方法論記事

AAV 滴定とそのアデノ随伴ウイルスのアセンブリ活性化機能の評価のための定量的ドットしみ試金蛋白質

DOI：

10.3791/56766

⸱

2018年6月12日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アデノ随伴ウイルス (AAV) 抗体とアセンブリ活性化の役割を研究する応用を定量化するための簡単なドット プロット法の詳細を本稿では蛋白質 (薬学会合同)、すべて AAV が見つかりましたウイルスの非構造タンパク質の新規クラス血清型、同種および異種 AAV の血清型に由来するカプシドのアセンブリを促進します。

要約

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アデノ随伴ウイルス (aav ベクター) は遺伝子療法のための魅力的なベクトルとして広く受け入れられて、それはまた、ウイルスの生物学を理解するためのモデル ウイルスとして提供しています。後者の点でアセンブリ活性化タンパク質 (AAP) と呼ばれる非構造 AAV 蛋白質の最近の発見はキャプシドにウイルス キャプシド VP のアセンブリにかかわるプロセスに新たな光を当てます。我々 が最近報告している多くの AAV の血清型には、アセンブリの AAP が必要ですが、その AAV4、5、11 がこの規則の例外を。さらに、薬学会合同と異なる血清型の組み立てのカプシドを別の細胞内コンパートメントにローカライズすることを示した。生物学的特性と異なる AAV 間薬学会合同の機能的役割で予期しないこの不均一性アンダー スコア薬学会合同研究の重要性は多様な血清型に由来の血清型します。この原稿は、AAV の定量とその応用キャプシド アセンブリの AAP 依存性と血清型特異性を評価するために簡単なドット プロット法を詳しく説明します。このドット プロット法の有用性を示すためには、カプシド アセンブリおよび AAP 蛇 AAV, 以前メタボライト爬虫類 AAV と同様、AAV5 および AAV9、AAP 自立・ AAP 依存以前示されている依存性を特徴付けるに着手しました血清型、それぞれ。アッセイでは、蛇 AAV キャプシド アセンブリ蛇 AAP を必要とし、AAV5 と AAV9 から薬学会合同によって昇格できませんを明らかにしました。試金はまた、一般的な血清型異種キャプシド アセンブリを促進する相互補完によって薬学会合同の多くとは異なり蛇 AAP を促進しない AAV9 カプシドのアセンブリを示した。ヌクレアーゼの選択に大きく影響するドット プロット法の読み出し、したがって、最適な酵素を選択することは、AAV 価の成功評価のため重要です。 さらに、示します。

概要

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アデノ随伴ウイルス (AAV) は、約 4.7 kilobases (kb) のゲノムと小さく、非エンベロープ、一本鎖 DNA ウイルスです。AAV のゲノムには、担当者とキャップの遺伝子のオープンリーディング フレーム (Orf) が含まれています。2010 年、AAV2キャップ遺伝子内の +1 フレーム シフト ORF がエンコードされた未知の非構造蛋白だったゾンタークらによって発見され、ウイルス AAV2 VP 単量体蛋白質のアセンブリで重要な役割を果たすことが判明カプシド1。この蛋白質はキャプシド アセンブリ1の推進における役割後アセンブリ活性化タンパク質 (AAP) を選ばれました。

AAP の ORFs 属Dependoparvovirus、内がパルボ ウイルス家族1,2の別属のウイルスのゲノム内にないすべてのパルボ ウイルスのゲノムの特定の bioinformatically をされています。この蛋白質の機能調査された最初 AAP AAV2 のプロトタイプから (AAP2)、集積の形成に核小体に組み立ての VP 蛋白質を完全にターゲットに AAP2 の重要な役割を確立しているに焦点を当ててください。カプシド1,3、4を組み立てください。AAV2 カプシドの AAP 式の不在でアセンブルすることができないが個別にされている我々 を含む複数のグループによる1,2,3,4,5 を確認.AAV 血清型 1、8、および 9 の後の研究に裏付け薬学会合同の AAV1、8 の VP3 単量体蛋白質とキャプシド アセンブリ内の重要な役割と 9 は AAP2の共発現の不在で完全に組み立てられた構造を形成することができませんでした。

