このプロトコルでは、目の動きの運動を測定するため体外に分離されたカメ頭の準備を使用する方法について説明します。頭蓋から脳を除去した後回転目と瞳孔径の変化を定量化する電流脳神経を刺激することができます。
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この記事について
サマリー
要約
動物を安楽死させた後死ぬこと彼らの組織を始めます。温血脊椎動物と比べると、カメは彼らの組織の長期生存時間のため利点を提供しています。このため、彼らのターゲットの行動の神経信号を調査する時間の延長期間のカメでの in vitro実験を実行できます。分離ヘッド準備を使用して、カメ、眼球運動の運動を測定したし、脳神経によって運ばれる電気信号によって彼らの変調。脳が頭蓋骨から削除されたり、脳神経のインスタンスはそのままにして、この切り裂かれた頭は眼球運動を調整するジンバルに置かれました。ガラス電極は、脳神経に接続されていた (眼球運動, 滑車神経, と外転)、眼球運動を喚起する電流で刺激。赤外線ビデオ システムと目の定量化された回転を追跡眼球運動を監視しました。電流パルス振幅、周波数の範囲と、電車の時間が応答に及ぼす影響を観察するために使用されました。準備は脳から切り離されているため筋ターゲットに遠心性経路を一元的に処理された感覚情報の欠如の神経シグナリングを調査する単独で調べることができます。
概要
電気生理学的実験ではミシシッピアカミミガメ カメを使用するための理論的根拠:
ミシシッピアカミミガメ カメ (Trachemys scripta elegans) の世界の最悪の侵略的な種の1つと考えられ、生態系が困っていることを示すことができます。ミシシッピアカミミガメ カメが成功した理由はよくわかっていないが、その耐性の生理と低酸素の条件2,3,4 の下で生き残ることができる神経組織の所有物のための一部ことがあります。.実験は自分の番号を脅かすことはない、最小限の努力、電気生理学的製剤残ることができる実行可能な拡張の期間、18 時間5,6限り上を使用します。メリットは、これも酸素8の低レベルに耐える能力を持っているザリガニ7など無脊椎動物の動物を使用する利点に似ています。
眼球運動の測定方法:
ヒト以外の霊長類を用....
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プロトコル
注: ミシシッピアカミミガメ カメ、両方の男性と女性は、ベンダーから購入しました。カメは、250 W の赤外線ライトの下で日光浴のためレンガ諸島装備 2 つの 60 ガロン浴槽を含む暖かい動物スイートで収容されました。環境は 22 ° C で水の温度を 14/10-h 明暗サイクルで維持されていましたライトは、6:00 時にオンにされ、オフに 20:00。毎週、きれいになったフィルタ リング システム搭載タンク、カメは一日おき、自由を与えられました。ミシシッピアカミミガメのカメし、次の実験手順説明ここで32,33のすべてが施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ラファイエット大学によって承認されました。
1. 機器のセットアップ
- 亀リンゲル液を準備します。この順序で蒸留水に以下を追加します: 塩化ナトリウム 96.5 mM (58.44 g/mol)、塩化カリウム 2.6 mM (74.56 g/mol)、塩化マグネシウム 2.0 mM (203.31 g/mol)、重炭酸ナトリウム 31.5 mM (84.01 g/mol)、ブドウ糖 20.0 mM (180.16 g/mol)、集中7.51、塩化カルシウム 4.0 mM (110.98 g/mol) と pH 調整に塩酸 (材料の表
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結果
図 1は、解剖を説明するビデオから撮影した画像の静止画を示しています。画像は、前に切断し、脳からの神経の代表的な場所を提供します。
図 1: 解剖のビデオからキャプチャしたイメージの (nII) 視神経、動眼神経 (nIII)、滑車神経節 (nIV) および外転神経 (nVI) の位置を表示する静止画.(A) イメージ脳、髄膜を除去した後のラベルの付いた領域を持つ。白のスケール バー = 10 mm。 (B) ショーの画像の場所新居、nIII、そしてわたし (後大脳の嗅球の除去)、中脳の右側に接続します。(C
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ディスカッション
重要なステップ:
このプロトコルの中で重要な手順次のとおりです: 1) 解剖および切断の神経の生存を維持するために取られる心配2) 一貫した応答を提供するために脳神経に吸引電極によるサイズのマッチング・ 3) の目の回転の適切な校正を提供するジンバル ヘッドの配置。
トラブルシューティング。
