分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

¹の初期の 1980年年の発見以来、プライマリ マウス BMSCs、間葉系幹細胞の in vitroモデルとして使用されます。確かに、長管骨の骨髄腔からフラッシュ プラスチック付着性細胞の培養骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、または多くの研究^2,3、で脂肪細胞に分化する能力を維持します。^4,5します。 ただし、骨髄は、BMSCs、に限定されない、造血、内皮細胞と免疫細胞を含む多くの異なる細胞集団で構成されるユニークな組織です。したがって、分離と培養の技術は、異なる同質性を持つ細胞集団をもたらすことができます。細胞からの分化の能力をテストするようなテクニックを使用して挑戦することができます。たとえば、異なる遺伝子を持つマウスから細胞を比較すると、データの解釈に制限混合セル人口から始まります。逆に、技術的に難しいことができます BMSCs の HSCs 同種個体群を取得し、代表できない場合があります前のヴィヴォモデルの。

当研究室で主に脂肪細胞、破骨細胞、骨芽細胞に分化する潜在性のため BMSCs の活用に興味を持っております。ここでは、BMSCs と HSCs の分離、osteoblastogenesis または脂肪細胞形成の in vitro評価するために使用されるカルチャのテクニックだけでなく、破骨細胞に分化する造血の文化を提案します。1 つの方法は、BMSCs と脂肪細胞形成、osteoblastogenesis、破骨細胞形成 (合計 Bmc と呼ばれる) に直接適して HSCs を含む骨髄細胞 (Bmc) の混合された人口を使用します。このメソッドは、不均一性骨髄微小環境の細胞の中で見つかった前のヴィヴォ近い表現です。別の方法は、BMSCs と (呼ばれる付着 BMSCs) HSCs の文化「純粋な」集団にしようとの付着性の非付着性のセルからを分離します。以降のメソッドを使用する細胞培養 BMSCs または HSCs のより正確な数を開始する実験し、文化に残る他の細胞の複雑な間接効果の可能性が低くなります。両方の方法は以前発行し、さまざまな研究の質問^6,7,8,9に対処するために使用します。

すべての実験手順は、機関動物ケアとメイン州医療センター研究所利用委員会によって承認されました。

1. 管の準備

1. 10% 牛胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシンの 1% 最小値必要な媒体 α (MEM α) を補うことでボーマン培地を作る。
2. 1.5 mL 遠心チューブにボーマン文化メディアの 100 μ L を配置します。3 骨は、単管はそうそれに応じて準備に通常収まります。
3. 遠心チューブ内に収まるように、200 μ L ピペット チップを十分の両端をカットします。チューブ内側のヒントを挿入し、蓋が氷の上にチューブを配置する前に閉じることができます。
   注: また、両端カットと 0.75 mL 遠心チューブ挿入できます 1.5 mL 遠心チューブに。

2. マウスの骨の収穫

1. 頚部転位続いて CO₂を使用して動物の安楽死、70% エタノール スプレー、それら。
   注: は、同じ性別、好ましくは同じ時代からの動物が使用されることを確認します。我々 は日常的に動物 7 ~ 8 週間を高齢者を使用します。良い代表で再現可能なセルの人口をもたらすための実験グループごとの少なくとも 3 の動物からの細胞のプールをお勧めします。
2. 解離性基板の裏面には、euthanized のマウスを置きます。鉗子を使用すると、腹部の皮膚のテントを作成できます。滅菌解剖はさみを使用して小さな切開 (約 1 cm) を確認します。下腹部と脚を公開するために手足のカットから足に向かって皮をむいて戻る。
   1. 足首から下の足を削除する共同をカットします。腰骨から大腿骨頭部を分離するヒップで腸骨稜に沿って裁断します。マウスはまだその裏には、2 つの腸骨骨を分離する寛骨の真ん中に切開を行います。
3. 糸くずのワイプを使用して、慎重に、大腿骨、脛骨、および腸骨骨から筋肉を取り外します。
   注: は、迅速かつ容易に (例えばキムワイプ) 糸くずワイプ クリーニング可能と腱と骨から筋肉をできるだけ切削。彼らは壊れやすい傾向があるし、その脆弱性を特定の遺伝子を増やすことができます骨を操作するときは、注意をしてください。
4. すべてのサンプルを解剖すると、一度 PBS 氷の上にそれらを置くし、無菌培養フード分離の残りの手順に移動します。
   注: 可能な限り無菌作業の文化に汚染の可能性が減ります。
5. 遠心チューブ内断面のヒントでそれらを配置する前に、骨の近位および遠位端に小さなカット (約 1 ~ 2 mm) をします。
   メモ: 骨髄は; 遠心できる十分な量を削減することを確認します。ただし、注意する必要があります避けるために骨髄空間内の近接性に基づいて切断あまり細胞集団が異なる傾向があるようです。
6. 10,000 × g で遠心する 15 の室温で s。すべての骨髄はフラッシュし、挿入 (どちらか 200 μ L ピペット チップまたは 0.75 mL 遠心チューブ) の中骨は、1.5 mL チューブの下部にペレットを確認します。すべての骨髄を収集した後は、コレクション チューブからの骨に挿入を削除します。
   注: すべての骨髄がフラッシュされる場合骨が白表示されます。ただし、特定の骨の骨髄が残っている場合切断端をやり直して、遠心分離機します。