最近では、定量的なドットの使用を含むアプローチを試金のしみ、AAP の発現の有無と AAP1 の能力で縁どら VP3 モノマーからのアセンブリを促進するために 12 をアセンブルする 12 VP3 モノマーに AAV1 の機能を調べた異種血清型。本研究は明らかにその AAV4、5 と 11 の VP3 モノマーが AAP なく組み立てることができます。さらに、調べた 12 の AAP の血清型のうち 8 つがわかっただった (すなわち、すべてが AAP4、5、11、および 12) AAP4、5、11、12 を表示中、異種の AAV 血清型カプシドのキャプシド アセンブリをサポートする広範な権限を表示、大幅にこの点6の限られた能力。これらの 4 つの血清型が系統他 AAP 血清型2,の3から遠いです。また、研究では異なる薬学会合同6の細胞レベル下のローカリゼーションの重要な不均一性が明らかになった。さらに、研究は、組み立てられたカプシドと核小体、AAV2 キャプシド アセンブリの特徴 AAP の緊密な関連を AAV5 を含む他の血清型に拡張して必ずしもできないことを示唆している 8、および 9 は、核小体の排除を表示組み立てカプシド6。したがって、任意の特定の血清型 AAP の研究から得られる情報はすべて AAP 生物に広く適用できません。AAP の生物学のような不可解な性質は、正規と非正規の AAV 血清型から各 AAP の機能と役割を調査する必要性を強調します。

人間の萌芽期の腎臓 (HEK) で AAV のウイルスの粒子の完全パッケージ化抗体生産 293 細胞 AAV のベクトル生産、AAP の蛋白質の有無の最も一般的に使用されるセル行の決定によって評価されるキャプシド アセンブリの AAP の生物学的役割式です。AAV を定量化するための標準的な方法は量的な PCR (qPCR)-基づいた試金7,8としみに基づく定量的ドット9を試金します。酵素免疫アッセイ10,11など光学密度計測12 AAV ウイルス粒子の定量のための他の方法は、多くの異なる AAV の血清型に由来サンプルまたはサンプル不純物 (粗野な lysates または文化メディア)、AAV の研究に使用されるサンプルが多いと汚染されます。現在、qPCR 最も広く AAV 定量; の使用します。ただし、システム エラーや大きな価変動13,14qPCR ベース試金の試金としての潜在的な注意事項が発生を確認する必要があります。PCR に基づく試金は潜在的交絡増幅13を阻害する PCR テンプレートで共有閉じたターミナル ヘアピンの存在などの要因の数の影響を受けます。経験豊富な人であっても潜在的な紹介 qPCR ベースに交絡要因を無意識のうちに13試金。対照的に、定量的なドットのしみアッセイ、ゲノム増幅を必要としない、qPCR に基づく試金と比較してエラーの最小限のリスクで多くの単純な原理を使用して古典的な分子生物学手法です。このメソッドは技術的に困難な; 以下したがって、アッセイ結果が合理的に経験の浅い個人によっても再現可能です。

本報告では、AAV ベクターを定量化するために使用、(AAV5 と AAV9) の血清型共通の薬学会合同のアセンブリ促進の役割を勉強するアッセイを適用する方法と例を提供しています定期的に定量的なドットのしみの試金の方法論の詳細について述べる以前メタボライト AAP 蛇 AAV14から。自然の中で AAV VP 蛋白質および AAP 蛋白質は単一の遺伝子 (すなわち、VP AAP cis 補完) 中でここで説明アッセイから cis で表されます、VP、AAP の蛋白質は 2 つの独立したプラスミド (すなわち、VP AAP からトランスで指定されました。トランス-補完)。それぞれ異なる血清型から各 VP または AAP 蛋白質は、それぞれ独立したプラスミドから表現できる、キャプシド アセンブリ (つまり、VP AAP クロス補完) の異種の VP AAP の組み合わせをテストすることが可能になります。簡単に言えば、様々 な血清型から AAV VP3 は同種の血清型 AAP、または異種血清型 AAP の存在の有無で、AAV ベクター ゲノムをパッケージ化するプラスミド DNA トランスフェクションによって HEK 293 細胞で表されます。次の生産、文化メディアとセル lysates はキャプシド シェル内でウイルスのゲノムを定量化するドット プロット法にさらされます。点のしみの分析の最初の手順は、サンプルの汚染のプラスミド Dna とアンパックの AAV のゲノムを削除するヌクレアーゼとサンプルを扱うことです。そう失敗は unpurified サンプル試金されるとき、背景信号を特に増加させます。ウイルスのカプシドを破るし、サンプル ソリューションにヌクレアーゼ耐性ウイルスのゲノムを解放するプロテアーゼ処理によるこれは後します。次に、ウイルスのゲノムは、変性、膜の quantitation のためウイルス ゲノム特定 DNA プローブとハイブリダイズします。蛇 AAV VP3 がキャプシド アセンブリの蛇 AAP を必要とし、ヘビ AAP が薬学会合同総会を促進することも AAP 依存型の血清型に由来の多くとは異なり AAV9 カプシドのアセンブリを促進しないことを示すここで報告例の分析で異種血清型カプシド。最後に、我々 は qPCR に重要な注意点を報告またはドットのしみベース AAV 定量アッセイ ヌクレアーゼの選択は、分析結果に対して大きな影響を及ぼすこと。

