顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

Summary

本稿では培養上皮細胞は、どのように切開のような病変便利なモデルの傷癒しの in vitro、共焦点イメージングを可能にするについて説明しますまたはレーザ走査顕微鏡と高品質を提供することができます。細胞の挙動と移行に関与するメカニズムの両方の研究のための質的・量的データ。

Abstract

細胞遊走は、創傷治癒に必須の側面です。人工を作成する傷を研究の動物モデルにコストがかかり、複雑な実験手順の結果にしばしば潜在的精度に欠けている間。上皮細胞の体外培養は、創傷治癒と細胞の治療法の影響で細胞の回遊行動の研究のため適切なプラットフォームを提供します。上皮細胞の生理学は非合流条件でよく勉強しました。ただし、このアプローチは、自然治癒で条件に類似しないかもしれない。機械的手段によって上皮の整合性を中断することは現実的なモデルを生成しますが、分子技術のアプリケーションを妨げることがあります。したがって、顕微鏡技術は上皮細胞の遊走を勉強に最適体外。ここで我々 は, 上皮細胞の渡り鳥の性能に関する量的・質的データを入手できる人工移行フロント アッセイ、人工傷スクラッチ試験 2 つの特定の方法を詳しく説明します。

Introduction

上皮のギャップの最終的な閉鎖と混乱の表面¹の修復を担当しており、細胞遊走は創傷治癒に必要です。動物モデルにおける人工傷を実行できるように生理的条件²の近くでこの複雑なプロセスを複製するため。しかし、このアプローチは多くの場合コストがかかり、複雑な実験の手順、可能性のある創傷治癒過程の複雑な性質のための明確なプロセスの研究の精度を欠いている結果します。

上皮細胞の体外培養は、創傷治癒や処理セルの回遊行動に及ぼす影響のこれらの細胞が果たす役割を研究するため動物モデルの有用な代替を提供します。上皮細胞の生理学は非合流文化^3,4,5,6; を使用して分子技術によってよく勉強しました。ただし、上皮整合性の破壊は結構機械的切開により通常。細胞培養、細胞のほとんどの数は、傷のギャップにさらされるかもしれないし、彼らは分子生物学の技術のための余りに小さいサンプルを表すこれを意味します。ただし、これらの病変は、ミンク肺上皮細胞 (Mv1Lu) または自然不死化ひと表皮細胞 (HaCaT) セルなど、いくつかの上皮細胞ラインの生得....

Protocol

1. 人工傷スクラッチ アッセイ定量的研究

1. セル膜の準備
   1. 無菌状態の下で働いて、シードし、血清添加培地を用いた培養フラスコに Mv1Lu または HaCaT 上皮細胞を成長します。一度、すべての 24-48 h 媒体を更新します。電池が 80% の合流点に達する後、適切な方法、すなわちtrypsinization⁹を使用してセルをデタッチします。
      注: Mv1Lu と実装された EMEM と DEMEM の培養液を使用して上皮細胞株を培養している HaCaT それぞれ 2 mM L-グルタミンを添加したし、5% CO₂の制御された雰囲気と 37 ° C で培養しました。すべての細胞株は細胞濃度と完全 confluency に達するに必要なタイミングを決定する徹底的に試金する必要があります。通常 Mv1Lu または HaCaT 細胞の x 10 の⁴または 10⁴細胞/ウェル、x 4-6 2 4 それぞれがシード 175 cm²培養用フラスコのと最大 35 x 10⁶ Mv1Lu または 1 × 10⁷ HaCaT 細胞 80% で合流点が得られます。
   2. どちらかの 12、または 24 ウェル培養プレートの各ウェルの細胞の 2 mL....

