方法論記事

ポータブル リアルタイム PCR を用いた土壌伝染性植物の敷地内の分子の検出

DOI：

10.3791/56891

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2018年2月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, Washington State University, 2Parma Research and Extension Center, University of Idaho

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

植物病原体敷地内、特に土壌媒介病原菌の迅速かつ正確な検出は、さらに菌の生産やフィールドで植物の病気の拡散を防ぐために重要です。ここ携帯用リアルタイム PCR 検出システムを用いた手法は、圃場条件下でのオンサイト診断できます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

植物病のオンサイト診断は、病気の影響を軽減疾患マネジメント戦略の以前の実装を有効にするタイムリーな意思決定のための生産者のための便利なツールをすることができます。ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、多く診断研究所で現在特にリアルタイム PCR、植物病原体検出の最も敏感で正確な方法であります。ただし、実験室の Pcr は、通常高価な実験装置と優秀な人材が必要です。本研究では、ジャガイモの土壌病原菌を使用敷地内の分子検出の可能性をデモンストレーションします。これは、磁気ビーズを用いた核酸抽出、携帯用リアルタイム PCR (蛍光プローブを用いた測定) の迅速かつ簡易なプロトコル構成を使用して達成されました。ポータブル リアルタイム PCR のアプローチは、実験に基づくシステム,検出からの DNA の 100 冊ほどと遜色のない粉状。ここで開発した携帯用リアルタイム PCR 法は、実験室ベースのアプローチおよび病原体診断の有用なオンサイトのツールに代わるものとして使用できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

原因となる病原体の正確かつ迅速な同定大幅病害管理に関する決定に影響を与えます。土壌病害、特に土壌環境は工場大量と複雑になり、土壌伝染性病害のすべての側面を理解する課題に比べて非常に大きいために、診断が困難です。また、土壌伝染性病害無病徴感染初期、環境ストレスに依存でき遅延診断1長の潜伏期間があります。土壌病原菌の多くは、特殊な胞子や melanized の菌糸は、そのホストの不在でも長年にわたって土壌で生き残ることができるなどの生存構造を開発しました。土壌病害管理の活用方法もあります: 既知の出没するフィールドを回避、病原体フリー認定種苗を使用して、機器を衛生的に維持する、土壌と水の可能な場合の動きを制限します。分子検出戦略を通じて病原体の存在の知識も早期治療に関するタイムリーな決定を知らせることによって有益な役割を再生したりフィールドの評価をあらかじめ植物します。オンサイト テストの多分いくつかの距離離れてまた従事できること栽培場合はそのような診断は診断研究室にサンプルを送信することがなく迅速な結果を提供する付加的な利点は、彼らの存在の 'フィールド側' を実行を提供します。

分子の検出、感度、特異性、堅牢性 (再現性と再現性)、効率に基づくオンサイト診断 (すなわち。、シンプルさとコスト パフォーマンス) の考察のための重要な要素。横方向フロー デバイス (LFDs) の Immunostrip や PocketDiagnostic など、ワンステップの試金としてそのシンプルさのため敷地内の病原体検出のための一般的な方法。ただし、LFDs できない場合がありますすべての状況で正しい診断ツール、感度と特異性を欠いている場合対象病原体は低濃度で、類似種や属と交差反応することができます時折あいまいな結果を提供します2。 ループ lamp 法 (ランプ) は、オンサイト病原体検出の適用も、低コストの試薬、反応条件を一定に保つこと、簡単な比色視覚的な分析のため特に高価ではないです。ただし、LFDs とランプが通常使用質的より高価な機器3定量的両方のアプローチを使用できますがします。ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) では、検出の上記の方法と比較して定量性、高感度、高い特異性を提供しています。従来の研究室での PCR の技術はしかし、敷地内の目的のための検出方法としてこの技術を採用することの主な欠点である高価な実験装置と、優秀な人材に必要です。