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プロトコル

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注: ソリューションおよびこのプロトコルに必要なバッファーのためのレシピは、表 1に提供されます。下記プロトコルはキャプシド アセンブリの AAP 蛋白質の役割を検討する VP AAP クロス補完ドットしみ試金のためです。精製 AAV ベクターの滴定のためより一般的な定量的ドットしみアッセイ法は、代表結果セクションで説明します。

1. VP3、AAP、プラスミドを表現する AAV2 担当者の建設

  1. PCMV-AAVx-VP3 (x = 血清型) の建設
    1. 忠実度の高い DNA ポリメラーゼと次のプライマーを使用して全体の VP3 ORF (1.6 kb) を PCR 増幅: VP3 前方、CTAA RE1 CACC N25 (VP3 ORF の最初の 25 のヌクレオチド);VP3 リバース、TCTT RE2 N25 (VP3 ORF の最後の 25 のヌクレオチド)。
      注: RE1 と RE2 は、制限酵素 (解像度) のクローニングのためのサイトです。CTAA と TCTT は、ターミナル 5' と 3' tetranucleotides 制限の酵素消化を容易にする追加二本鎖 DNA の終わりの近きます。CACC が、コザック配列です。
    2. 高度な式にヒトサイトメガロすぐに初期 (CMV IE) エンハンサー-プロモーターを使用します哺乳類発現ベクターのサイト再対応する間 RE-digested PCR の製品をクローンします。
      注: 分子クローニングのため最適な温度で 1 時間 4 U/μ g の DNA の濃度で restriction enzyme(s) とバックボーン プラスミド DNA の 5 μ g を消化します。PCR のフラグメントの単位長さあたりの制限酵素認識部位数の増加による酵素使用時 (例えば、1.6 kb VP3 ORF PCR の製品の 10 U/μ g) と (例えば、4 h) に長いインキュベーション時間の単位を増加します。分子生物学酵素および細菌変換を含むクローニング プロシージャの有用な情報は15,16,17他の場所で見つけることができます。
  2. PCMV-フラグ-AAPx (x = 血清型) の建設
    1. 忠実度の高い DNA ポリメラーゼと次のプライマーを使用して最初のアミノ酸を除く全体の AAP ORF (0.6 kb) を PCR 増幅: AAP 前方、CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (4 塩基から 25 のヌクレオチド、AAP ORF);AAP リバース、TCTT RE2 N25 (AAP ORF の最後の 25 のヌクレオチド)。
      注: GACTACAAGGACGACGATGACAAA コード フラグの札、有害な影響の4、5がないように示されているが、不要な場合は省略することができます。
    2. CMV IE エンハンサー プロモーター15,16,17哺乳類発現ベクターの対応するサイト間 RE-digested PCR の製品をクローンします。
  3. PHLP 担当者の建設
    1. Xho の 20 台 pAAV RC2 プラスミド (7.3 kb) のダイジェスト 5 μ g 私と Xcm、商業 DNA 精製キットを使用して DNA を浄化し、フェノール-クロロホルム抽出法。
      注: 1.8 kb Xho 私-Xcm Rep 蛋白質の表現を維持しながらキャプシド VP 蛋白質の表現の損失で 7.3 kb pAAV RC2 プラスミドの結果から私の断片を取り除く。
    2. 鈍 DNA は、6 台の T4 DNA ポリメラーゼの終了、アガロース 5.5 kb DNA 断片をゲルの浄化し 50 に 100 を使用して浄化されたフラグメントを縛る自己 DNA および製造元の勧告15によると T4 DNA リガーゼの 400 台の ng。
    3. 1.1.2 の手順で参照される標準細菌変換手順メモ。
  4. 制限の酵素の消化力およびシーケンス15,18によってプラスミッドを構築を確認します。
  5. プラスミド minipreps または下流の AAV 生産実験のプラスミド DNA の十分な量を取得する市販のキットを使用して maxipreps を実行します。

