし、採用までウイルスのベクトルのどれも今構成式のトランスポザーゼ トランスポゾンの手に負えない rehopping のリスクにつながる可能性の問題に対処。

転写トランスポザーゼ表現を調整するため、変更したテトでシステム16を利用をしました。RtTA2s結合に伴う重音...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 は教授 Zappavigna、モデナ大学、レッジョ ・ エミリア、モデナ、イタリア pCCL PGKrtTA2Sと私たちを提供するために感謝-M2 プラスミド。我々 はまた pCMVSB100X と pT2/BH プラスミドの教授 Z. Ivics (ポール Ehlrich 研究所、ドイツのランゲン) と教授 Z. Izvak (Max Delbruck センター分子医学、ベルリン、ドイツ) を認めます。この作品は、国際デブラとイタリア大学・研究省によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ダルベッコ修正されたイーグル」4.5g/Lグルコース含有培地、L-グルタミンロンザBE12-614F細胞培養培地なし。
HyClone Fetal Bovine Serum(米国)、特性評価GE Healthcare Life SciencesのSH30071.03、レンチウイルス粒子の生産のためのHEK293T細胞培養に使用されました。
ペニシリン 10.000 UI/ml ストレプトマイシン 10.000 UI/mlロンザDE17-602E細胞培養培地用試薬。
L-グルタミン 200mMロンザBE17-605E細胞培養培地用試薬です。
塩化ナトリウム(NaCl)Sigma-AldrichS7653HBS 2X調製用試薬。
HEPESバッファー、1M生理食塩水ロンザBE17-737EHBS2X調製用試薬にストック。
リン酸水素二ナトリウム二水和物(Na2HPO4·2H2O)、99.5%Merck106580HBS 2X調製用試薬。
塩酸 - ACS試薬37%(HCl)Sigma-Aldrich320331HBS 2X調製用試薬。
注射用滅菌水フレゼニウス・カビ-HBS 2X調製用の試薬。
0.45 以上m PESSフィルターWhatman10462100ウイルス上清から細胞の破片を除去するために使用されるフィルター。
ポリアロマー ベックマンチューブベックマン・コールター超遠心分離によりIDLVベクターを濃縮するための326823チューブです。
PBS-1X w/o Ca, MgLonzaBE17-516F細胞洗浄およびレンチウイルス粒子再懸濁液用バッファー。
ウシ血清アルブミン(BSA)Sigma-AldrichA2153(オプション)レンチウイルス粒子再懸濁液用バッファー。
HIV-1 Gag p24免疫捕捉キットPerkin ElmerIDLV粒子滴定用NEK50001KTキット。
ポリブレンSigma-Aldrich107689形質導入効率を高める試薬。
GIBCOBE17-160E中のトリプシン(10X)2.5%HeLa細胞(ストック溶液、希釈)を剥離します。
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩(EDTA)100938Bトリプシン作業溶液調製用のAnalaR BDH
0.5% トリプシン-EDTA、フェノールレッドなし (10X)GIBCO15400-054ケラチノサイト(ストック溶液、希釈)を剥離する試薬。
ドナーウシ血清、ニュージーランド原産地GIBCO16030-074マウス3T3-J2細胞培養用血清(フィーダー層)。
ハムs F12 培地GIBCO21765ケラチノサイト用培地。
HeLa細胞培養培地用シ胎児血清ロンザDE14-801F
ウシ胎児血清、認定、オーストラリア原産GIBCO10099-141ヒト初代ケラチノサイト培養培地用血清。
ウシ膵臓由来インスリンSigma-AldrichI5500ケラチノサイト成長用試薬。
アデニンVWR1152-25ケラチノサイト成長用試薬。
ヒドロコルチゾンVWR3867-1ケラチノサイト成長のための試薬。
コレラ菌由来のコレラ毒素Sigma-AldrichC8052ケラチノサイト増殖用試薬。
ケラチノサイト増殖のためのトリヨードチロニンSigma-AldrichT5516
ケラチノサイトの成長のための人間のEGFの南オーストラリアの生物的GF-010-9
マウスモノクローナルAPC標識抗フィーダー抗体Miltenyi Biotech130-096-099フィーダー層を標識する。
RNeasy PlusミニキットQiagen74134RNA精製キット。
