堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Saman Saeidi; Michael R. McKain; Elizabeth A. Kellogg

doi:10.3791/56837

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方法論記事

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループットシーケンスライブラリーの構築

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DOI:

10.3791/56837

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2018年3月8日

Saman Saeidi^*¹ , Michael R. McKain^*¹^,² , Elizabeth A. Kellogg¹

¹Donald Danforth Plant Science Center, ²Department of Biological Sciences, The University of Alabama

^* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、DNA の隔離及び非常に質の悪い DNA の救助を含む標本材料から高スループットシーケンスライブラリ構築のための詳しいプロトコルを示します。

要約

標本は、さまざまな生物学的研究で使用できる植物材料の非常に貴重な源です。標本の使用はサンプル保存品質、劣化 DNA、珍しい標本の破壊的なサンプリングを含む課題の番号に関連付けられます。効果的に大規模なプロジェクトの標本材料を使用、するために DNA の分離およびライブラリの準備の信頼性と拡張性の高い方法が必要です。本稿は、DNA 分離、高速ライブラリ構築に標本から個々のサンプルの変更を必要としない堅牢で、始めから終わりまでプロトコルを示します。このプロトコルは、組織研削、ライブラリサイズ選択を変更して低収量ライブラリのオプション reamplification ステップを導入することを最適化することにより従来の低品質の乾燥植物素材とを利用に合わせて調整します。低収量 DNA ライブラリの reamplification は、かけがえのない、潜在的に貴重な標本、追加破壊サンプリングし、共通認識できるシーケンスバイアスを導入することがなく、必要性を否定することから派生したサンプルを救うことができます。系統のアプリケーション。プロトコル数百草種でテストされていますが確認後他の植物の系統での使用に適応します。このプロトコルは、フラグメントは目的のサイズの範囲では存在しない、非常に低下した DNA ときれいな DNA 分離を抑制する二次代謝産物いくつかの植物材料の存在によって制限することができます。全体的に、このプロトコルは DNA の隔離と最小限の変更でアクティブなハンズオンタイムの 8 時間だけで 13 h 未満の 24 サンプル調製されたライブラリでは、高速かつ包括的な方法を紹介します。

概要

標本コレクションは、種と系統¹^,²^,³, 集団遺伝学⁴^,⁵, 保全を含む研究のためのゲノムの多様性の両方の可能性がある貴重な情報源生物学⁶、外来種生物学⁷、および形質進化⁸。種、人口、地理的な場所、タイムポイントの豊かな多様性を取得する機能は、標本は、「宝箱」⁹を強調表示します。歴史的に、標本由来 DNA の劣化した自然が多い領域の葉緑体ゲノムや、リボソームの内部転写スペーサー (ITS) などの高いコピー内で見つかったマーカーのみを使用する研究者を追いやって、PCR ベースのプロジェクトを妨げています。RNA。標本と DNA の品質によって異なります広く保全⁹^,¹⁰二本鎖切断と損傷の最も一般的な形であること、作成の乾燥工程で使用される熱から断片化の手法、いわゆる 90 %dna ロックアップ PCR ベースの研究