Method Article

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

DOI:

10.3791/56837

⸱

March 8th, 2018

 ,  , 
1Donald Danforth Plant Science Center, 2Department of Biological Sciences, The University of Alabama

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この記事では、DNA の隔離及び非常に質の悪い DNA の救助を含む標本材料から高スループット シーケンス ライブラリ構築のための詳しいプロトコルを示します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

標本は、さまざまな生物学的研究で使用できる植物材料の非常に貴重な源です。標本の使用はサンプル保存品質、劣化 DNA、珍しい標本の破壊的なサンプリングを含む課題の番号に関連付けられます。効果的に大規模なプロジェクトの標本材料を使用、するために DNA の分離およびライブラリの準備の信頼性と拡張性の高い方法が必要です。本稿は、DNA 分離、高速ライブラリ構築に標本から個々 のサンプルの変更を必要としない堅牢で、始めから終わりまでプロトコルを示します。このプロトコルは、組織研削、ライブラリ サイズ選択を変更して低収量ライブラリのオプション reamplification ステップを導入することを最適化することにより従来の低品質の乾燥植物素材とを利用に合わせて調整します。低収量 DNA ライブラリの reamplification は、かけがえのない、潜在的に貴重な標本、追加破壊サンプリングし、共通認識できるシーケンス バイアスを導入することがなく、必要性を否定することから派生したサンプルを救うことができます。系統のアプリケーション。プロトコル数百草種でテストされていますが確認後他の植物の系統での使用に適応します。このプロトコルは、フラグメントは目的のサイズの範囲では存在しない、非常に低下した DNA ときれいな DNA 分離を抑制する二次代謝産物いくつかの植物材料の存在によって制限することができます。全体的に、このプロトコルは DNA の隔離と最小限の変更でアクティブなハンズオン タイムの 8 時間だけで 13 h 未満の 24 サンプル調製されたライブラリでは、高速かつ包括的な方法を紹介します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

標本コレクションは、種と系統1,2,3, 集団遺伝学4,5, 保全を含む研究のためのゲノムの多様性の両方の可能性がある貴重な情報源生物学6、外来種生物学7、および形質進化8。種、人口、地理的な場所、タイム ポイントの豊かな多様性を取得する機能は、標本は、「宝箱」9を強調表示します。歴史的に、標本由来 DNA の劣化した自然が多い領域の葉緑体ゲノムや、リボソームの内部転写スペーサー (ITS) などの高いコピー内で見つかったマーカーのみを使用する研究者を追いやって、PCR ベースのプロジェクトを妨げています。RNA。標本と DNA の品質によって異なります広く保全9,10二本鎖切断と損傷の最も一般的な形であること、作成の乾燥工程で使用される熱から断片化の手法、いわゆる 90 %dna ロックアップ PCR ベースの研究11を妨害しています。断片化、別標本のゲノムの第 2 最も一般的な問題は汚染、生菌13から派生する菌類コレクション後、標本12にもマウントする前に死後を取得したようにこの問題は、右真菌データベース (下記参照) を与えられた解決の bioinformatically をすることができます。11押し葉標本の低い (〜 0.03%) と推定されている、3 番目、およびより少なく共通の問題はシトシン脱アミノ化 (C/G→T/A)14日シーケンス変更です。短いリードとシーケンス深さ12,15、低品質の多数の標本から遺伝子レベルのデータ集録が可能高スループット シーケンス (HTS) の出現により、断片化の問題を克服できます。DNA と時々 全ゲノム シーケンス15を許可します。