3. 細胞懸濁液

1. 25 G 針、プルを使用してセルのペレットを上下ゆっくり群生を分割し、すべてのサンプルを組み合わせて単一の 15 mL の円錐管に。サンプルの 500 μ L あたり 10 mL BMSC 文化メディアを追加します。
2. 50 mL コニカル チューブの上に 70 μ m フィルターを置き、このフィルターを可能な限り骨片を除去するために細胞懸濁液を通過します。

4. めっきと骨髄細胞 (合計 Bmc) の混合集団の文化

注: セルは 37 ° c 5% CO₂インキュベーターで培養されます。

1. セルの数を計算して培地の 10 の⁶セル/cm² × 1.0 でそれらをプレートします。添付する細胞の混合培養の 72 時間を許可します。
   注: 培地で細胞懸濁液 20 x とトリパン青の診断を使用してセルを数える前に再度希釈を希釈することをお勧めします。7 週齢雄 C57Bl6/J マウス、我々 は日常的に⁶セルを約 50 x 10 のセル数を得られるが、年齢、性別、およびひずみ大幅細胞数に影響することができます。
   メモ: セルのミックス人口も文化の下部に添付する必要があります。
2. 72 時間後、メディアを取り出し、新鮮なメディアに置き換えます。他のすべての日と密度のチェック、メディアを変更するを続行します。セルが 80-100% の confluency に達したら、差別化のため準備ができています。
   注: 理由はこの文化が BMSCs と HSCs 混合、それ直接使用できます osteoblastogenesis、脂肪細胞形成と破骨細胞形成のため。

5. めっき BMSCs (付着 BMSCs) の分割の人口の文化

注: セルは 37 ° c 5% CO₂インキュベーターで培養されます。

1. プレート 10 cm 培養皿 (55 cm の²つの文化圏の) に大腿骨、脛骨、および 1 つのマウスの腸骨骨から収集されたすべてのセル。
   注: 2-3 c57bl/6 j マウスをプールする場合私たち通常板 150 cm²フラスコでこの '総' 骨髄人口。
2. 混合培養 48 時間後 (非付着 HSCs を含む) 文化メディアを削除します。破骨細胞形成実験を実行する場合は、非付着性のセルはさておき (セクション 7 を参照)、そうでない場合、吸引のこの集団を設定し、これらの細胞を破棄します。
3. 添付の細胞を邪魔しないよう慎重に PBS のプレート/フラスコを洗います。
4. PBS を取り外し、0.25% トリプシンを追加し、細胞懸濁液をセルのメディアを追加することによって 1-3 分、トリプシンの抑制の 37 ° C で培養細胞を取り出します。この時点で、BMSCs が解除される、ことができます (以前にやった手順 4.1) としてカウントし将来実験用メッキします。
5. めっきに必要なセルの数を計算します。室温で 5 分間 1,000 x g で細胞を懸濁液の必要量を遠心します。
   注: セル通常めっきエンドポイント実験に基づいています。たとえば、タンパク質・ RNA を分離する場合より高い密度 (~1.0-2.0 x 10⁶細胞/ウェルで 6 ウェル プレート) で私たちをプレートと通常。
6. メディアを取り出し、めっきに必要な培地量で細胞ペレットを再懸濁します。実験によると培地で細胞をプレートし、数日間アタッチすることを許可します。BMSCs の confluency に到達、分化を実行に進みます。