このプロトコルでは、オンサイト診断法携帯用リアルタイム PCR 機器が示されています。リアルタイム PCR の技術の定量的精度、感度、および汎用性の面で他の方法上の利点を提供しています、広範な植物病原体4、5など各種の検出のため広く使用されていますジャガイモの土6の病原体。急成長、競争力のある市場の最近の動向のため PCR の技術の必要な機器よりコンパクトで安価7へと成長を続けています。プロトコルは、次の手順で構成されます: 磁気ビーズを用いた核酸抽出、携帯用リアルタイム PCR (蛍光プローブを用いた測定)、および定量データ分析を行うことができますすべてのラップトップ コンピューター (図 1) を使用してリモートで。

ここで開発した携帯用の PCR のプロトコルを使用して、土壌伝染性病原体、粉状を検出する土壌試料を分析しました。粉状そうかは、粉状そうか病8の因果剤として重要なジャガイモの病原体である選ばれました。最近十年間、この病気の存在は、ジャガイモが9,10を栽培されて多くの地域に広まっていると見なされます。塊茎に病変のようなにきびの存在を介しての粉状そうか病は、ジャガイモ栽培にかなり質的歩留まり損失を引き起こす可能性が。さらに、米ジャガイモはジャガイモ モップ トップ ウイルス (PMTV)、塊茎 (塊茎褐色輪紋として知られている)11,12の内部巣症状を引き起こす可能性をベクトルすることができます。したがって、 s. 根が6を植栽する前にフィールドに存在を知ることが重要です。またこのプロトコルのイネ紋枯病菌の検出の有用性を示す吻合グループ 3 (AG3) と PMTV。イネ紋枯病菌のいくつかの菌糸融合群は、ジャガイモの病気を引き起こすが、AG3 は間違いなく最も重要な世界的な13幹腐病と黒あざの 30% までの可販収量の損失の結果を引き起こしている14。PMTV 一般ガストンネルに呼ばれる塊茎内壊死性病変が発生します。このウイルスは、この重要なジャガイモ産地の栽培者への関心の高まりの最近初めて、太平洋岸北西部15,16,17、いくつかの州で報告されています。これらの重要な疾患のポータブル PCR の有効性を決定する、に加えて最適な DNA 抽出方法と土壌サンプル サイズも本研究で検討しました。

ポータブルの PCR 法は異なった病原体の検出に対応して汎用性の高いことが示唆されました。現場検知法を開発した農業に様々 な選択や、回転などの疾病管理に関する以前の決定 (例えば栽培) で現場の労働者を許可し、サンプルの植物病原菌を定量化することができます。潜在的な病気の発生を避けるために、植栽する前にフィールド調査。

プロトコル

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1 ポータブル リアルタイム PCR を用いた病原体の敷地内の分子検出