標本サンプルはより頻繁に使用されるなる、系統のプロジェクト16の大きなコンポーネントです。標本を用いた高温超伝導体の現在の課題が個々 のための方法を最適化することがなく、タイムリーに多くの種から十分な二本鎖 DNA、シーケンス プロトコルは、必要な前提条件を一貫して取得します。標本。本稿では、既存の手段を活用して、高速かつ複製可能な結果を可能にするそれらを変更に DNA の抽出と標本のライブラリの準備のためのプロトコルが示されています。この方法は 13 h、8 h のハンズオン タイム、または 16 h、9 h、ハンズオン時間、オプション reamplification ステップが必要な場合 24 サンプルのライブラリに試験片から処理が完了すること。多くのサンプルの同時処理は、制限要因は遠心力と技術的なスキルが達成可能で。プロトコルは DNA をせん断してだけ典型的な実験装置 (たち、遠心とマグネット スタンド) ネブライザー、超音波発生装置などの特殊な機器ではなくを必要とする設計されています。

DNA の品質、フラグメント サイズと数量は、高スループット シーケンス実験の標本の使用のための要因を制限しています。標本の DNA を分離し、高スループット シーケンス ライブラリを作成する他の方法は 10 として少し使用の有用性を実証している DNA16; ngただし実験的 PCR の最適な数を決定する必要なライブラリの準備のために必要なサイクルです。これは、いくつか標本が単一のライブラリの準備のため十分な DNA のみを生成するよう実行可能なダブルの非常に小さな金額を扱う鎖 DNA (dsDNA)、非現実的ななります。ライブラリの最適化の手順で DNA は失われませんので、ここで紹介した方法は単一サンプルの質に関係なくサイクル数を使用します。代わりに、ライブラリは、シーケンスに必要な最低限の量を満たしていない場合に、reamplification ステップが呼び出されます。多くの植物標本サンプルはまれであり、多くの場合有害なサンプリングを正当化するが難しく少し材料を所有しています。これを対抗するため提案するプロトコルにより、dsDNA 入力サイズを 1.25 未満 ng のライブラリの準備プロセス、高スループット シーケンスと供試体の破壊のサンプリングのための必要性を最小限に抑えるのための実行可能なサンプルの範囲を拡大します。

次のプロトコルを草用に最適化されており、我々 はプロトコルことができます他の多くの植物のグループに適用されることを期待するものの、標本サンプルから別の種の何百ものテストします。低品質または珍しい標本を保存するために使用できる省略可能な回復手順が含まれています。テスト 200 以上の標本を基に、このプロトコルは、最小限の破壊的なサンプリングによって珍しい標本の保存を可能にする低組織入力と品質、標本で動作します。ここでこのプロトコルがゲノミクス ベース プロジェクトのシーケンスことができます高品質ライブラリを提供できることを示す.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 開始前に

  1. 新鮮なセチル トリメチル アンモニウム臭化 (CTAB) バッファー17 CTAB、ポリビニルピロリドン (PVP)、40 100.0 mL 1 M トリス pH 8.0、0.5 M エチレンジアミン四酸 (EDTA) pH 8.0、280.0 mL 40 mL 5 の 10 g の 20 グラムを追加することにより作る M NaCl および 400.0 mL の試薬水一緒に、水 1 L 試薬グレードを使用する合計ボリュームをもたらす。8.0 pH を調整します。
    注: 追加試薬は、各分類群の二次化合物によって CTAB を追加することができます。アレンらを参照してください。18添加試薬の徹底的なリストのため。
  2. Β-メルカプトエタノール CTAB バッファーの 5 mL あたりの 10 μ L を追加します。
    注: この 50 mL のバッチの準備ができ、3-4 週間常温保存します。
    1. 65 ° C の水浴 CTAB 溶液を加熱します。
  3. モルタルと少なくとも 20 分ミクロネジア-20 ° C を寒さ。
  4. 2 n 2 mL チューブ × 4 セットのラベル (n = サンプル数)。氷の上のラベル付きのチューブの 1 セットを置きます。
  5. イソプロパノールまたは-20 ° C のフリーザーで氷の上を冷やします。
  6. 室温 (30 分以上) に釣り合うようにし、冷蔵庫から固相リバーシブル固定 (スプリング) ビーズ (材料の表を参照) を削除します。
  7. 80% エタノールを準備します。
  8. 標本抽出のためを選択し、〜 1 cm2、または 10 mg、標本、できれば葉材料ごとの組織を取得します。