6. BMSCs の分化

1. 骨芽細胞
   1. 骨芽細胞分化メディア 1 M β-グリセリンの 800 μ L を追加することによってリン酸 PBS で 200 μ L の PBS で 0.5 M アスコルビン酸 99 mL BMSC 文化メディア (手順 1.1 BMSC 培地の組成を参照してください)。
      1. BMSCs 文化 (4.3 のステップから合計 Bmc) または付着 BMSCs ステップ 5.6 から合流されたら、骨芽細胞によって区別骨芽細胞分化メディア文化メディアの切り替え。
   2. 一日おき分化メディアを交換します。セルは、無機の白色結節を生産開始します。肉眼で、井戸の底にそれらを可視化します。このプロセスは、3 週間に数日以内に発生します。
      1. Osteoblastogenesis を評価するためにアルカリホスファターゼ染色および/またはコッサ染色セクション 8 で前述の井戸でを実行します。
         注: セル単一層の混乱を避けるためにわずかな角度でプレートを傾けることによって慎重に、メディアを変更します。
2. 脂肪細胞
   1. ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 高グルコース、牛胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシンの 1 mL、100 μ L の 20 mM ロシグリタゾンと 2 mM インシュリンの 100 μ L の 10 mL の 90 mL を一緒に混合することによって脂肪細胞の基本メディアを作る。必要な場合は、分化実験中に週の 4 ° C でこのメディアを格納します。
   2. 62.5 mM 3-イソブチル-1 - メチルキサンチン (IBMX) 200 μ L を追加することによって脂肪細胞誘導メディアを作ると脂肪細胞ベース メディア 25 mL に 1 mm デキサメタゾン 25 μ L。
   3. BMSCs 文化 (4.3 のステップから合計 Bmc) または付着 BMSCs ステップ 5.6 から合流されたら、脂肪細胞誘導メディアにメディアを変更します。この日 0 分化を検討してください。
   4. 48 時間後に、メディアを取り出し、脂肪細胞誘導メディアと文化を更新します。
   5. 4 日目の脂肪細胞基本メディアに切り替えます。
      注: 脂質 2 日か 4 日早ければ掲載が開始します。
   6. 7 日、セルが最大脂肪滴蓄積し、成熟した脂肪細胞に類似した表現型を表示を確認します。細胞の死/剥離可能性があります、このポイントを過ぎて文化はないです。

7. HSCs の破骨細胞への分化

1. 25 μ g/mL の受容体活性化の NFKB リガンド (RANKL)、大食細胞のコロニー刺激的な要因 (mCSF) の 25 μ g/mL の 15 μ L の 50 μ L を 25 mL BMSC 文化メディアに追加することで破骨細胞分化のメディアを作る。
2. いったん井戸に (手順 4.3) から合計 Bmc または (ステップ 5.2) から非付着性のセルを追加すると、文化メディアは破骨細胞分化メディアに切り替えることができます。一日おきの分化メディアを補充します。
3. 10 倍の倍率の顕微鏡で毎日破骨細胞文化を観察します。破骨細胞が融合し、分化の 5-7 日目の周りに通常の多核巨細胞の細胞を形成を観察します。