注:図 1を参照してください。

  1. 磁気ビーズを用いた DNA 抽出
    注:磁気ビーズを用いた DNA 抽出キット (例えばPrimerdesign から) は、製造元の指示に従って使用されました。すべての試薬は、常温 (18-25 ° C) 保存する必要があります。凍結乾燥のプロティナーゼ K (ボトル No.1) は中断 (ボトル、1 番を使用)、一度-20 ° C で保存
    1. マイクロ チューブにサンプル準備ソリューションの 500 μ L で 20-50 mg の土壌サンプルをミックスします。
      注:土: 準備ソリューションの比率は重要な下流実験 (例えば、汚染阻害剤による PCR の) の障害を引き起こす可能性があります他の比率でそれらを混合します。
    2. ソリューションが曇りまで小さな滅菌乳棒を使用して管の底の土を挽きます。さらに、チューブを揺することによってソリューションの土粒子を中断、放置、不撹乱土壌粒子を完全に解決する (通常の間に 5 〜 10 分)。
    3. 新鮮なチューブに上清 200 μ L を転送し、換散バッファーの 200 μ L を追加 (ボトル第 2: グアニジン塩酸塩ソリューション) とプロティナーゼ K (ボトル No.1) の 20 μ L。
    4. チューブを反転混和液と 15 分間室温でインキュベートします。
      注:ライセート マイクロ チューブのふたに見つかった場合チューブをタップまたは蓋から削除する利用可能な場合、遠心分離機を使用します。
    5. 結合バッファー/磁気ビーズ ミックス (ボトル No.3) 500 μ L を分離のサンプルに追加します。上下にピペッティングでよく混ぜるし、磁性管ラックから 5 分間室温でインキュベートします。
      注:ビーズ、ビーズがように避けよう均等にストレージ ボトルから使用前によく混合することを確認します。
    6. 磁性管ラックにチューブを置きます。少なくとも 2 分または、チューブのすべてのビーズを付ける磁気側の壁までで待機します。削除し、ピペットで上澄みのすべてを破棄します。
      注:磁化のビーズを除去し、上清を吸引不可します。DNA は、磁気ビーズによってキャプチャされている今。
    7. 磁性管ラックから、チューブを削除したり、500 μ L の洗浄バッファー-1 を追加 (ボトル号 4: ナトリウム過塩素酸塩・ エタノール溶液) とビードが均一に分散するまで繰り返しピペッティングでビーズを再中断します。サンプルからタンパク質と塩を削除するには、この洗浄ステップを実行します。混合物は 30 のために座るしましょう s。
    8. 1.1.6 のステップを繰り返します。
    9. 磁性管ラックから、チューブを削除したり、500 μ L の洗浄バッファー-2 を追加 (ボトル号 5: ナトリウム過塩素酸塩・ エタノール溶液) とビードが均一に分散するまで繰り返しピペッティングでビーズを再中断します。混合物は 30 のために座るしましょう s。
    10. 1.1.6 のステップを繰り返します。
    11. 磁性管ラックから、チューブを削除し、80% エタノール (ボトル No.6) 500 μ L を追加します。
      注:この手順は、サンプルから残留塩の除去のため必要です。
      1. 再ビードが均一に分散するまで繰り返しピペッティングでビーズを中断します。10 分逆転によって時折混合のため、このスタンドをみましょう。
    12. 1.1.6 のステップを繰り返します。
    13. 空気は、チューブ蓋が開いたまま室温で 10 分間磁気ビード沈殿を乾燥させます。
      注:ビーズは任意表示残留エタノールから解放する必要がありますが、完全に乾いています。
    14. 磁性管ラックから、チューブを取り外す溶出バッファー (ボトル No.7) の 50-200 μ L を追加して、繰り返しピペッティング ビードが均一に分散している 30 放置までビーズを再停止 s。
      注:上記の手順で精製した DNA は溶出バッファーに磁気ビーズから解放されます。
    15. 磁性管ラックにチューブを置きます。少なくとも 2 分または、チューブのすべてのビーズを付ける磁気側の壁までで待機します。
    16. 後工程で使用する 0.5 mL マイクロ チューブに浄化された DNA/RNA を含む上清を転送します。
  2. ポータブル リアルタイム PCR
    注:ポータブルたちと PCR アッセイ キットは、製造元の指示に従って使用された (材料の表を参照してください)。
    1. 開くとたち関連ソフトウェアを実行、ターゲット検出テストを選択し、名と詳細、メモ、サンプル、およびテストデータ エントリ フィールドにすべての説明情報を入力します。
      注:井戸 #1 と 2 は、それぞれネガティブ コントロールと肯定的な制御のためのソフトウェアによって示されます。
    2. 使用する前に PCR 試薬を準備します。反転によってよくチューブ含有凍結乾燥マスター ミックスとミックスにマスター ミックス再懸濁液バッファーの 500 μ L を転送します。標識プライマー ・ プローブ (表 2) 茶色のマイクロ チューブにマスター ミックス全体を転送します。
      1. キャップ、ミックスにマイクロ チューブを振る。徹底した混合が、すべてのコンポーネントは完全に再度中断されることを確認する必要です。この混合物を使用する前に 5 分間座ってみましょう。
        注:使用後は、-20 ° C で反応混合物を格納します。
    3. 前の手順から 0.2 mL PCR チューブに準備された反作用の組合せの 10 μ L を転送することによって陰性対照を準備し、10 μ L の滅菌ヌクレアーゼ フリーの脱イオン水を追加します。
    4. 1.2.2 ステップから 0.2 mL PCR チューブに準備された反作用の組合せの 10 μ L を転送することによって肯定的な制御を準備し、肯定的なコントロール テンプレートの 10 μ L を追加します。
    5. 各サンプルは、前の手順から 0.2 mL PCR チューブに準備された反作用の組合せの 10 μ L を転送し、ステップ 1.1.16 から調製した DNA のサンプルの 10 μ L を追加します。
    6. 2.1.1 の手順で説明するよう、それぞれの PCR チューブから内容とたちの井戸をロードします。
    7. すべての必要な情報の入力して確認した後実行を開始し、イーサネットで接続された計測器または USB ドライブのいずれかを選択します。
      注:USB ドライブ オプションを選択すると、実行ファイルがたちを (例えばF:\genesig) を使用するドライブに保存する必要があります。ドライブが、たち挿入後にすぐに実行が開始されます。
  3. ポータブル リアルタイム PCR のデータ分析。
    1. 実行が完了すると、たち関連ソフトウェアを使用して USB ドライブから実行ファイル (.usb) を開くか、直接結果をクリックすると、ソフトウェアの実行結果を表示します。
    2. 結果を分析する前に、データを失うことを避けるために完了した実行を保存します。
    3. [結果] タブで、実行のステータスを表示サンプルによって分類されます。
      注:このタブで得られるデータは結果のステータス、サンプルで検出された数をコピーします。
    4. 増幅曲線を表示するには、[詳細] タブをクリックします。ターゲットの検出に成功すると、ターゲットと内部統制の両方の Cq (定量化サイクル) の値が表示されます。
      注:これらの値は、最終報告書で計算されます、サンプルがターゲットの肯定的かどうかと、反応または DNA サンプルに問題があるかを決定する使用されます。