2. DNA の抽出

  1. Prechilled モルタルと乳棒を使用して事前選択された標本組織の ~ 1 cm2を挽きます。液体窒素と 30-50 mg の殺菌砂を追加します。組織に微粉末になるまで挽きます。
    注: 10 mg またはより多くの組織が望ましいですが、以下はまた、いくつかのケースできました。一度液体窒素が蒸発すると、組織は完全に地面まで必要に応じてさらに追加します。細胞や組織を破壊する別の一般的な方法は、ビーズのビーターの使用です。しかし、これらの実験で使用される標本のためによく動作しないこのメソッドが見つかりました。
  2. (管の容積の半分以上を追加) 2 つの 2 mL チューブに冷凍粉を転送します。各管に温かい CTAB 溶液の 600 μ L を追加し、徹底的に反転してボルテックス チューブをミックスします。
    注: 標本資料の質と量が低いため多くの場合、高い利回りを得ることができます 2 つの繰り返しの DNA の隔離を行います。
  3. 1-1.5 h、ボルテックス 15 分毎の 65 ° C の水浴中サンプルをインキュベートします。
  4. 10,000 x g で 5 分間遠心分離機サンプルは、上澄みをラベル付きチューブ (〜 500 μ L) の新鮮なセットに転送します。非塩素処理の標準的なプロシージャを使用してペレットを破棄します。
  5. 各管に RNase A (10 mg/mL) の 4 μ L を加え、反転やピペッティングで混ぜます。37 ° c 15 分間熱ブロックまたは水浴でサンプルをインキュベートします。
  6. チューブが部屋の温度に達したら 25:24:1 フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール混合物の等しいボリューム (〜 500 μ L) を追加します。反転および/または上下にピペッティングして徹底的にミックスします。ラベルの付いたチューブ (~ 400 μ L) の新鮮なセットを水層 (上層) 12,000 x g で 15 分間転送でチューブを遠心分離機します。塩素系廃棄物コンテナーに有機層を破棄します。
    注: ステップ 2.6 は大量の二次化合物が想定される場合に植物素材を繰り返されることがあります。
  7. 24:1 クロロホルム: イソアミル アルコール混合物の等しいボリューム (~ 400 μ L) を追加します。反転および/または上下にピペッティングして徹底的にミックスします。Prechilled のラベルが付いたチューブ (~ 300 μ L) の新鮮なセットを水層 (上層) 12,000 x g で 15 分間転送でチューブを遠心分離機します。塩素系廃棄物コンテナーに有機層を破棄します。
  8. 各チューブに prechilled イソプロパノールと 2.5 M ナトリウムのアセテートの 12 μ L の等しいボリューム (~ 300 μ L) を追加します。30-60 分のための-20 ° C でサンプルをインキュベートします。
    注: インキュベーション時間は (一晩インキュベート) まで延長することができますが、長いサンプルをインキュベート DNA の品質が低下します。
  9. 冷凍庫、遠心 12,000 x g で 15 分間でチューブを削除し、ペレットを乱すことがなくそっと上澄みを廃棄からサンプルを取る。新鮮な 70% エタノール (約 300-500 μ L) 懸濁液によって餌を洗浄します。各 2 倍のサンプルでは、エタノールを伴う 1 つに 2 つの個々 のペレットを統合します。
    注: サンプルは最初にエタノールを使用 1 つの管に連結する必要があり、進みます。エタノールで各サンプルを個別に洗浄する必要はありません。
  10. 12,000 x g で 10 分間削除でチューブを遠心し、ペレットを乱すことがなくそっと上澄みを廃棄します。空気は乾燥ペレットです。
    注: サンプルは高速乾燥熱ブロックを使用してを乾燥することができます (65 ° C を超えないように)。サンプルは過剰に乾燥しないことを確認してください、これは DNA の最終的な収量を減らすことができます。
  11. 1 x テの 50 μ L の DNA の分離を中断します。長期保存-20 ° C のフリーザーまたは次の週に使用するための 4 ° C で保存します。

