翻訳制御蛋白質量の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、我々 は出芽酵母出芽酵母における翻訳の定量分析のための高スループット方法をについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
MRNA のタンパク質への翻訳は、規制のいくつかの層を含む複雑なプロセスです。MRNA 転写の変化蛋白質合成に変更を反映するが、多くの例外を観察されているとしばしば見なされます。最近では、リボソーム プロファイル (またはリボ Seq) と呼ばれる手法は、mRNA の領域はタンパク質とゲノムのレベルで翻訳の定量化に変換されます、精度の高い識別ができる強力な方法として浮上しています。ここでは、出芽酵母リボ Seq を使用して翻訳のゲノムワイドな定量化のための一般的なプロトコルを提案する.また、同時に何千もの同じサンプルの mrna の翻訳効率を定量化し、比較実験への応答でこれらのパラメーターの変更を可能にリボ Seq データ mRNA 豊富な測定と組み合わせること操作または異なる生理学的状態に。ヌクレアーゼ消化、ショ糖勾配分画法によるフット プリントとはそのままリボソーム複合体の分離および DNA ライブラリの準備を使用して適切なと共にディープ シーケンスのリボソーム足跡の生成のための詳しいプロトコルについて述べる生体内で翻訳の正確な分析を確保するために必要な品質を制御します。
概要
mRNA の翻訳は、タンパク質発現の調節に重要な役割を果たしている細胞の基本的なプロセスの 1 つです。したがって、mRNA の翻訳は、さまざまな内部および外部生理的刺激1,2への応答では厳重します。ただし、翻訳制御機構のまま流。ここでは、プロファイリング ・ リボソームで翻訳出芽酵母におけるゲノム定量化のプロトコルについて述べる.リボソーム プロファイリング技術の全体的な目標は、研究し、細胞の異なる条件の下で特定の Mrna の翻訳を定量化することです。このテクニックは、ゲノム全体のリボソーム占有率を定量的に解析する次世代シーケンスを使用して、タンパク質合成生体内単一コドン解像度3,4の率を監視できます。現在、このメソッド タンパク質翻訳のレベルを測定する最も先進的な手段を提供して他の現在利用可能な技術、マイクロ アレイなどによって明らかにすることができない情報を提供する便利な検出ツールをあると証明したか翻訳の状態配列解析 (TSAA) 5。リボソームのプロファイリングと並進出力のトラン スクリプト レベルでそれらの変更内容をレポートとしてそれはまた他の方法と比べて多くの高い感度を提供します。
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プロトコル
1. エキスの準備
- YPD プレート (1% 酵母エキス、2% ペプトン、グルコース 2%、2% 寒天培地) に単一コロニーのため凍結する在庫から連勝酵母菌。2 日間の 30 ° C で版を孵化させなさい。
- 50 mL の円錐形遠心管中の ypd 培地 (1% 酵母エキス、ペプトン 2%、2% グルコース) 15 mL に YPD プレート (単一コロニーを使用) から酵母を接種して 30 ° C に (200-250 rpm) を振動で一晩成長
- 文化を 2 L の滅菌フラスコ ypd 培地 500 mL に希釈して OD600 < 0.1。外径 φ600まで 3-5 h 30 ° C で揺れで酵母を育てる = 0.5 (中間ログ フェーズ)。
- 0.45 μ m メンブラン フィルター ガラス ホルダー フィルターのアセンブリを使用してフィルタ リングによって細胞を収集します。へらで、液体窒素で凍結、ペレットをこすり、-80 ° C で保存冷凍餌の予想サイズが 〜 0.2 - 0.5 g。
注意: 液体窒素は超低温です。適切な保護具を着用します。 - 新鮮な換散バッファーを準備 (20 mM トリス塩酸 pH 8.0、140 mM KCl、5 mM MgCl2, 100 μ g/mL シクロヘキシミド、0.5 mM DTT、1% トリトン X-100)、....
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結果
詳細なプロファイルデータ リボソームの構造バイオ情報解析パイプラインをされている8,9で説明しました。さらに、いくつかの研究グループの差動遺伝子発現解析とシーケンス データをプロファイリング方法10、11,12 リボソームに固有の処理のためのバイオインフォマティクス ツールを開発しています。 ,13,14,15,16,17
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ディスカッション
リボ Seq アプローチは、mRNA 翻訳体内でゲノムのレベル3の解析のための強力な技術として浮上しています。シングル コドン解像度変換を監視でき、この手法を使用して研究は翻訳制御の私達の理解に貢献しています。その利点にもかかわらずリボ Seq いくつか制限があります。リボソーム RNA (rRNA) フラグメントは、リボソーム保護足跡リボ Seq 実験9,25で得ることができる便利な配列読み取りの収量の減少の分離中に常に共同浄化されました。我々 のデータは、rRNA 汚染は、すべての読み取り (図 8) の 40-50% に貢献できることを示しています。この制限を克服する方法の 1 つは、シーケンス処理深さを増やすことです。シーケンスの追加のラウンドは、各分析サンプルの配列読み取りの必要な数を達成するまで行わなければなりません。我々 のプロトコルを使用したシーケンス ライブラリの分析では、12 .......
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開示事項
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
謝辞
この仕事は健康補助金 AG040191 と VML に AG054566 研究機構によって支えられました。VML が加齢医学研究のためのアメリカ連合から遠く研究助成受信者間に調査しました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.45 μ;M メンブレンフィルター | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL 遠心フィルター (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C;C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-尿素ゲル | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-尿素ゲル | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-尿素サンプルバッファー | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc、pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads,3.2 mm | BioSpec 製品 | 11079132c | |
| クライオグラインダー | Biospec 製品 | 3110BX | |
| シクロヘキシミド | RPI | C81040-5.0 | |
| データ収集システム | DATAQ 機器 | DI-245 | |
| デオキシヌクレオチド (dNTP) 溶液混合物 (10 mM) | NEB | N0447L | |
| グリコーゲン | Invitrogen | AM9510 | |
| グラジエント分画システム | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | 5X Phusion HF Buffer |
| 次世代シーケンシングライブラリ定量キット | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | ベックマン・コールター | A94471 | |
| ポリ(A) mRNA 単離キット | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J エキソヌクレアーゼ (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| 逆転写酵素 (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | 5X first-strand buffer および 0.1 M DTT |
| RNA フラグメンテーションバッファー | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase阻害剤(20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| シリコーンゴムキャップ | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNAリガーゼ (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | 10X CircLigase IIバッファーと50 mM MnCl2 |
| Stainless microvials、1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Tiローター | Beckman Coulter | 331362 | |
| シリンジポンプ | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | 10X T4 ポリヌクレオチドキナーゼバッファーが付属 |
| T4 RNA リガーゼ 2 切断型 KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | 10X T4 RNA リガーゼバッファーと 50% |
| PEG8000 サーマルサイクラー | Bio-Rad | 1851148 | |
| 薄肉ポリアロマーチューブ、13.2 mL | ックマン・コールター | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UVモニター | バイオ・ラッド | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae 株 BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
参考文献
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., N....
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