2. その他のプロトコル

  1. 代替研究室の DNA 抽出法
    1. CTAB-フェノール-クロロホルムに基づく手法
      1. CTAB-フェノール-クロロホルムによる方法、前述したドイル法18と性決定法19次を実行します。
    2. DNA ミニ調製法
      注:エドワーズ メソッド20は、次のとおり行った。
      1. マイクロ チューブとミックスにも 500 mg の土壌、続いて 5 1.4 mm セラミック ビーズとエドワーズ バッファー (200 mM トリス、pH 8.0、200 mM の NaCl、25 ミリメートルの EDTA、0.5 %sds) の 750 μ L を追加します。
      2. 5 分の 65 ° C でマイクロ チューブを孵化させなさい。
      3. 60 のビード ビーター ホモジナイザーを用いたサンプルを均質化 s (または乳鉢と乳棒を使用して)。
      4. 5 分 14,000 x g でサンプルを遠心します。
      5. 新鮮なチューブに上清を 500 μ l 添加を転送し、チルドのイソプロパノールの 500 μ L でミックスします。反転チューブ 10 回混ぜます。
      6. DNA をキーワードに 15 分間、14,000 x g でサンプルを遠心します。
      7. 上清をデカントし、DNA ペレットの空気が残りのエタノールが蒸発するまで室温で乾燥してみましょう。
      8. 750 μ L 冷蔵 70% エタノールで DNA の餌を洗います。
      9. 空気は、TE バッファー (10 mM トリス-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA) の 50-100 μ L で再度中断する前に、ペレットを乾燥させます。
    3. 他の代替方法
      1. シリカ ベース DNA 抽出キット #1 (MP バイオ DNA の回転速度) を使用してを実行し、メーカーの指示に従って #2 (Zymo BIOMICS の DNA の Miniprep キット) をキットします。
  2. 従来研究室でのリアルタイム PCR。
    注:従来のたちは、プローブを用いた PCR のプライマー ・ オリゴヌクレオチド プローブ (表 2) の様々 なマスター ミックスで使用されました。
    1. 非透明底 PCR を使用して管または PCR プレートの準備、分析のすべての DNA サンプルの 20 μ L 反応と同様に否定的な制御 (ヌクレアーゼ フリー脱イオン水)、肯定的なテンプレート コントロールは社内準備します。
    2. 各 PCR のチューブや、マスター ミックスの 10 μ L、7 μ L の脱イオン水のヌクレアーゼ フリー、2 μ M プライマー ・ プローブ、2 μ、1 μ L (手順 1.1.16、または 2.1) から DNA のサンプルのサンプルごとのコントロール テンプレートを含む混合物を準備します。
    3. PCR チューブ、プレートを閉じるし、適切な PCR プログラムを選択することにより反応を開始します。
  3. 従来の研究室ベースのリアルタイム PCR のデータ解析
    1. たち関連のソフトウェアを使用して、従来たちからの結果を分析します。データの分析を開始、たちから実行ファイルを USB ドライブに転送、USB ドライブを挿入し、エクスポートを選択します。
    2. たち関連ソフトウェアの実行からエクスポートされるデータ ファイル (.pcrd) を開きます。
    3. 楽器にも対応する配置することにより、サンプルの井戸を強調表示します。増幅曲線と標準曲線 (該当する場合) が自動的に生成されます。サンプル情報が入力されていない場合は、データを分析する前にデータの入力を開始するプレート セットアップまたは同様の機能をクリックします。
    4. [数量] タブにデータを表示します。これは、CSV、XML、または HTML のファイル リーダなどのサード パーティ製ソフトウェアによるデータ解析のエクスポートできます。
    5. 決定されたしきい値に基づいて Cq データを取得し、正と負のコントロールとそれを比較します。
      注:ターゲットの DNA 標準試金で使用する場合は、Cq カットオフを決める基準のサンプル Cq データを比較します。