3. 品質管理 (QC)

  1. 品質チェックのための agarose のゲルを実行します。
    1. ナトリウム塩、試薬グレードの水を使用して 5 L をもたらす総 54 g のトリス基地、27.5 g ホウ酸 3.75 g EDTA を追加して 1 × トリス、ホウ酸塩、EDTA (TBE) バッファーを準備します。
    2. 1 の 100 mL に 1 g アガロースを追加して 1% の agarose のゲルの準備 x TBE。Agarose が表示されないまで、ソリューションを電子レンジします。追加 0.01% 核酸ゲル染色 (材料の表を参照してください)。それは触ると暖かくなるまでフラスコを冷ます。攪拌でよく混ぜます。ゲル トレイのアガロースを注ぎ、それが固まるまでに座らせてください。
    3. 3 μ L のサンプル、試薬グレード水 2 μ L とローディングの染料 × 6 の 1 μ L を混ぜます。順序を注意してゲルのマトリックスのサンプルをロードします。
    4. 適正露出とフォーカス紫外線の下でゲル 60-70 V. イメージで 60-70 分のサンプルを実行します。
      注: クリア高分子量バンドの存在は高品質 DNA の塗抹標本は通常 DNA 分解を示します。ほとんど標本の品質が低下します。
  2. DsDNA 定量化分析を実行 (材料の表を参照) ダブルの量を決定する DNA を座礁します。
    1. 2 μ L のサンプルを使用して、分析のため。
      注: 彼らは最小量にする傾向があるので希釈は標本材料の定量分析のため必要ありません。成功したライブラリは、このステップからわずか 1.26 ng 合計 dsDNA から作られています。

4. DNA せん断

注: これは商業二本鎖 fragmentase の最適化バージョン プロトコル (材料の表を参照してください)。

  1. 3 ボルテックス後氷の上場所 dsDNA 断片化酵素 s。
  2. 0.2 mL の滅菌ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) チューブでは、ミックス 1-16 μ L は、断片化反応バッファーを伴う 2 μ L で DNA を隔離しました。ヌクレアーゼ フリー水を加えることによって 18 μ L に総量をもたらします。DsDNA 断片化酵素の渦 3 の混合物 2 μ l 添加 s。
    注: 必要な DNA の量は DNA 濃度 (管内 200 ng の目的) によって異なります。
  3. 8.5 分の 37 ° C でサンプルをインキュベートします。チューブに 0.5 M の EDTA の 5 μ L を追加します。
    注: この手順は、潜伏期間は上の反応を終了し、過剰剪断からの DNA のサンプルを防ぐためできるだけ早く実行する必要があります。

5. ビーズのクリーンアップ

  1. ボルテックス SPRI ビーズを均質化します。
  2. ヌクレアーゼ フリー水の 25 μ L を追加することによって 50 μ L にせん断の DNA 量をもたらします。上下にピペッティングして徹底的にせん断の DNA とミックスの 50 μ L に室温 SPRI ビーズ (90% ボリューム) の 45 μ L を追加します。
    注: 合計サンプル ボリュームの 90% でビーズを追加頻繁に以下 200 塩基対の DNA 断片の最小を削除する実行されます。
  3. サンプルをインキュベート 5 分磁気プレートにチューブを入れて、慎重に 5 分間座らせてみましょうを削除し、上清を捨てます。
    注: 目的の DNA ターゲットを含んでいるので、ビーズを邪魔しないように注意。
  4. 一方、マグネット スタンド チューブに新鮮な 80% エタノール 200 μ L を追加します。30 室温で孵化させなさい s とし、慎重に削除、上澄みを廃棄します。この手順をもう一度繰り返します。空気は、そのふたを開くとマグネット スタンドにチューブがあるとき 5 分ビーズを乾燥させます。
    注: は、ビーズを過乾燥を避けてください。これは DNA の低い回復につながります。
  5. 磁石からチューブを取り外します。0.1 x テの 55 μ L にビーズから DNA を溶出し、上下にピペッティングして徹底的にミックスします。マグネット スタンドに 5 分位チューブの室温でインキュベートし、有効にするソリューションを待つオフ (~ 2 分)。
  6. 上澄みの 52 μ L をやってのけます。回復とライブラリの準備に入る最初の濃度をチェックするサンプルの DNA 定量分析を実行します。
    注: ライブラリは 1.25 未満と推定される合計 dsDNA で作られている ng、しかし各場合 reamplification が必要でした。