2 プラスミド DNA トランスフェクション (クロス否定回路試金) によって細胞 HEK 293 の AAV の生産

  1. HEK 293 細胞ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) での培養-ペニシリンとストレプトマイシン ミックス、高グルコース (4.5 g/L) が 10% 牛胎児血清 (FBS)、1% を添加した 1 mm L-グルタミン 5% 二酸化炭素 (CO2) 37 ° C の定温器。
    注: AAV 価は大幅 HEK 293 の細胞のソースによって異なります。
    注意: は、バイオ セーフティ レベル 1 (BSL1) 封じ込めで AAV を処理できますが、BSL2 封じ込めは HEK 293 細胞ワークでお勧めです。
  2. 日-1 (トランスフェクション前 24 h)、プレート 6-7 105 HEK 293 細胞/ウェル 2 ml x 6 ウェル プレートで手順 2.1 で説明した完全な媒体の。これは一般的に、次の日 〜 90% の confluency を実現します。
  3. 0 日目: トランスフェクション
    1. DNA トランスフェクションの準備
      1. セル ~ 90% の confluency に達していることを確認します。
      2. ウォーム アップ 10% ではなく 1% ペニシリンとストレプトマイシン ミックス 1 mM L グルタミンを DMEM (すなわち、無血清培地) を短期国債、37 ° C の水浴中。
      3. 部屋の温度に到達するポリエチレンイミン (PEI) ソリューションを許可します。
    2. プラスミド DNA の混合物の調製
      1. 表 2に示されているように、CaCl2または MgCl2滅菌 1.5 mL 容マイクロ チューブでなくリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 96 μ L でプラスミドをミックスします。DNA 量が 2 μ g/ウェルです。
        注: 場合は、公称プラスミド DNA の解決のボリュームが無視できます。音量調整をお勧めプラスミド DNA ソリューションの総量が ≥10 μ L の場合。
    3. PEI トランスフェクション
      1. PEI ソリューション (1 mg/mL) の 4 μ L を (上記のように準備) PBS プラスミッド DNA のミックスに追加します。最終巻は、約 100 μ L (培地の容積 5%) です。渦管を簡単にし、室温で 15 分間 DNA: PEI 混合物を孵化させなさい。
      2. 15 分インキュベーションを完了するを待っている間手順 2.3.1.2 prewarmed 無血清培地で培養液を置き換えます。
      3. DNA の 15 分インキュベーション一度: PEI 混合が完了すると、簡単にスピン チューブの下に液体を収集するために遠心機のチューブと HEK 293 培養プレートの各ウェルに培養液を滴下し DNA: PEI の混合物を追加。優しくプレートを扇動し、5% CO2と 37 ° C の定温器に戻ります。
      4. 日 5 (中型の変更は不要です) で収穫までこのトランスフェクション培地で細胞を維持します。
  4. 1 日目と2 日目、トランスフェクション効率を評価するために倒立蛍光顕微鏡下で pCMV GFP プラスミドをトランスフェクトした細胞を観察します。
    注: ここでは、10 X 蛍光顕微鏡の/10 × アイピースとの組み合わせで 0.25 開口目的が使用されたと 450-490 nm 励起帯域通過フィルターと 515-565 nm バンドパス排出フィルターが採用されました。上記の条件は通常以上の 70% のトランスフェクション効率を得られます。細胞は無血清条件による形態学的変化 (例えば細胞がスリムになっている) を示すことがあります。
  5. 日 3-5、5% CO2と 37 ° C の定温器でトランスフェクション細胞の培養に進みます。
  6. 日 5細胞とウイルス含有培地 15 mL ポリプロピレン製の円錐管に上下ピペッティングによる、または収集細胞スクレーパーでこする。
  7. 使用するまで-80 ° c のサンプルを格納します。