Results

定量的研究のため人工傷スクラッチ試金: 移行上皮成長因子 (EGF) 推進を評価します。

EGF は、上皮細胞の増殖と移行、およびこうして移行推進を定量化するための肯定的な制御のよく知られている誘導です。Mv1Lu と HaCaT 細胞膜が傷傷試金で使用された、治療前の写真が得られました。10 ng/ml の EGF, 接種後のセルは固定と治療後の写真の前に 19 時間培養。増殖は、血清飢餓条件を維持することによって最小に保たれました。ImageJ を用いた画像の前処理および後処理のセット分析し、中央ギャップ領域を調べた。重複しているためにも、各 4 つのサイズを登録するのに実験を実行します。表面の差として算出した絶対移行の定量化: (プリギャップ − POSTGAP)。刺激 HaCaT 細胞 (図 1 b) と比較して刺激 Mv1Lu 細胞 (図 1 a<.......

Discussion

皮膚または粘膜の破壊、線維芽細胞、上皮や免疫細胞など、様々 な細胞タイプの行動によってバリア機能が復元されます。相まって、これらの細胞を受ける複雑なアポトーシス、増殖、分化、重要なは、線維芽細胞を含むプロセスと上皮細胞の移行、混乱の組織の修復のための責任の究極のメカニズムであると表在性上皮ギャップ^1,12細胞遊走を勉強したがっての閉鎖も傷の治療の調節の可能性を決定する際に上皮細胞の生理学的な現象を正確に記述することができます。癒し。

生理的条件²の近くでこの複雑なプロセスのレプリケーションおよびこうしていくつかの病理学の条件の評価や医薬品の効果の研究の動物モデルに人工傷を実行できるように治療¹³。しかし、このアプローチは多くの場合遅延ファッション¹³のデータを生成する可能性が負担の実験プロシージャと同様に、高価で複雑な物流の.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ダルベッコS Modified Eagle Medium (DMEM)	Biowest, Nuaillé, France	L0102-500	オプション 10% FBS サプリメント
Eagles's 最小エッセンシャルメディウム (EMEM)	ロンザ	BE12 -662F	オプション 10% FBS サプリメント
L-グルタミン	ロンザ	BE17-605E	2 mM
ウシ胎児血清 (FBS)	モフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州 米国
トリプシン-EDTA	Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ	T4049	必要に応じて希釈
ポリ-L-リジン	Sigma-Aldrich、セント米国ミズーリ州ルイ	P9155
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) (10x)	Gibco by Life Technologies	14200-067	1x
24ウェル培養プレート	BD FALCON//SARSTED	734-0020
6ウェル培養プレート	SARSTEDT	83-3920
上皮成長因子 (EGF)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	E9644	使用済み 10ng/mL
ラウンドカバーガラス	MENZEL-GLÄSER	MENZCB00120RA020	SHORT DEPTH OF FIELD
強化カミソリ刃 No. 743	Martor (VWR経由)	MARO743.50
200 µl 滅菌エアロゾルピペットチップ	VWR	732-0541
20 & マイクロ;l 滅菌エアロゾルピペットチップ	VWR	732-0528
デジタルカメラ 結合位相コントラスト顕微鏡	Motic Spain	Moticam カメラ 2300 3.0 M ピクセル USB 2.0;Motic Optic AE31
共焦点顕微鏡	ZEISS Microimaging, ドイツ	LSM 510 META
10 cm 培養皿	BD FALCON	353003
ウサギ ポリクローナル抗 c-Jun 抗体	Santa Cruz バイオテクノロジー	sc-1694	使用 1:100
抗ウサギ IgG (ポリクローナルヤギ) AF 488	Invitrogen	A11008	使用 1:400
Hoechst-33258	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	14530	Used 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)	Invitrogen	A12381	Used 1:100
Bovine Serum Albumin	Santa Cruz Biotechnology	SC-2323
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T9284
スキムミルク	BD DIFCO	232100
ImageJ	National Institutes of Health, USA	リリース 1.50i
Zen LSM 510 画像処理ソフトウェア	ZEISS Microimaging, ドイツ	リリース 5.0 SP 1.1