6. ライブラリの準備

注: これは市販ライブラリ キットの修正バージョン (材料表プロトコルを参照してください)。

  1. 最後の準備
    1. エンドヌクレアーゼと尾行酵素、リン酸 3 μ L と 7 μ L 反応バッファーを洗浄、せん断された DNA の 50 μ L に付属の追加します。上下にピペッティングして徹底的にミックスします。スピン泡を削除するチューブ。
      注: 合計量は 60 μ L をする必要があります。
    2. 次のプログラムでたちにサンプルを配置: 20 ° C、65 ° C で 30 分で 30 分、4 ° C で押し
      注: 加熱蓋は 75 ° C に設定されました。
  2. アダプター結紮
    1. アダプターを 25-50 倍希釈 (作業アダプター濃度 0.6 – 0.3 μ M)。チューブに結紮術マスター ミックスの 30 μ L、結紮エンハンサーの 1 μ L と 2.5 μ L 高スループット短い読み込みシーケンスのためのアダプターを追加します。
      注: 合計ボリュームは、93.5 μ L をする必要があります。
    2. 上下にピペッティングして徹底的にミックスします。スピン泡を削除するチューブ。20 ° C 15 分でチューブを孵化させなさい。
    3. ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG) と DNA グリコシラーゼ リアーゼ エンドヌクレアーゼ VIII の商業の混合物の 3 μ L を追加 (材料の表を参照してください)、チューブに。確実に 96.5 総量 μ。 徹底的に混ぜると、たちを使用して 15 分の 37 ° C で孵化させなさい。
      メモ: 蓋は ≥47 ° C に設定する必要があります。商業プロトコルの元のバージョンはアダプター結紮手順の最後のステップとしてビーズ クリーンアップ続いて後のサイズ選択。高い利回りを実現するには、このプロトコルはこれらの手順の順序を切り替えます、最後のステップとしてサイズの選択を実装します。
  3. 酵素と小さな断片を削除するクリーンアップ
    1. ボルテックスによって磁気ビーズを均質化します。
    2. SPRI 磁性ビーズ (80% 容積) の 78 μ L を加え、ピペッティングを上下で徹底的に混ぜます。
      注: 合計サンプル ボリュームの 80% でビーズを追加 250 塩基未満が多い小さい DNA のフラグメントを削除する実行されます。小さな DNA 断片のより厳格な除去は、(i) 余剰アダプターを削除し、(ii) 次の手順でより大きな断片の増幅を強調することです。
    3. サンプル間インキュベート 5 分入れて 5 分磁性体板上にチューブは慎重を削除し、目的のサイズの範囲外の DNA が含まれている上澄みを廃棄しましょう。
      注: 目的の DNA ターゲットが含まれているビーズの邪魔にならないように気をつけてください。
    4. 一方、マグネット スタンド チューブに新鮮な 80% エタノール 200 μ L を追加します。30 室温で孵化させなさい s とし、慎重に削除、上澄みを廃棄します。この手順をもう一度繰り返します。磁気スタンド オープンふた付けのチューブは、空気乾燥 5 分のビーズです。
      注: は、ビーズを乾燥させる上避けてください。これは DNA の低い回復につながります。
    5. 磁石からチューブを取り外します。0.1 x テの 17 μ L を追加することによってビーズから DNA ターゲットを溶出し、上下にピペッティングして徹底的にミックスします。
    6. マグネット スタンドに 5 分位チューブの室温でインキュベートし、有効にするソリューションを待つオフ (~ 2 分)。
    7. 上澄みの 15 μ L をやってのけます。
  4. PCR の拡大
    1. 洗浄アダプター結紮 DNA の 15 μ L に忠実度の高い PCR マスター ミックスの 25 μ L、高スループット短いリード シーケンス ライブラリ準備 5' プライマーの 5 μ L、5 μ L、高スループット短い読み込みシーケンス ライブラリ準備 3' プライマーを追加します。
      メモ: 容量 50 μ L をする必要があります。
    2. ボルテックスでよく混ぜます。表 1にある設定を使用してたちにサンプルを配置: たちの増幅の設定。
      注: サイクル数が多い低入力 DNA 量のため必要です。
サイクルのステップTemp。時間サイクル
初期変性98 ° C30 s1
変性98 ° C10 s12
焼鈍/拡張機能65 ° C75 s12
最終的な拡張65 ° C5 分1
ホールド4 ° C