解剖は、挑戦することができますが、それを完了すると、数回、手順必要があります比較的まっすぐになります。神経応答のない場合は、最も可能性の高い原因は、解離障害です。脳の削除中にのみ最小限の張力および圧力の切削時に神経に適用するべき。金属製の手術器具で、神経に触れることも避けるべき、できるだけしのでガラス フックとプラスチックの鉗子、代用できます金属ツール トラブル34が持続する場合。亀組織は、焼きたての酸素の使用の変数のレベルを生き残るために能力を持っている亀リンゲル液バブル 95/5% O2/CO2冷蔵お.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者は、夫人ポーレット ・ マッケナと秘書のサポート、この研究ではリサ Pezzino 氏フィル アウエルバッハをテクニカル サポートありがちましょう。著者も培養で分離されたヘッド準備にご紹介夫妻マイケル アリエルとマイケル ・ s ・ ジョーンズ (セントルイス大学医学部) に感謝します。この共同作業のサポートのための資金は、ラファイエット大学で神経科学プログラム、学術研究委員会生物学科 (ロバート ・ s. チェイス基金) によって提供されました。最後に、この作品は 2016 年 9 月 28 日に亡くなった氏フィル アウエルバッハに捧げられて彼は走査型電子顕微鏡を使用停止し、このプロトコルで使用するため、5 軸ステージの有用性を認識しました。彼の友情と機知を大幅に惜しまれるでしょう。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アカミミガメ | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | 大型(甲羅長15-20cm) |
| 塩化ナトリウム | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
| 塩化カリウム | Sigma-Aldrich Co., LLC. | P5405 | |
| マグネシウムチョライド | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
| 重炭酸ナトリウム | Sigma-Aldrich Co., LLC. | S5761 | |
| キストロース | シグマ-アルドリッチ株式会社LLC. | C5767 | |
| 濃塩酸 | Sigma-Aldrich Co., LLC. | H7020 | |
| 塩化カルシウム | Sigma-Aldrich Co., LLC. | C7902 | |
| pHメーター | オークトン | pH 6+ | |
| 吸引刺激電極 | A-M Systems | 573000 | バイポーラ吸引電極。573000 は 573050 に置き換えられていることに注意してください。 |
| キャピラリーガラス | A-M システム | 626000 | マイクロフィラメントなしのシングルバレルホウケイ酸キャピラリーガラス、長さ 10 cm、外径 1.0 mm、内径 0.50 mm |
| 代替吸引刺激電極 | A-M システム | 573050 | バイポーラ吸引電極。大口径の毛細管ガラスが必要:627000、外径1.2mm、内径0.68mm |
| ステレオスコープ | Lieca | GZ7 | 倍率範囲、10倍 – 70倍 |
| 光ファイバー光源 | Amscope | HL250-A | 150W 光ファイバー顕微鏡イルミネーターライトボックス |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | ステンレス鋼、ストレートスプリング、5.25インチ |
| 鈍い解剖プローブ | カロライナバイオロジカルサプライカンパニー | 627405 フーバーモールプローブ、ダブルエンドプローブとシーカー、6インチ | |
| マイクロハサミ | カロライナバイオロジカルサプライカンパニー | 623555 | アイリスマイクロ解剖ハサミ、ステンレス鋼、0.5インチブレード、4.75インチ長 |
| ファイン鉗子 | Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | ジュエラーズ鉗子、デュモンNo.5、イノックス合金、4.25インチ |
| 湾曲鉗子 | Sigma-Aldrich Co. LLC。 | Z168696 | ミディアムチップ、湾曲した鉗子、ステンレス鋼、4 " |
| メスハンドル | Sigma-Aldrich Co. LLC。 | S2896 | メスハンドル、No.3、ステンレス鋼 |
| メスブレード | Sigma-Aldrich Co. LLC。 | S2771 | の刃、No.11、鋼鉄 |
| ギロチン | ハーバード装置 | 73-1918 | ネギロチンタイプ7575 |
| ら | シグ | マZ648299 | マイクロスプーンとヘラの計量セット。小さなヘラを使用:5.9インチ長い x 0.07"スクエアエンドの直径ハンドル:0.17インチx 1.3インチ長い、他の端のラウンド:0.17 "x 1.27インチロング |
| フック | Autozone98069SureBilt | フックとピックセット。グラインダーを使用してフックの鋭い先端を鈍くし、動物の口への損傷を防ぎます。 | |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% 二酸化炭素バランス 酸素認証標準ガス混合物、サイズ 200 シリンダー、CGA-296 |