3 AAV 定量のドット プロット法

  1. ウイルス粒子の回収
    1. すぐに 37 ° C の水浴中凍結チューブを解凍します。渦セルから AAV の回復を最大限に 1 分は積極的にチューブ。
    2. 10 分の 4 ° C で 3,700 × g で遠心分離によって細胞の残骸をペレットします。各チューブから上清 200 μ L を取るし、ドット プロット法のスクリュー キャップとラベルの付いた微量遠心チューブにそれを転送します。
      注: 因数遠心に残りの上清は管し、将来使用するため-80 ° C で凍結保存します。ここでは、スクリュー キャップ付けポリプロピレン マイクロ遠心チューブ用と o リングが使用されました。タイトなシールが AAV とフェノール クロロホルムの流出を防ぐために必要です。
  2. セラチアエンドヌクレアーゼによる治療
    1. ミックス A とミックス B 試薬 (表 3) を準備します。ミックス A の 10 μ L と各チューブにミックス B の 10 μ L を追加します。渦管 5 s、簡単にスピン チューブの底に液体を収集し、37 ° C でチューブを少なくとも 1 時間インキュベートするチューブ。
      注: ミックスは水酸化ナトリウムが含まれています、 s. の marcescensエンドヌクレアーゼによる治療のための pH を最適化します。ミックス B マグネシウムをサプリメントします。市販酵素株のs. の marcescensエンドヌクレアーゼの濃度が異なる場合があります。S. marcescensエンドヌクレアーゼのボリュームは、3.2.1 の手順でチューブにミックス、ミックス B を追加した後 200 U/mL に調整する必要があります。
      注: 長いインキュベーション時間を 4 時間に減らすことができますバック グラウンド信号。
    2. 孵化の最後に、トップ チューブの側面から結露・ ソリューションを収集するベンチトップ遠心チューブ簡単にスピンします。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは、-20 ° C または-80 ° C で凍結保存できます。
  3. プロティナーゼ K の治療
    1. ミックス C 試薬 (表 3) を準備します。各チューブにミックス c 180 μ L を追加します。渦 5 管 s、簡単にチューブをスピンし、1 h 55 ° C でチューブを孵化させなさい。
      注: ミックス C 試薬で EDTA 自由なマグネシウム イオンをキレート、 s. の marcescensエンドヌクレアーゼを不活性化します。
    2. 孵化の終わりには、室内温度に達するまでサンプルを許可して簡単にスピン チューブ トップとチューブの側面から結露・ ソリューションを収集するベンチトップ遠心分離機。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは、-20 ° C または-80 ° C で凍結保存できます。プロトコルを再開、完全にバッファーに格納されている SDS の結晶を溶解する 5 〜 10 分のための 55 の ° C でチューブをインキュベートします。
  4. フェノール-クロロホルム抽出とエタノール沈殿
    1. サンプルと 1 分のためにそれらは ≥16、室温で ≥5 分 100 × g で遠心機でサンプルをスピン渦にフェノール クロロホルム 200 μ L を追加します。
      注意: フェノール クロロホルムは適切な個人用保護具 (PPE; の化学発煙のフード処理必要があります。すなわち、ニトリル手袋、ゴーグル、フェイスシールドや長袖の白衣)。
    2. 水層 (P200 ピペットで 2 回 160 μ L) の 320 μ L を新しい標準遠心チューブ (水溶液の液量の 80%) に転送します。
      注: 水溶液サンプル間の同じ量を取ることが重要です、それ以外の場合アッセイが量的な正確さを失います。
    3. ミックス D 試薬 (表 3) を準備します。各チューブにミックス D の 833 μ L を追加します。渦管 5 s、≥20 分-80 ° c チューブを孵化させなさいと。
      注: ミックス D、エタノール、酢酸ナトリウムと DNA の便利なエタノールの沈殿物のためにグリコーゲンの混合物です。サンプルは、この手順で-80 ° C で保存できます、プロトコルを後で再開することができます。
    4. ≥16 で遠心機、4 ° c で ≥15 分間 100 × g で遠心分離機サンプルは上澄みを離れて注ぎ、一度きれいなペーパー タオルの上にしみ。70% のエタノールの約 500 μ L を入れ各チューブ渦 5 s、および遠心分離用管 ≥16、≥5 分の 4 ° C で 100 x g でベンチトップ遠心機チューブ。
    5. 一度きれいなペーパー タオルの上にしみし、上澄みを離れて注ぐ。65 ° C で乾燥ペレットペレットを完全に乾燥することができます。
      注: は、チューブをしみが付くことの後に残っている余分なエタノールを削除するのにピペットを使用しないでください。ペレットは、一晩にも室温で乾燥することができます。ここで一時停止できるプロトコルと乾燥 DNA ペレット格納できる室温で数日間管蓋を閉めた状態します。
  5. TE バッファーでウイルスの DNA の再懸濁
    1. TE バッファーの 120 μ の DNA ペレットを室温で 1 時間に 30 分の各チューブを揺することによって溶解します。
  6. ドットのしみ
    1. プラスミド DNA の基準の作成
      1. 水またはトリス塩酸バッファー (10 mM、pH 8.0) に 10 ng/μ L に AAV ベクター ゲノム プラスミド DNA を希釈します。この希釈の 1 h 50 μ L の反応量にプラスミド DNA をリニア化するための適切な制限の酵素のダイジェスト 25 μ L を取る。
        注: 我々 は消化の重複セットを作る (3.6.4.1 の手順を参照してください)。適切な酵素は、ドットのしみプローブ結合領域外プラスミド DNA を切る 1 つをする必要があります。便宜上、希釈したプラスミド DNA 検体 (25 μ L/チューブ) をすることができます、保存将来の使用のための-20 ° C で凍結します。チューブ ステップ 3.5.1 で揺れている間は、プラスミド DNA を消化します。プラスミド DNA 標準以上消化しません。
      2. 消化プラスミッド DNA の標準を含んでいる管に水または TE の 450 μ L を追加し、徹底的に混ぜます。この混合物の 70 μ L を水や希釈プラスミド標準 (25 pg/μ L) に TE の 1,330 μ L で新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送します。
      3. 表 4 2 倍連続希釈 (600 μ L/チューブ) のセットを作成するに従ってください。5 のボルテックスによって希釈を徹底的にミックス s。
    2. 標準およびウイルスの DNA サンプルの変性
      1. 各標準希釈にアルカリ溶液 x 2 の 600 μ L を追加します。5 に 10 s. 加温 10 分の室温でのボルテックスでよく混ぜます。
      2. アルカリ溶液 x 2 の 120 μ L を各ウイルスの DNA サンプルに追加します。5 に 10 s. 加温 10 分の室温でのボルテックスでよく混ぜます。
    3. 点のしみの装置のセットアップ