表 1: PCR プロトコル変性、アニーリング、および拡張の時間そして温度。温度と時間は、このプロトコルで試薬を最適化しました。場合は試薬を変更すると、温度、時間もう一度最適化する必要があります。

  1. 必要なライブラリのサイズのサイズの選択
    注: このビーズ ステップ対象範囲の上下両方のフラグメントが削除されます。
    1. ボルテックス SPRI ビーズを均質化します。
    2. 室温磁気ビーズを 25 μ l 添加 (50% 容積) と上下にピペッティングして徹底的にミックスします。サンプルをインキュベート 5 分磁気プレートにチューブを入れて、慎重に 5 分間座らせてみましょう削除し、上清をラベル付きチューブの新しいセットに転送します。
      注: このボリュームは必要なライブラリのサイズに基づいて調整することができます。上清には、希望するサイズの DNA のフラグメントが含まれています。最初のビーズ インキュベーションでビーズ バインド ライブラリ フラグメントが大きい。これらは 400-600 塩基対の範囲のそれらに集中する削除されます。上清より小さいフラグメントが含まれています。
    3. 上下にピペッティングして徹底的に上清とミックスに室温 SPRI ビーズ 6 μ L を追加します。サンプルをインキュベート 5 分磁気プレートにチューブを入れて、5 分間座らせてみましょう。
      注: このボリュームは 6.5.2 の手順に従って必要なライブラリのサイズに基づいて調整することができます。
    4. 慎重に削除し、上澄みを廃棄します。
      注: 目的の DNA が含まれているビーズの邪魔にならないように気をつけてください。2 番目のビード インキュベーション フラグメントの最大の DNA の初期の除去後に残った断片にビーズをバインドしています。この一連のフラグメントは通常目的のサイズの範囲内です。
    5. 一方、マグネット スタンド チューブに新鮮な 80% エタノール 200 μ L を追加します。30 室温で孵化させなさい s、慎重を削除し、上清を捨てます。手順を繰り返します。磁気スタンド オープンふた付けのチューブは、空気乾燥 5 分のビーズです。
      注: は、ビーズを過乾燥を避けてください。これは DNA の低い回復につながります。
    6. 磁石からチューブを取り外します。0.1 x テの 33 μ L にビーズから DNA ターゲットを溶出し、上下にピペッティングして徹底的にミックスします。
    7. マグネット スタンドに 5 分位チューブの室温でインキュベートし、有効にするソリューションを待つオフ (~ 2 分)。ストレージ (材料表参照) 2 mL チューブに上清および転送の 30 μ L をやってのけます。
      注: ライブラリは、長期保存のための-20 ° C で保存できます。
  2. 品質コントロール
    1. DNA ライブラリの品質管理テストを実行します。3.1 と 3.2 の手順を参照してください。
      注: DNA ライブラリの 96 V ~ 45 分のためのゲルを実行します。
  3. Reamplification ライブラリ: ライブラリの量が十分ではない場合は省略可能。
    注: サンプル ライブラリ濃度 10 以下 nM は、次の手順を使用して reamplified することができます。低濃度ライブラリの reamplification は、シーケンス処理のため実行可能な結果を実現できますが、reamplification 収集示唆 (表 3) は、特定のメトリックのごくわずかであるにもかかわらず、基本組成多様性のささやかなシフトを引き起こす可能性があります。.
    1. 10 倍 0.1 x TE を使用して普遍的な reamplification プライマーを薄くしなさい。
    2. 低濃度ライブラリの 15 μ L に忠実度の高い PCR マスター ミックスの 25 μ L、プライマー希釈ユニバーサル reamplification 1 (AATGATACGGCGACCACCGA) の 5 μ L、希薄化後の普遍的な reamplification プライマー 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA) の 5 μ L を追加します。メモ: 容量 50 μ L でする必要があります。