| レギュレータ | エアガス株式会社 | Y11244D296-AG | 単段真鍮 0-100 psi 分析シリンダーレギュレーター CGA-296 針出口付き。真ちゅう製の調整可能なエアラインパイプバルブを使用して、内径3/8インチ、レギュレーターに接続されたビニールエアラインチューブから3/16インチ、エアストーンまたはガラスパスツールピペットへのエアライン接続に移動します。 |
| 調整可能なエアラインパイプバルブ | ドクターズ・フォスター&スミス | CD-12061 | 真鍮製バルブ |
| 硬質テーブル | 不明 不明 | 頑丈な | テーブルの上に敷設されたオートクレーブドア。直径5インチのテニスボール9個がテーブルの上面から振動を遮断します。 |
| 5インチテニスボール | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: ボールはスライスされず、オートクレーブ ドアの下側にある一体型フレーム内に保持されます。 |
| 代替除振テーブル | ニューポートコーポレーション | INT1-36-6-N | 硬質振動制御システム、完全性 1: 表面寸法、3' x 6' |
| ジンバル | ISI、International Scientific Instruments, Inc. | SUPER III-AスキャニングEM5 | 軸ユーセントリックステージからのステージ:X、Y、Zの直線運動、±20 mm、0.1 mmの精度。回転、垂直、およびプラス。10°、および水平、±12.5°C、1.25°C;精度。注:デコミッション機器から。 |
| ジンバル用チャック | 不明 製造不明の古いミクロトームから、スキャニングEMステージ | ||
| 代替ジンバル | ThorLabs, Inc. | GN2/M with MBT602/M | 3軸マイクロブロックステージに搭載された蝶ネジアジャスター付(MBT602/M)2軸ゴニオメーター(GN2/M):ゴニオメーター上面12.7mm(回転点までの距離)に亀の頭を目で保持するチャックを設計 |
| ベースのアイトラッキングシステム | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker、PC-60 | 追跡方法:暗い瞳孔による赤外線ビデオ。白黒カメラ(アイテムBC02):30 Hz、640 x 480;システム要件:Windows 2000、XP、7、8、8.1、10;視認範囲:水平+/- 44°;垂直 +/- 20°;精度 ~0.5°;空間分解能 ~0.15°;瞳孔サイズ解像度 ~0.03 mm;目のデータ:視線のX、Y位置、瞳孔の高さと幅、ねじれ、デルタ時間、合計時間、および関心領域(ROI)。リアルタイム通信(アイテム0022):データファイルにコードをマークするための8つのTTL入力チャネルを備えた4チャンネルAnalogOut |
| ポジション磁気ベース | Harbor Freight Tools | Pittsburg、アイテム#5645 | 磁気ホルダーは最大12インチに達し、45ポンドの磁気プルを生成します。カメラの位置に使用します。ロッドの端にネジ穴を開けて、カメラを取り付けます。 |
| マイクロマニピュレーター | Kopf | 900 | 5軸マニピュレーション 吸引電極のマウント用:X、Y、Zリニアトラベル、2軸回転 |
| ブームの解剖スコープ | Lieca | GZ6 | 倍率範囲、6.7倍 – 40倍 |
| 神経/筋肉刺激装置 | Astro-Med Grass テレファクター | グラス S88 | デュアルパルス電圧刺激装置:2つの出力チャンネルを独立して動作させることも、同期させて非絶縁定電圧パルス(10 mv〜150 V)も生成できます。パルスは単一(10 μsec から 10 sec)、反復 (0.01 Hz から 1 KHz)、およびトレイン (1 ms から 10 秒) で、TTL 入力と出力と同期しています。DB25コネクタの出力チャンネルを介してTTL出力をViewPoint EyeTrackerのTTL入力チャンネルに送信します。注:Astro-Med Grass Telefactorは販売を終了しました。 |
| 電流遮断装置 | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | 電流刺激遮断ユニット:S88による定電流の安全な供給を可能にします。PSIU6は、BNCケーブルでS88の出力チャンネルの1つに接続します。PSIU6の乗算器スイッチにより、S88は0.1〜マイクロの範囲の幅広い電流振幅を生成できます。Aから15mA。 |
| A-Mシステム | 2100 | 代替神経/筋肉刺激装置 | :ユニットには、一定の電流を生成するためのアイソレータが内蔵されています。 |
参考文献
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-42....
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