      1. はさみを使用して、サンプルおよび標準の数の適切なサイズを (例えば、ゼータ プローブ) しみの膜をカットします。ドットのしみ装置にそれを置く前に 10 分のための水の膜を浸漬します。膜装置の未使用の井戸をカバーします。
        注: は、清潔なピンセットで膜を処理します。空井戸をカバーするには、膜に付属している光の青い保護シートを使用できます。サンプルおよび標準のバインド前に乾燥膜ができないようにします。アセンブリおよび装置の使用の詳細については、ユーザー マニュアルの19を参照してください。
      2. サンプルが読み込まれる井戸に水を追加します。真空とプル エラーのチェックし、修正を再テストする井戸水を適用します。再密封を確保するために真空を適用しながらネジを締めます。
        メモ: 不完全なシール井戸間サンプル漏れを原因します。
      3. 水は完全に引っ張られる、一度完全に真空を解放 (すなわち、真空マニホールドに開放する空気圧)。
    4. 標準およびドットしみ装置にサンプルの読み込み
      1. 各希釈プラスミド DNA 標準の 400 μ L を各ウェルに適用し、標準的な希薄の 4 車線を実行します。標準のダイジェストの 2 つの別々 の因数を使用し、各複製をロードします。各ウイルスの DNA サンプルの 200 μ L/ウェルを適用します。
        注: 変性サンプルの残りの ~ 40 μ L を使用して、希釈サンプルを作成 (例えば、10 倍希釈サンプル サンプルの 20 μ L プラス アルカリ溶液 x 1 の 180 μ L を使用して) し、に応じてを消されました。
      2. 井戸を介して DNA ソリューションをプルする穏やかな真空を適用します。
        注: 真空圧力真空圧はドット、部分的に三方弁の開始によって調整が必要なしみの雰囲気と同様、装置 (すなわち活栓の腕に配置、約 45 ° の角度でそれ大きく吸引ノイズになります)。
      3. すべての井戸を空にして、一度、三方バルブを調整することによって真空を解放します。標準およびサンプルに含まれている各ウェルにアルカリ溶液 x 1 の 400 μ L を追加します。井戸を空にするために真空を再適用する前に 5 分待ちます。
      4. 再度同じ方法で真空を適用 (3.6.4.2 の手順を参照してください)。
      5. 真空下でドットのしみ装置を分解、膜を削除および 2 ですすいでください x SSC。余分な 2 を削除する、DNA 結合の面にしてきれいなペーパー タオルの上に膜を置く x SSC。
      6. UV クロスリンク適切な UV 架橋; と膜にブロッティングの DNA膜は、交配のため準備が整いました。
        メモ: ウェット膜は、UV 架橋に使用できます。乾燥、UV 架橋膜は室温で保存することができます。さらに詳しい情報は、テーブルの材料で見つけることが。
  7. 交配および洗浄
    1. ウォーム アップ 65 ° C の水浴の交配バッファー。
    2. 酵素によって放射性 α-32P dCTP を DNA プローブのラベルし、製造元の推奨によると市販のキットを使用してそれを浄化します。
      注: 0.5-2.0 のプローブを用いてエンハンサー プロモーター領域またはウイルスのゲノムのタンパク質コーディング シーケンスからの長さで kb。このプロトコルは、信号検出32P 標識放射性プローブを利用して、非放射性化学発光や蛍光プローブも使用できます (ディスカッションセクションを参照してください)。
    3. DNA バインド側の交配瓶の中膜を上に置き、リンス 5 ml 膜 prewarmed 交配バッファーとバッファーを破棄します。Prewarmed 交配バッファーの 10 mL を追加し、65 ° C で設定回転ハイブリダイゼーション オーブンでボトルを配置≥5 分を回転させます。
    4. 100 ° C で熱ブロック セットに管を置くことによって 10 mg/mL 変形ニシンやサケ精子 DNA ソリューションと32P 標識プローブ (≥107 cpm) 5 分の 20 μ L の熱変性します。スナップを簡潔に、スピン、≥2 分間氷の上チルそれら、使用するまで氷の上を維持します。
      注意: 放射性 DNA プローブのスクリュー キャップと o リング 1.5 mL チューブを使用する必要があります。
    5. ボトルし、10 のボトルを振る変性精子 DNA および放射性プローブの交配で交配バッファーをすばやく追加ミックスする s。65 ° C のオーブンにボトルを戻り、≥4 h 65 ° C で回転でボトルを孵化させなさい。
    6. 交配が完了すると、回転を止める、交配ボトルを削除および防漏プラグ シール キャップ付け 50 mL の円錐管に放射性プローブ溶液を注ぐ。放射性物質の冷蔵庫は、適切なコンテナーにプローブを格納します。
      注: 4 ° C で保存されているプローブで使われた交配バッファー再使用できます、少なくとも 5 回 5 分間 100 ° C の水浴の交配バッファーを含む防漏プラグ シール キャップ付け 50 mL の円錐管を配置することによって。
    7. 65 ° C まで加熱洗浄バッファーで膜を洗浄します。交配ボトルに 20 に 30 mL の洗浄バッファーを追加し、5 分これは 2 回以上洗って繰り返し回転させます。
      注: 洗浄溶液の放射能を測定し、ローカルの所で必要な場合、それを記録します。
    8. 膜を洗浄しながら 5 分イメージ消しゴムの画面をイメージング蛍光体を配置します。
    9. 第 3 洗浄後交配ボトルから膜を削除、ペーパー タオルで膜に余分なバッファーを削除、透明なプラスチックのペーパー ホルダーに膜を配置します。ガイガー カウンターを使用して膜の放射性の信号を確認してください。一夜にして信号強度に応じて 10 分間膜に消去された蛍光イメージング画面を公開します。
    10. システムをスキャン蛍光画像を用いた画面をスキャンし、各ドットの信号強度に関するデータを取得します。
  8. データ分析
    1. スプレッドシートとデータ解析ソフトウェア (たとえばExcel) を使用して標準曲線を描画します。
      注: ログ-ログ線形回帰は、標準曲線を描画する使用されました。
    2. 補間によってウイルスの DNA のサンプルのそれぞれのナノグラムと同等 (ng eq) を決定します。Ng eq は、DNA ウイルスの DNA の分子の数に相当する標準曲線を描画するために使用するプラスミドの量です。プラスミド DNA の長さが 8,000 の場合 bp、単一座礁させた AAV ウイルス DNA の 1 ng eq は 2.275 × 108粒子に対応します。
      注: ng eq はウイルス粒子の数を次の数式によって変換できます。
      一本鎖AAV粒子を計算するための方程式。DNA定量化;分子遺伝学の式。
      プラスミド長を使用して二本鎖AAV粒子を計算するための方程式。科学的な公式。
      AAV の粒子の数は、従来"vg"(ベクトル ゲノム) または「DRP」(DNase 私耐粒子) として表されます。
    3. 出発原料の AAV の濃度を計算します。ブロッティング ウイルス DNA が 66.7% を表すのでパーセンテージ計算式: データ分析用 (320/400 × 200/240 × 100%)。開始材料でウイルスの DNA の 1 ng eq は、1.7 倍の 109粒子/mL に対応数式計算式、比率除算乗算科学記数法。
      注: を失わず膜の原料に含まれているすべてのウイルス DNA をにじませる場合は、この修正は必要ありません (図 1参照)。