    3. ボルテックスでよく混ぜます。表 1にある設定を使用してたちにサンプルを配置: たちの増幅の設定
      注: 多くのサイクル数は入力 DNA の量が少ないため必要です。
    4. ビーズのクリーンアップ
    5. ボルテックス SPRI ビーズを均質化します。室温 SPRI ビーズ (90% ボリューム) の 45 μ L を追加し、上下にピペッティングして徹底的に混ぜます。
    6. 5 分間磁気プレートにチューブを入れて 5 分間インキュベート サンプルを聞かせてください。
    7. 慎重に削除、不要な DNA を含む上清を捨てます。
      注: 目的の DNA ターゲットが含まれているビーズの邪魔にならないように気をつけてください。
    8. 一方、マグネット スタンド チューブに新鮮な 80% エタノール 200 μ L を追加します。30 室温で孵化させなさい s、慎重に削除し、上清を捨てます。この手順をもう一度繰り返します。
    9. 空気は、そのふたを開くとマグネット スタンドにチューブがあるとき 5 分ビーズを乾燥させます。
      注: は、ビーズを過乾燥を避けてください。これは DNA ターゲットの低い回復につながります。
    10. 磁石からチューブを取り外します。0.1 x テの 33 μ L にビーズから DNA ターゲットを溶出し、上下にピペッティングして徹底的にミックスします。
    11. マグネット スタンドに 5 分位チューブの室温でインキュベートし、有効にするソリューションを待つオフ (~ 2 分)。
    12. 上澄みの 30 μ L をやってのけます。ライブラリは、長期保存のための-20 ° C で保存できます。
  4. 品質コントロール
    1. DNA ライブラリの品質管理テストを実行します。3.1 と 3.2 の手順を参照してください。DNA ライブラリー 96 V ~ 45 分のためのゲルを実行します。
      注: 場合はゲルの二重バンドを見ると、これはおそらく reamplification ステップからプライマー枯渇の結果。バンドは、6.9 の繰り返しが表 1に描かれている PCR プログラムで 1 つだけのサイクルを使用して削除できます。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA の隔離および最終的なライブラリ収量
本研究では 1920 年からの最も古いと 2012 年 (表 2) から最年少 50 の異なるサンプルを使用して標本の DNA の分離および高品質シーケンス ライブラリの回復用のプロトコルの有効性を示した.各サンプルは、葉の組織の約 10 mg は DNA の隔離に使われました。場合は、環境に優しい葉組織が支持され、明らかなカビ汚染と組織が選択されていません。成功の分離は、収量が低くなるはずに黄色や茶色のティッシュを使用して行うことが。合計二重らせん DNA (dsDNA) 3.56 から最初の分離から 2,610 に ng ng。予想通り、標本から得られた DNA は著しく低い (図 1 a図 1カスタマーインフォメーション センターの障害)。酵素せん断 (1.26-464 ng) の分離の部分が使用さ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで提示されたプロトコルは、DNA の隔離および植物の乾燥標本からのライブラリの準備をシーケンス処理の包括的かつ堅牢な方法です。メソッドとそれを変更する必要は最小限の一貫性は、それは大規模な標本に基づくシーケンス プロジェクトのスケーラブルな標本の品質確認に基づいています。低降伏点ライブラリのオプション reamplification ステップを含めることは、低品質、低量、珍しい、またはシーケンスに適していないなる歴史的に重要なサンプルの包含をことができます。