結果

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DNA 抽出法の比較

磁気ビーズを用いた DNA 抽出法のリアルタイム PCR との互換性は、病原体がはびこるフィールドからの土のサンプルのS. 病菌DNA の量を検出することにより評価しました。磁気ビーズ法が基づく CTAB-フェノール-クロロホルム法18など迅速な DNA ミニ準備方法19、20、その他他の方法と比較した補足図 1のように、標準的なシリカ系 DNA 抽出キット。六つの異なるメソッドを使用して抽出した DNA 試料は、従来の研究室ベースのリアルタイム PCR に服従しました。シリカ系 DNA 抽出キットは、我々 はテスト方法の中で最高のパフォーマンスを示したが、磁気ビーズ法は他の方法に匹敵することが示唆されました。すべてのキットに含むためまたはため塩酸: RNases や Dnase など細胞の蛋白質のほとんどを変化させなさい強力なカオトロ ピック剤にも。したがって、メソッドを使用して DNA や RNA の抽出に適しています。

ポータブル リアルタイム PCR と従来研究室ベースのリアルタイム PCR の比較

従来研究室ベースの PCR、DNA は pGEM T ベクトル21 によって運ばれたジャガイモ根部より s.その遺伝子の量が異なるを使用して実行された病原体の絶対定量にポータブル PCR の特異性と感度を比較するには.その遺伝子の 10 倍希釈液のシリーズ (106 100枚) SsTQ プライマー ・ プローブ セット22を用いて分析を行いました。ポータブルの PCR 法に対象病原体の DNA が検出されたことがわかった (〜 100 のコピー)、感度は 10 倍より低い従来の研究室での PCR 法の少なくとも 10 枚 (図 2) を検出します。

さらなる検証のため人工的に出没する土壌を調べた。S. ジャガイモsporosori 粉状そうか病ルートえいポテトの根から得られました。土壌は、土の 10 の5 sporosori/g 乾燥重量の最終的な集中で sporosori の懸濁液にはびこっていた。磁気ビーズ法を用いた、出没の土壌サンプルから DNA が抽出され、10 倍連続希釈濃度に相当する 10 を取得する準備された5104103102101、および 100sporosori/g 乾燥土の重量。DNA サンプルは、SPO プライマー ・ プローブ セット23を使用して PCR を使用しました。結果、ポータブルの PCR 法は従来の研究室での PCR 法に匹敵する解析機能ですが、再び、感度は ~ 10 (図 3) の要因によって減った。