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結果

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大規模な生産精製 AAV ベクター株式を定量化するため、定量的なドット ・ ブロットの代表的な結果を図 1に示します。このドットのしみアッセイで二本鎖 AAV2G9 CMV GFP ベクトル株式の価を測定しました。ベクトルは、セシウムの塩化物 (CsCl) 密度勾配超遠心法に続いて前述20として透析の 2 つの円形によって精製した.一般に、精製の AAV ベクター株各 AAV ベクター素材 (例えば、0.3 μ L、0.1 μ L、0.03 μ L) の 3 つの異なるボリューム変更と重複で上記ドットしみプロシージャに服従するが。ステップ 3.2、 s. の marcescensエンドヌクレアーゼの代わりに DNase I 酵素 A が使用され (材料表参照) 3.4 の手順で抽出・ ウイルスの DNA を精製する市販のキットを使用します。図 1

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ディスカッション

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本報告では、AAV 薬学会合同とキャプシド アセンブリでの役割を研究する定量的ドットしみアッセイの有用性を説明します。これらの研究から得られた知識は、AAV キャプシド アセンブリの過程で生得的な違いとそれぞれ異なる血清型間薬学会合同の機能的役割に関する詳細情報を提供できます。この点で、AAV VP3 AAP クロス補完ドットしみアッセイ蛇 AAV VP3 はキャプシド アセンブリの同種の AAP の共発現に厳格な依存関係を表示して蛇 AAP が異種血清型のキャプシド アセンブリを促進しないことを明らかにしました。.AAP 依存 AAV の血清型をので、この観察は興味をそそられる以前調べた (AAV1、2、3、6、7、8、9、および 12) すべて異種 AAP6を利用してある程度、少なくともアセンブリを処理することができます。

定量的ドットまたはスロットしみの交配は、便利な方法25で同時に複数のサンプルに含まれている核酸の定量のための伝統的な方法です。メソッドは、qPCR 流行した 19...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

