全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2 光子イメージングを組み合わせた手法を提案します。
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この記事について
サマリー
要約
カルシウム (Ca2 +) 画像は、神経樹状突起における細胞内 Ca2 +シグナルの時空間ダイナミクスを調べるための強力なツールです。Ca2 +変動は様々 な膜と細胞内メカニズムを介して発生するでき、樹状の興奮性のシナプス可塑性の誘導と制御に重要な役割を果たします。したがって、樹状突起の分岐で Ca2 +シグナルの種類を記録する機能は樹状突起が情報を統合する方法を研究するグループの貴重です。2 光子顕微鏡の出現は、症状や光散乱などの生体の画像に固有の問題を解くことによって、このような研究を大幅に簡略化は。また、2 光子 Ca2 +イメージングと従来の電気生理学的手法の組み合わせによるローカル Ca2 +変動録音と並行して神経細胞の樹状突起でのシナプスを調査することが可能です。相馬。ここでは、gaba 作動性抑制性介在神経細胞の樹状突起にローカル Ca2 +トランジェント (猫) のダイナミクスを研究するこのメソッドを使用する方法について述べる。メソッドは、樹状 Ca2 +急性脳スライスに異なる神経型シグナルの勉強にも適用できます。
概要
ニューロン ネットワーク活動への貢献はそれが受け取るシナプス入力の動的な性質によって決まります。伝統的に、シナプス電流通路の軸索の電気刺激による誘発の体全体セル ホールセル記録するニューロンのシナプスの特性の優勢な方法に依存。ただし、近位に位置するシナプスの唯一の活動は正直このケース1で報告されます。さらに、シナプス固有のメカニズムを評価するためにニューロンのペアから、特定の場所に樹状突起からの録音はそれぞれ関心のシナプスと樹状突起の統合のメカニズムをターゲットに使用されています。画期的シナプスの生理学の分野では、光学的および電気生理学的手法の結婚によって達成されました。2 光子励起レーザ走査型顕微鏡 (2PLSM) Ca2 +イメージングと光遺伝学的ツールとの組み合わせでシナプスで脳スライスで特定の神経接続でのダイナミックな組織の途方もない詳細が明らかに体外とin vivo。
複数の主利点を作った 2PLSM、従来の 1 光子励起顕微鏡2から目立つ: (1) 二光子励起の非線形性質のため、蛍光が焦点のボリュームでのみ生成され、すべて放出される光子を表す有用な信号 (ピンホールのない必要);(2) より長い波長、2PLSM で使用される浸透散乱組織より効率的に;さらに、光子、2 光子励起とバック グラウンド蛍光; あまりにも....
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プロトコル
動物保護委員会のラヴァル大学とカナダ評議会は、動物愛護の家畜福祉ガイドラインに従ってすべての実験を行った。
1. 事前準備 (オプション: 1 日を前もって準備)
- 人工髄液 (アプライド) ソリューション (各ノーマル、ショ糖と復旧ソリューション、1 L;テーブル 1を参照) の 3 種類を準備します。300 ± 10 mOsm25に溶液の浸透圧を調整し、氷点下に近いポイントにアプライド ショ糖をクール (0-4 ° C)。
注: 低ナトリウム切削ソリューション (アプライド ショ糖) の使用は、急性スライス26の表面的な層のニューロンの生存を保持できます。 - 赤蛍光体 (例えば、Alexa 594) を含む修正プログラム ソリューションの 0.75 ml と緑の合成カルシウム インジケーター (例えば、オレゴン グリーンこれら 1;テーブル 1を参照)。Biocytin は、(表 1参照) 修正プログラム ソリューションの記録された細胞の形態学的同定をアドホックの記事が必要な場合に。
- 280 ± 5 mOsm の解決策と pH 7.35 ± 0.5 の浸透圧を調整....