初期 DNA の収穫の重要性
標本由来 DNA 劣化初期試料保存11検体の DNA と結果として 300 年以上古い歳31の数千に数百を動物の遺体から分離された DNA として劣化とされて,32します。 その結果、初期 DNA 収量の最適化成功シーケンス ライブラリの準備のため十分な高品質 dsDNA の取得で重要であり...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、彼らが競合する利益あるを宣言します。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

破壊的なサンプリングの標本へのアクセスのためのミズーリの植物園とサンプリング標本、援助のクリスティーナ Zudock ヨルダン Teisher、テイラー AuBuchon-高齢者を感謝いたします。この作品は全米科学財団 (DEB-1457748) からの助成金による支援です。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Veriti サーマルサイクラーApplied Biosystems445230096 well 
ゲルイメージングシステムAzure Biosystemsc300
Microfuge 20 SeriesBeckman CoulterB30137
Digital Dry BathBenchmark ScientificBSH1001
Electrophoresis SystemEasyCastB2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water)ELGA 89204-092
DNA LoBindチューブ エッペンドルフ301080782 ml
ミニ遠心分離機フィッシャー サイエンティフィック12-006-901
ボルテックス ジーニー 2フィッシャー サイエンティフィ12-812
モルタルフィッシャー サイエンティフィS02591磁器
乳棒フィッシャー サイエンティフィックS02595磁器
遠心チューブフィッシャー サイエンティフィック 21-403-161
マイクロ波ケンモア405.7309231
Qubit アッセイチューブInvitrogenQ32856
0.2 ml PCR 用ストリップチューブとキャップVWR20170-004
Qubit 2.0 蛍光光度計InvitrogenQ32866
天びんメトラー・トレドPM2000
液体窒素 短期保存NalgeneF9401
マグネティックリングスタンド サーモフィッシャーサイエンティフィック AM1005096井戸 
水浴室VWR89032-210
の熱い版の攪拌機VWR97042-754
液体窒素の空気ガスUN1977
1 X TEの緩衝液AmbionAM9849pH 8.0
CTABAMRESCO0833-500G
2-MERCAPTOETHANOLAMRESCO0482-200ML
のリボヌクレアーゼAAMRESCOE866-5ML10 mg/mL 溶液
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63882
塩化ナトリウムバイオ WORLD705744
イソプロピルアルコールバイオ WORLD40970004-1
ヌクレアーゼフリーウォーターバイオ WORLD42300012-2
イソアミルアルコールフィッシャーサイエンティフィックA393-500
酢酸ナトリウム三水和物フィッシャーサイエンティフィックs608-500
LE アガロースGeneMateE-3120-500
100bp PLUS DNA ラダーゴールド バイオテクノロジーD003-500
EDTA、二ナトリウム塩IBI サイエンティフィックIB70182
量子ビット dsDNA HS アッセイキットライフサイエンスQ32854
TRISMP Biomedicals103133ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X)New England BioLabsB7024S
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BioLabsM0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabsE7645L
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNew England BioLabsE7600SDual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master MixNew England BioLabsM0543L
Mag-Bind RXNPure PlusOmega bio-tekM1386-02
GelRed 10000 XPheonix Research41003-1
フェノール溶液SIGMA ライフサイエンスP4557-400ml
PVP40SIGMA-AldrichPVP40-50G
クロロホルムVWR EM8.22265.2500
エタノールKoptecV1016200 プルーフ
シリカ砂VWR14808-60-7
再増幅プライマー統合 DNA テクノロジー本文参照
シーケンチャーv.5.0.1GeneCodes
ック ック

References

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