8. 染色

1. 骨芽細胞
   注: アルカリ性ホスファターゼ (AP) 染色、私たちはしばしば用 AP 染色キット (材料の表を参照してください) のガイドラインに従って。
   1. AP 染色キット製造元のガイドラインを実行します。
      1. メディアを吸引し、PBS のセルをすすいでください。4% のセルを修復するパラホルムアルデヒド (PFA) 室温で 12 分 PBS。
      2. 一方で、ap を 500 μ L を追加することによってキットを染色試薬を使用して AP ソリューションを作る 500 μ L FRV アルカリ溶液と軽く; 混合する亜硝酸ナトリウム放置 2分追加 22.5 mL dH₂O および 500 μ L ナフトール AS BI アルカリ。優しく混ぜます。
         注意: PFA は毒性があり注意して処理する必要があります。
      3. セルが修正されると、PBS で洗い、AP ソリューションを各ウェル (ウェルあたり 1 ~ 2 mL) に追加します。アルミ箔と光から保護部屋の温度で 30 分間させて汚れをカバーします。ソリューションを吸引、蒸留水で洗うし、乾燥するプレートを許可します。
   2. ステンド グラスの植民地アルカリ性フォスファターゼ陽性細胞を観察するためにカメラを使用しての画像を取得します。
   3. また代わりにアルカリホスファターゼ染色コッサを実行します。このため、硝酸銀.に任意の残りの PBS を沈殿させるように蒸留水で十分に井戸を洗う
      1. 4% のセルを修復する室温で 12 分 PBS で PFA。井戸をカバーし、室温で 1 時間強い光に露出する十分な 5% 硝酸銀溶液を追加します。
   4. 銀製硝酸塩の解決を削除し、蒸留水の各ウェルを洗浄します。セルに 5% チオ硫酸ナトリウム溶液を追加し、3 分間放置します。
   5. チオ硫酸ナトリウムを吸引し、蒸留水で洗ってください。プレート乾燥し、鉱床で肉眼で見えるダークブラウン/ブラックに染色の観察をしましょう。
2. 脂肪細胞
   1. オイル赤 O (オロ) の染色、10% を使用してセルを修復する中性緩衝ホルマリン室温で 1 時間。
   2. 一方で、0.035 g イソプロパノール 10 mL に溶解オロ在庫ソリューションを作る。これで 6 ウェル プレートで十分です。ミックスし、1 つのフィルター紙 (細孔サイズ 11 μ m) を使用して、ソリューションを渡します。
   3. 6 mL の蒸留水とオロ原液の 9 mL を希釈してオロ作業ソリューションを作る。使用する準備ができるまで、ロッカーにソリューションを残します。
   4. 蒸留水で 60% イソプロパノールを準備 (それぞれをカバーするために十分なことも)。
   5. セルは固定で後は、蒸留水と一度で定着性と洗浄を削除します。1 分 60% イソプロパノール溶液と水を交換してください。
      注: は、プレートを転倒しながらゆっくりと液体を追加します。脂肪細胞を非常に簡単に取り除きます。
   6. イソプロパノールを削除し、すべてのセルをカバーする十分なオロ作業ソリューションを追加します。低速ロッカー室温で 15 分間インキュベートします。オロを外し、蒸留水で 2 回洗います。
      注: この時点で、オロ ステンド脂質液滴視覚化できます顕微鏡下で。
   7. オロを定量化するには、各ウェルに 100% イソプロパノールの 1 mL を追加し、10 分間ゆっくりと揺動によって、オロをすすぐ。
   8. 一方で、オロ作業ソリューションを使用して以下の 8 規格に基づく標準曲線を作成する希釈系列を準備 (2,100 μ g/mL) および希釈剤としてイソプロパノール: 500、350、300、250、150、100、75、および 0 μ g/mL。
   9. 200 μ L 基準と皿の上をトリプリケートで destained のサンプルをロードし、490 で吸光度を読み nm。
      1. オロの基準曲線に基づいた各サンプルの濃度を決定します。
         注: セル番号に濃度オロの正規化をお勧めします。細胞数は、クリスタル バイオレット染色または DNA の量によって定量化することができます。
3. 破骨細胞
   注: 準備ができたら、酒石酸耐性酸フォスファターゼ (TRAP) トラップの染色を使用してキット (材料の表を参照) を破骨細胞を染色をお勧めします。
   1. TRAP 染色、PBS で 2.5% グルタルアルデヒドで室温で 30 分間セルを修正します。一方で、一緒に高速ガーネット ベース ソリューションの 50 μ L、亜硝酸ナトリウム、蒸留水の 4.55 ミリリットル、Napthol AS Biphosphate、酢酸溶液 200 μ L、100 μ L 酒石酸ソリューションの 50 μ L の 50 μ L を混合することによってトラップ ソリューションを作る。
   2. 定着剤を離れて吸い出しなさい、37 ° C で 1 時間トラップ ソリューションを追加する前に 2 回 PBS のセルをすすいでください。
   3. 顕微鏡 (倍率 10 X) 破骨細胞をカウントする前に蒸留水で洗います。トラップ⁺セルは 3 つ以上の核を持つ紫色の表示されます。