シャオシャオ ノースカロライナ大学チャペルヒル校でにありがとう pEMBL CMV GFP プラスミドを提供してくれる。原稿の批判的な読み、クリストファー ・ チェンとサミュエル ・ j ・黄に感謝します。この作業によって支えられた公衆衛生サービスを付与 (NIH R01 NS088399 ・ T32 EY232113)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BenzonaseMilliporeSigma1016970001本文では Serratia marcescen endonuclease と表記されています。
DNase IRoche4716728001本文ではDNase I Enzyme Aと表記されています。
DNase IInvitrogen18047019本文ではDNase I Enzyme Bと表記されています。
DNase INew England BiolabsM0303L本文ではDNase I Enzyme Cと表記されています。
1.5 mL 付属 O リング スクリュー キャップ マイクロ遠心チューブコーニング430909
1.5 mL マイクロ遠心チューブサーモフィッシャー サイエンティフィック05-408-129
15 mL ポリプロピレン コニカル チューブコーニング352097
3 M 酢酸ナトリウムTeknovaS0298
50 mL ポリプロピレン コニカル チューブコーニング430291
AAV-293 CellsAgilent240073HEK-293細胞株は、AAVビリオンのパッケージングに最適化されています。
AccuGENE 0.5 M EDTA SolutionLonza51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0Lonza51238
AccuGENE 10% SDSLonza51213
AccuGENE 1X TE BufferLonza51235
Bio-Dot ApparatusBio-Rad1706545
Bovine Serum AlbuminMilliporeSigmaA3294
セルリフターコーニング3008
クロロホルムミリポアシグマ372978
DNA 抽出キット和光純薬工業295-50201精製ウイルスの定量的ドットブロットに使用されます。各ステップで、メーカーが提供するマニュアルのプロトコルスキーム2に推奨されるすべての試薬の半分の量のみを使用します。
ダルベッコS Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L)Lonza12-614F
ElectroMAX DH10B CellsThermo Fisher Scientific18290015
Ethanol 200 ProofDecon Labs2716
Fetal Bovine SerumVWR1500-500
Ficoll 400Alfa AesarB22095Polysucrose 400.
蛍光顕微鏡ZeissAxiovert 40 CFL
グリコーゲンロシュ10901393001
ニシン精子 DNAInvitrogen15634-017
ハイブリダイゼーションチューブサーモフィッシャーサイエンティフィック13-247-150
ImageQuant TLGE ヘルスケア ライフサイエンスImageQuant TL
L-グルタミン 200 mMLonza17-605E
塩化マグネシウム六水和物MilliporeSigmaM0250
MicroPulser ElectroporatorBio-Rad1652100
Mini Quick Spin DNA ColumnsMilliporeSigma11814419001
pAAV-RC2 VectorCell Biolabs IncVPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10KLonza17-602E
リン酸緩衝生理食塩水ロンザ17-516F
リン光イメージング露光カセットGE ヘルスケアライフサイエンス各種
リン光イメージングスクリーンGEヘルスケアライフサイエンス各種
プラスミド マキシキットQIAGEN12162
プラチナ Pfx DNA ポリメラーゼInvitrogen
PolyethyleniminePolysciences Inc23966-2
PolyvinylpyrrolidoneMilliporeSigmaP5288
Prime-It II Random Primer Labeling KitAgilent Technologies300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning:CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAAA-N25		MilliporeSigmaカスタムプライマープライマーAAP
リバース(N25はAAP ORFの最後の25ヌクレオチドであり、RE2はクローニングの制限酵素部位です):TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaカスタムプライマー
プライマーVP3フォワード(N25VP3 ORFの最初の25ヌクレオチド、RE1はクローニングの制限酵素部位です):CTAA-RE1-CACC-N25MilliporeSigmaカスタムプライマー
リバース(N25は、AAP ORFの最後の25ヌクレオチドです。 RE2 はクローニング用の制限酵素部位です): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Proteinase K SolutionInvitrogen25530-049
制限酵素New England Biolabs各種
サーモン 精子 DNAInvitrogen15632011
血清ピペットサーモフィッシャーサイエンティフィック13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
塩化ナトリウムサーモフィッシャーサイエンティフィックS271-10
クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物ミリポアシグマC8532
T4 DNA ポリメラーゼニューイングランド バイオラボM0203L
サーマルサイクラーエッペンドルフ6321000515
組織培養処理済み 6 ウェルプレートコーニング
Tris BaseサーモフィッシャーサイエンティフィックBP152-5
台風 FLA 7000GE ヘルスケア ライフサイエンス28955809
UltraPure Buffer-Saturated PhenolInvitrogen15513-047
UV CrosslinkerSpectrolineXLE-1000Optimal Crosslink mode is used with 120 mJ/cm2。
ゼータプローブメンブレンBio-Rad162-0165
11708013プライマーVP3353046

参考文献

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