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結果
ここで提示されたプロトコルを使用して、体の電流注入によると海馬の CA1 野オリエンス/alveus 介在ニューロンの樹状突起に電気刺激による誘発猫を得られます。複数のポイントで近位樹状突起全体エネルギーを培ってニューロンは、特定のパッチの形状と位置に基づく後で相馬 (図 1 a) から距離が与えられます。相馬の増加 (減少の AP 振幅またはカルシウム チャネル流通、図 1 bの距離依存性低下を示す) からの距離の逆伝搬 Ap による猫の振幅の減少を見ました。免疫組織化学 (Alexa Fluor 546 のストレプトアビジン共役を使用) 後、セルの biocytin ラベルを取得し、占領オリエンス地層と地層結腸寄生虫 (図軸索と解像セルとして記録されたニューロンを識別することができました1 C). 2 番目の実験では、刺激のピペットは遠位樹状サイトにもたらされました。樹状突起上をスキャンする.......
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ディスカッション
ここに示すメソッドでは、勉強して樹状 Ca2 +急性脳スライスにおける神経樹状突起におけるシグナル伝達のための 2 光子励起 Ca2 +イメージングとパッチ ・ クランプ電気生理学の組み合わせの使用方法を示します。このメソッドは両方ローカル Ca2 +標高樹枝状のセグメントと細胞の体細胞応答に電気刺激や逆伝搬 AP により誘発されるを監視することができます。樹状ツリーのさまざまな部分の入力を統合し、相馬と通信を勉強する優れたツールとなります。実験の長さを考えると、特に注意は細胞の健康に樹状突起の光損傷を避けるためにイメージングのためのレーザー パワーの使用を制限することによって支払われる必要しますが、あります。これは、ズーム レベルを減少させる、スキャンの期間を短縮、画像集録時にスキャンの速度を増加しても達成できます。介在ニューロンの樹状突起を画像追加の問題が生じます。これらの細胞の樹状突起に棘があるないように、樹状突起に沿ってスキャン シナプス Ca2 +ミクロ相分離構造のローカリゼーションを促進する推奨します。さらに、高い内因性 Ca2.......
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開示事項
著者ない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係があります。
謝辞
この作品は、健康の研究のカナダの協会、自然科学工学研究協議会 (レベル検出グラント)、サヴォイ財団によって支えられました。OC は、レベルから博士フェローシップによって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 動物系統:マウスCD1 | ルズ | リバー022 | |
| ソフルラン | アッヴィコーポレーション | 0B506-099 | |
| CGP55845塩酸塩 | Abcamab120337 | ||
| 塩化カルシウム | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-グルコース | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 塩化マグネシウム | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 硫酸マグネシウム七水和物 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| パラホルムアルデヒド粉末、95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 塩化カリウム | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| グルコン酸カリウム | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| アジ化ナトリウム | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 重炭酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| 塩化ナトリウム | シグマ・アルドリッチ | S5886 | |
| ショ糖 | シグマ・アルドリッチ | S9378 | |
| トリトン X-100 | シグマ・アルドリッチ | T9284 | |
| トリズマベース | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma 塩酸塩 | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| ナトリウム二塩基性二水和物 | Sigma-Aldrich | 71643 | |
リン酸ナトリウム一塩基性 一水和物 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
アデノシン三リン酸 (ATP)-トリス | シグマ-アルドリッチ | A9062 | |
グアノシン (GTP)-Na+ | Sigma-Aldrich | G8877 | |
オレゴングリーン BAPTA-1 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | O6812 | |
ホスホクレアチンジ(トリス)塩 | Sigma-Aldrich | P1937 | |
ストレプタビジン結合 Alexa-546 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | S11225 | |
パッチホウケイ酸ガラス毛細血管 | ワールド精密機器 | 1B100F-4 | |
シータホウケイ酸ガラス毛細血管 | サッター機器 | BT-150-10 | |
P-97 フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー | サッター機器 | ||
TCS SP5 共焦点多光子顕微鏡 | Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire 多光子レーザー | Coherent | ||
| LAS AF イメージング取得ソフトウェア | Leica Microsystems | ||
温度コントローラー TC-324B | Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier | Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer | Molecular Devices | ||
Confocal翻訳者 | Siskiyou | ||
マイクロマニピュレーター | Siskiyou | ||
pClamp データ収集ソフトウェア | 分子デバイス | ||
A365 定電流刺激アイソレーター | ワールド精密機器 | ||
振動機 光学テーブル | キネティックシステム |
参考文献
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997). ....
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