最後に、我々 は自然米病菌に汚染されていたフィールドからの土のサンプルをテストしました。磁気ビーズを用いた DNA の抽出は、土壌 (土壌抽出緩衝液 500 μ L あたりの 10、20、50、100 mg) の異なる量で実行されました。DNA の抽出のための開始材料としての土の最適な重さが 50-100 mg (図 4) であることが示唆されました。範囲外の土壌量下流の PCR のステップの故障の原因。この効果は、開始材料として土の過剰な量を使用する場合 (例えば、フェノール化合物) の汚染できる PCR24を妨害するためかもしれない。土の下のボリュームの場合抽出した DNA の量が (例えば10-20 mg の土壌から抽出された DNA を変化させた合計収量) PCR 検出限界よりも低い可能性があります。感度はまったくポータブル PCR および従来の PCR 法間で比較しました。異なる抽出方法 (補足図 2) によって DNA のサンプルで同様の結果が得られました。

ポータブル リアルタイム PCR を用いたオンサイト検出システムによって他の病原体の検出

R. solani AG3 と PMTV 他重要な土壌媒介ジャガイモの病原体を検出する携帯用の PCR 法をテストしました。本研究では純粋培養から dna R. solani AG3 検出 RsTq プライマー/RQP1 プローブ セット25を使用してリアルタイム PCR を行った。また、リアルタイム PCR を用いた PMTV D プライマー ・ プローブ セット26 PMTV ガストンネル症候性塊茎サンプルから RNA 検出のために使用された行った。図 5のように、ポータブルの PCR 法は正常に両方の病原体を検出しました。結果は、ポータブルおよび従来の器具は、リアルタイム PCR 用に設計されたプライマー シーケンスが使用可能な場合はポータブルの PCR 法、汎用性と他の病原体の検出に適用できることを示唆している間で同等だった。

figure-results-1
図 1。オンサイト病原体検出のための携帯用リアルタイム PCR システムのプロシージャ。プロトコルは次の順序での手順で構成されます: 簡単な均質化 (A)、磁気ビーズを用いた核酸抽出 (B)、携帯用リアルタイム PCR (C) およびラップトップ コンピューター (D) を用いた定量的データ解析によるライセート作製。サイト上のすべての手順を実行できることに注意してください。

