タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソ フォームの高感度・定量的検出

Summary

キャピラリー等電集中はタンパク質と非常に小さい試料からアイソ フォームの詳細な特性解析を有効に、抗体を用いた、超高感度、高スループット手法です。次に、自動化・ ロボット化の方法で特定の蛋白質とアイソ フォームの検出と定量のためのプロトコルについて説明します。

Abstract

免疫ブロット生体試料中のタンパク質の特徴の多くの実験室のルーチンの技術となっています。次のプロトコルは、代替戦略を提供、従来免疫ブロット キャピラリー等電の多くの利点 (代表取締役) を中心に比べています。完全な西部のしみが付くプロシージャが起こる超毛細血管内抗体ベース、自動化、迅速かつ定量的な方法です。この手法、しみの除去、膜に転送するゲルを必要としないか、または x 線フィルム、通常従来免疫ブロットを必要です。充満 (等電点; pI) によるを使用してより小さい、1 マイクロリットルの蛋白質の分離、ここ (400 nL) 総蛋白ライセートの。電気泳動後のタンパク質はプライマリとセカンダリ (西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 共役) 続いて、紫外光照射による毛細血管壁に固定化抗体の孵化、バインドは検出が強化されました。化学発光 (ECL)、キャプチャおよび電荷結合素子 (CCD) カメラによって記録が可能な光信号を生成します。デジタル画像分析することができ、定量化 (ピーク面積) ソフトウェアを使用しています。この高スループット プロシージャは、同時に 96 のサンプルを処理できます。非常に敏感な picogram の範囲でタンパク質検出自動化のため再現性の高い結果を生成します。すべてのこれらの側面は、試料 (例えば、ティッシュ サンプルおよび生検) の数量が制限要因非常に貴重です。技術がより広いアプリケーションだけでなく、薬や抗体、バイオ マーカーの探索と診断のためのスクリーニングを含みます。

Introduction

その電荷^1,2,3蛋白を解決する自動、キャピラリーを用いたイムノアッセイ法であるキャピラリー等電集中 (代表取締役)それは高い再現性で迅速かつ定量的に蛋白質とそのファーストクリーニング変更を解決することができます。西部にしみが付くことなど従来の方法に代わるものを提示します。西部にしみが付くことは非常に容易にアクセスできるサンプルの豊富な蛋白質の存在を確認するため良い変動、時間消費、および正確な定量すべての存在の課題、特に生体組織サンプルを調べるとき。確かに、変動は西部にしみが付くことで本質的な問題があると多数手順、読み込みと SDS ページのゲルの実行、膜への蛋白の転送など様々 な試薬と孵化 (e.g、プライマリおよびセカンダリ。ECL 抗体)、x 線フィルム⁴を開発。現在、西部のしみが付く技術は化学発光信号 (デジタル西部劇) のデジタル録音の実装を改善します。、自動化された西部しみが付くシステムは近年、すなわち毛細血管西部、よりハンズフリーし、ゲル無料システムであります。全体アッセイ システム^3,4に次のサンプル プレート (すべての必要な試薬とサンプル) の読....

Protocol

1. セルの換散、刺激、文化

注: このメソッドは、多くの細胞のタイプで使用できます。このメソッドを示すためには、ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) の使用例が説明されています。

1. 文化 10 cm シャーレをゼラチンでコーティングされた、適切な補充と内皮細胞基本培地での比較 (材料の表を参照)、5% の FCS、表皮の成長因子 (5 ng/mL)、血管内皮増殖因子を含有 (VEGF:0.5 ng/mL) 基本的な FGF (10 ng/mL)、インスリン様成長因子 (20 ng/mL)、ヒドロコルチゾン (0.2 μ G/ml) とアスコルビン酸 (1 μ g/mL)。
2. 1% の FCS と成長因子のないサプリメントを添加した内皮細胞基本培地で細胞を一晩餓死します。
3. すべての培地を吸引、一皿 (コントロール) の成長因子 (飢餓中) することがなく血管内皮細胞培養培地 2 mL を追加し、2 番目の料理は 7 分間の飢餓培養培地 2 mL に 50 ng/mL VEGF を追加します。
4. 培地を吸引し、10 mL 室温 PBS で 2 回細胞を洗ってください。
5. ペトリ皿は氷の上、この手順以降から維持することを確認します。
6. 氷冷の換散バッファー (ビシン/チャップス; 参照テーブルの材料)....