SuperScript III Reverse TranscriptaseLife Technologies18080051逆転写酵素キットです。
デオキシヌクレオチドミックス、10 mM (dNTP)Sigma-AldrichD7295半定量的PCR用試薬。
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water(any)-Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR (半定量的 PCR および非
GoTaq G2ホットスタートポリメラーゼPromegaM740BTaqポリメラーゼ。
アガロース、分子生物学用Sigma-AldrichA9539アガロースゲル電気泳動用試薬。
UltraPure TBE Buffer, 10XInvitrogen15581028アガロースゲル電気泳動用試薬、ddH2Oで希釈(1X)。
臭化エチジウムSigma-AldrichE1510アガロースゲル電気泳動用試薬。
HeLa細胞およびケラチノサイトでトランスポゼース発現を誘導するドキシサイクリンSigma-AldrichD-9891
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystem4304437TaqMan Universal PCR Master Mix including Primers and probe.
15mL高透明度ポリプロピレン遠心分離チューブ、円錐底、ドームシールスクリューキャップ付き、細胞収集およびベクター希釈調製用のファルコンコーニング352096
150 mm TC処理細胞培養ディッシュ、20 mmグリッド、滅菌済みFalcon Corning353025ウイルス生産用細胞培養ディッシュ。
6ウェルクリアフラットボトムTC処理マルチウェル細胞培養プレート、蓋付き、個別包装、滅菌済みFalcon Corning353046HeLaおよびヒト初代ケラチノサイト形質導入用の細胞培養プレート。
Safe-Lock 微量遠心チューブ、容量 1.5 mLEppendorf0030 120.086希釈調製用チューブ。
Safe-Lock 微量遠心チューブ、容量 2 mLEppendorf0030 120.094希釈調製用チューブ。
フラットキャップ付き0.2ml PCRチューブ、RNase、DNase、DNAおよびPCR阻害剤フリー(任意)半定量的PCR用チューブ。
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mLApplied Biosystem434690696-well for qRT-PCR.
5mL丸底ポリスチレンチューブ、キャップなしBD Falcon352052フローサイトメトリー取得用チューブ。
使い捨て血清ピペット、ポリスチレン、個別包装、滅菌(異なる容量)(任意)-滅菌組織培養アプリケーション用のピペット。
フィルターチップ、滅菌済み、およびRNase、DNase、DNAおよびパイロジェンフリー(容量が異なります)(任意)-滅菌組織および分子生物学アプリケーション用のフィルターチップ。
pHメーター(任意)-HBS 2X pHの測定のための機器。
PCR サーマルサイクラー(任意)-半定量的PCR用の装置です。
アガロースゲル電気泳動装置(任意)-半定量PCRのアガロースゲル電気泳動のための装置。
BD FACS Canto II 2LSR 4/2BDフローサイトメーター。
7900HT 高速リアルタイムPCRシステムApplied Biosystem7900HTqRT-PCR用機器。
細胞培養アプリケーションで効率的なサンプル処理を行う卓上型遠心分離機、冷蔵、マイクロプレートバケット付き。(任意)-細胞培養処理および脊髄形成用の遠心分離機。
Optima L-90K SW32TIローターックマン・コールター-レンチウイルス粒子生産用超遠心分離機
細胞培養および分子生物学研究室用の機器(例:BSL2材料、細胞培養インキュベーター、冷蔵庫、冷凍庫(+4°C)を含む作業用に設計されたクラスII層流フード。C、-20 >C、-80 >C)、マイクロピペットおよびピペットエイド)。
研究所の規則および規制に従った保護用実験コート、手袋、フェイスプロテクション、特にレンチウイルス粒子の生成と形質導入用。
された血清はHBSS w/o Ca、Mg 試薬で試薬。スイスウ。地 試薬。試薬。活性 DNase/RNase-フリー蒸留水(任意)-試薬)薬剤滅菌チューブ。-ベを装備した超遠心分離機。

参考文献

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