figure-results-2
図 2.ポータブル PCR と従来の研究室の PCR の感受性の比較。病原体の DNA の定量化を行った米ジャガイモその遺伝子の量が異なるを使用して (106 100枚) SsTQ プライマー ・ プローブ セットします。S. ジャガイモプラスミド DNA のログ値と従来のたち (A) と (B) のポータブルのたちの Cq の相互のログ値間の線形回帰。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-3
図 3.人工的に出没する土壌の検出性能の比較ジャガイモ根部より s..土壌が人工的に出没 (105 100 sporosori/g 乾燥土の重量) s. ジャガイモsporosori 懸濁液を。磁気ビーズ法を用いた、DNA が出没する土壌試料から抽出されました。SPO プライマー ・ プローブ セットと土壌試料を用いた Pcr を行った。土壌 1 グラムあたり sporosori で開始量のログ値と従来のたち (A) と (B) のポータブルのたちの Cq の相互ログ値間の線形回帰。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-4
図 4.DNA の抽出のための土壌試料の量を開始の比較。磁気ビーズ法は、10、20、50、および土壌試料の 100 mg からの DNA 抽出に使われました。ポータブルたちを使用してリアルタイム Pcr を行った。標準的なカーブは (x 軸) の土壌サンプルから抽出した総 DNA の量と Sss のプライマー ・ プローブ セットによって増幅される PCR の製品 (y 軸) の量との関係を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-5
図 5.他のジャガイモの病原体の検出 R. solani と PMTV 。ポータブルたちと従来のたちを使用してリアルタイム Pcr を行った。R. solani AG3 RsTq プライマーと (A) PMTV PMTV 感染塊茎サンプル使用から抽出されたトータル RNA PMTV D プライマー ・ プローブ セット (B) 検出された RQP1 プローブを使用して純粋培養から抽出した合計の DNA で検出されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-6
図 6.植物の診断パイプライン。フローチャートは、植物病原体診断の一般的なワークフローを示します。敷地内の分子の検出が利用されている診断の全体のプロセスは、シンプルかつ高速な場合に視覚的な識別など、伝統的なステップが省略できます注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ポータブル リアルタイム PCRリアルタイム PCRランプELISA横流
ターゲットの反応あたりの費用します。0.60 ドル-$ 8.47$ 0.60$ 0.75$ 0.60$ 4.74
感度100 枚のコピー10 枚10 枚1-10 sporosori33
1-10 ng/mL (タンパク質)33 		1-10 sporosori34
5 x 105CFU/mL35
時間費用90 分80-240 分50-90 分32 3 24 時間10-15 分
準備が必要●Nucleic 酸抽出
● プライマーの設計		●Nucleic 酸抽出
● プライマー ・ プローブ設計		● Nucelic 酸抽出
● プライマーの設計		● 蛋白質の抽出
● 抗体		N/A
必要なその他の材料● ポータブルたち● 従来たち● カラー メトリック汚れ
● インキュベーター		● プレート リーダー
● 洗浄装置		N/A

表 1。植物の分子および血清学的検出法の比較表

プライマーシーケンス (5 '-3 ')、 ターゲットb
SsTQ F13 CCGGCAGACCCAAAACCS. 根の its 1 領 ITS2
SsTQ R13 CGGGCGTCACCCTTCAS. 根の its 1 領 ITS2
SsTQ P13 [ファム]CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [タム]S. 根の its 1 領 ITS2
Genesig S.subterraneaプライマー ・ プローブN/AS. 根のアクチン
SPO1014 GGTCGGTCCATGGCTTGAS. 根の ITS
SPO1114 GGCACGCCAATGGTTAGAGAS. 根の ITS
SPOPRO114 [ファム]CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [タム]S. 根の ITS
RsTqF119 AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTTR. solaniの its 1 領 ITS2
RsTqR119 AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTTR. solaniの its 1 領 ITS2
RQP119 [ファム]TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [タム]R. solaniの its 1 領 ITS2
Genesig PMTV プライマー ・ プローブN/APMTV で CP RT
PMTV-D-F20 AGAATTGRCATCGAAACAGCAPMTV CP
PMTV D R20 GTCGCGCTCCAATTTCGTTPMTV CP
PMTV D P20 [ファム]CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [タム]PMTV CP
、オリゴ DNA のプライマーは FAM (6-carboxyfluorescein) またはタム (5-carboxytetramethylrhodamine) に変更されました。
bITS: 内部転写スペーサー、CP: コート蛋白質;CP-RT: コート蛋白質リードスルー

表 2。本研究で使用されるプライマー

補足図 1。粉状そうか病の病原体の検出のための DNA 抽出法の比較。粉状そうか病病原体、 S. 根部土壌試料中の検出 6 異なる DNA 抽出方法 (A ~ F) を比較しました。(B、D、F)。シリカ系キット #1 を使用して DNA の抽出 (キットのすべての名前のための材料の表を参照)、シリカ系キット #2 と磁気ビーズ ベース キット、repsectively。従来の研究室での PCR たちを使用して PCR を行った。標準的なカーブは、土壌試料や SsTQ のプライマー ・ プローブ セットによって増幅される PCR の製品の量から抽出した総 DNA の量の間の関係を表します。この図をダウンロードするここをクリックしてください。