Results

新しいアッセイのデザイン:図 1 aに、アッセイ プレート レイアウトを示します。最大限に、各条件 (抗体) の 12 の井戸のブロックで 384 ウェル プレートから 96 ウェルを使用できます。12 ウェルの各ブロックは A1 A12 または A13 A24 のいずれかから開始できます。色分けされた行は互いのサンプルや試薬を区別すること。分析テンプレート (図 1 b)、それに関連する情報で、結果分析の後の段階で使用できる、特定のアッセイを格納できます。図 1は、プロトコルの概要を示しています。

VEGF 刺激による血管内皮ライセートのリン酸化とペプタイド細胞外規制キナーゼ (pERK1/2、ERK1/2) 蛋白質の検出:.......

Discussion

感度と分解能のタンパク質が生体試料のプロテオーム研究のため重要です。細胞内微量に含まれるタンパク質を検出できることに大きな価値があります。代表取締役には、感度の向上と蛋白質とのアイソ フォーム⁴の検出のための解像度を提供できます。

この技術は、多くプロテオーム研究レポート^5,6,7で正常に使用されています。それでも、いくつかの制限が実際に場合でも、彼らは従来の immunoblots でうまく動作しないすべての一次抗体は、信号を与えることができるなど、それに関連付けられました。まだ、このテクニックは非常に新しいので、代表取締役で機能する検証済みの抗体のリストはありません。最後に、楽器は一度により少ない 12 サンプルまたは 96 以上のサンプルを処理できません。

代表取締役は従来法の代替法が、そ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	プロテインシンプル
プレミックス G2、pH 5–8(ネスト)分離グラジエント、pH 2–4 プラグ	ProteinSimple	040-972	Ampholyte premix
DMSO inhibitor mix	ProteinSimple	040-510	Phosphatase inhibitors; cIEF 1:50 希釈 使用
水性阻害剤ミックス	ProteinSimple	040-482	プロテアーゼ阻害剤; cIEF 1:25 希釈 使用
pI 標準ラダー 3	ProteinSimple	040-646	cIEF 1:60 希釈使用
サンプル希釈剤	ProteinSimple	040-649
抗体希釈剤	ProteinSimple	040-309
ウォッシュ濃縮物	ProteinSimple	041-108
陽極質詰め替え	ProteinSimple	040-337
陰極液詰め替え	ProteinSimple	040-338
過酸化物XDR	タンパク質Simple	041-084
ルミノール	ProteinSimple	040-652
ビシン/CHAPS 溶解バッファー	タンパク質シンプル	040-764
キャピラリー-電荷分離 (1パック) for	ProteinSimple	CBS700
Assay Plate/Lid Kit	ProteinSimple	040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	ジャクソン・イムノリサーチ	711-035-152	cIEF用(1:300)
ペルオキシダーゼ-アフィニピュアロバ抗マウスIgG(H + L)	ジャクソン・イムノリサーチ	715-035-150	使用される cIEF の場合 (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 一次抗体	細胞シグナル伝達	9101	使用される cIEF の場合 (1: 50)
Pan Erk 一次抗体	細胞シグナル伝達	9102	使用される cIEF の場合 (1: 100)
コンパス ソフトウェア	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	C-22221	内皮細胞基底培地
内皮細胞増殖培地 MV2 SupplementPack	PromoCell	C-39221
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	インスリン様成長因子
Bioruptor (Sonicator)	Diagenode	B01020001
BCA Proteinアッセイキット	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS ランニングバッファー (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
マイクロチューブボルテクサー
遠心分離
タイタープレートアダプター 遠心分離
ピペッター用
ヒント
:氷