細胞培養の概要
2 つのカルチャの技術は、BMSCs と造血 (合計 Bmc、図 1 a) から成る Bmc の混合された人口または人口 BMSCs の分化の評価は HSCs (付着 BMSCs、図 1 b) から分割を許可します。骨の髄からセルを分離して (図 1) をメッキ後の 48 時間は、彼らは急速にプラスチック培養プレートの下部に接続し、単分子層を形成する傾向があります。セルが合流 (図 1) に達すればは、分化アッセイに使用できます。

BMSCs 骨芽細胞に分化
BMSCs の合流の文化は、アスコルビン酸とグリセロール β リン酸 (図 2 aB) から成る骨メディアを使用して骨芽細胞に区別できます。分化の数日後は、骨芽細胞は、アルカリホスファターゼ (図 2) を表現するを開始します。類骨マトリックス生産と最終的にこの行列 (図 2 D) のさらなる分化をトリガーします。興味深いことに、セルの割合だけが骨芽細胞の体外に分化します。確かに、すべてのセルがアルカリ性ホスファターゼを表現またはプレートを石化染色クリスタル バイオレット (図 2 e) 明らかにします。

BMSCs 脂肪細胞に分化
混合 Bmc の文化だけでなくより均一な細胞集団、脂肪細胞形成をテストできます。混合集団 (図 3 a) または分割個体群 (図 3 b) を使用するかどうかを骨芽細胞への分化を観察、脂肪細胞は、細胞の割合だけ。脂肪細胞はオロ (図 3) と赤で汚すことができる複数の脂質液胞で丸く表示されます。我々 の経験で培養脂肪細胞は常に多胞体内白色脂肪細胞とは異なり表示されます。遺伝子や培養条件の違いは脂肪細胞が分離培養プレートに浮かぶポイントに脂肪細胞形成を増加します。この問題を解決するには、以前の時点で脂肪細胞形成実験を停止できます。

破骨細胞に分化する造血
MCSF と RANKL とメディアを補うことで、文化の破骨細胞形成を誘起することができます。HSCs はステインの罠」(図 4 a) 肯定的な多核巨細胞の細胞を形成する急速にヒューズを開始します。これらの破骨細胞の in vitroのミネラル マトリックス吸収できる、したがって、破骨細胞の活動 (図 4 b).を評価するために使用できます。

図 1:概略年表 BMSCs と HSCs の文化のためのプロトコル。合計 Bmc を生成する異なる培養技術は、細胞 (A) または (B) 付着 BMSCs の混合された人口で構成されます。HSCs (D) から分割された前後のメッキ (C) 後 48 hr C57B6/J マウスから隔離された BMSCs 文化の代表的なイメージ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: BMSCs 文化の井戸の画像が骨芽細胞に分化します。BMSCs 前 (A) に、と (B) は、骨形成系メディアに置かれています。(C) ピンクのアルカリホスファターゼ発現およびブラウン (D) における金属鉱床は、骨芽細胞を汚すことができます。クリスタル バイオレットは、(E) の分化した細胞数を表すために使用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3:BMSCs の文化の代表的なイメージは、脂肪細胞に分化します。オロ ステンド脂肪細胞脂肪細胞メディアで 7 日後 BMSCs (A) と (B) 分割文化の混合された人口から得られます。脂肪細胞のイメージは、オロ (C) で染色。(D) 前に、脂肪細胞メディアで 7 日後に、クリスタル バイオレット吸光度 (E) 正規化後オロの定量化。データは、平均値の標準誤差を表す誤差範囲の手段として掲載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4:HSCs 文化が破骨細胞に分化します。大きなパープル ピンク多核巨細胞細胞 (A) として表示される破骨細胞の染色をトラップします。無機表面は破骨細胞 (B) の 7 日間後の HSCs の区別によって残された吸収ピットでコッサが黒で染色。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

著者は、興味の金融紛争があるないことを開示します。