補足図 2。ポータブル PCR と従来の研究室の PCR 検出限界の比較。総 DNA から分離された 3 つの異なる抽出方法を使用して土壌サンプル: (, B) ドイル法、(C, D) シリカ系キット #2 および (E, F) 磁気ビーズを用いたキット。左側のデータで使用しているポータブルたち Sss のプライマー ・ プローブ セット、右側のグラフを表す SsTQ プライマー ・ プローブを用いた従来の研究室でのたちを使用して生成されたデータを表示するグラフを設定します。この図をダウンロードするここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

表 1に示すとおり、有効性、正確で、診断、速度27事前症候性感染症の検出に貢献している病原体の分子の同定における最近の技術の進歩が増加しています。オンサイト診断に関してランプ横方向フロー方法頻繁に利用されますポータブル、低コストですぐに結果を提供するため。ただし、血清学的方法の場合、種特異的な検出が達成するために難しいことができます。これは時々 一般的な土の住民などを対象微生物のスレショルドを発生します。たとえば、ある交差反応疫病菌の血清学的テストとPythium属菌ジャガイモ病原体28、時々 検出対象となる植物の難しさがあることを示す場合病原体。

本研究では従来のラボ リアルタイム PCR システムの機能を比較することで携帯用リアルタイム PCR システムを使用してポテトの土壌伝染性病原体の敷地内の分子検出のための最適化されたプロトコルを開発しました。敷地内のメソッドは特に土壌サンプルでジャガイモの病原体を検出感度は同等の研究室ベースのアッセイの ~ 10 倍未満がわかった。またこの場合実験室とフィールドの両方のテストは使わないこと生物学的に適切なサンプル サイズを考慮した価値があります。大きいサンプルの大きさは前述29,30土壌を定期的にスクリーニングで使用するために必要なサンプル サイズ 1 kg 250 g の間の処理場所にこれらのメソッドは、熟練したオペレーターを必要とし、洗練されたがDNA を抽出する装置です。通常、大規模な土壌 DNA 抽出は 1 に 4 ヘクタール6,29,30以上多数サブサンプルの単一の集計土壌サンプル代表から取得されます。しかし、ここで開発されたプロトコルは速く、ユーザーの使いやすい分子診断の経験がない、ラボ以外使用することができます。メソッドがある大規模な土壌抽出と比較して高速かつ比較的安価、大規模な集計サンプルに類似したサンプリングから採取され多くの小規模なサンプルを画面に使用できます。これが小さなサンプル サイズの欠陥のいくつかを克服でき、フィールドに病原体の空間分布に関する追加情報を確認します。さらに、移植性と法の速度、ことは、栽培者のためにデモ活動でそれも利用できる教育および契約の目的。

ほかに、植物病原体5の広い範囲の多くのリアルタイム PCR の試金はすでに公開されている必要があります。このシステムは、フィールド テストで有効にする新しいランプのプライマーを設計することがなくこれらの既存の試金の使用します。ランプの試金の頻繁な批評は31を設計することは困難ことができます。ポータブル PCR には、敷地内のテストするためすぐに利用できる病原体テストの広い範囲の比較的簡単な実装したがって、ことができます。

従来の方法は、高価な骨の折れる、不正確な時間のかかる頻繁にできます。敷地内の手法のシンプルさにより、生産者と業界の労働者自身によって病原体検出を実行し、おそらくいくつかの距離をすることができる診断の研究室に送信するよりもはるかに高速の結果を生成します。且つポータブル PCR 法の感度は、さらに二次感染は病原体の人口と (機器や人間) 経由が不用意に広がらないの増加の可能性を避けるための栽培者を助けることができます。結論として、本研究で開発した敷地内のメソッドは、フィールドでの重要な土壌病原菌の正確かつ比較的敏感検出できます。私たちの希望は本研究で開発した敷地内のメソッドが現在の診断パイプライン (図 6) の貢献する分野で植物の病気に関する疫学的質問への迅速かつ正確な回答を提供することによってだけでなく提供することにより植物病原体の疫学と生物学の理解は深まる。

開示事項

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著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

謝辞

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感謝しておりますノースダコタ州立大学で博士ニール ・ c. Gudmestad s. 根プラスミド DNA を提供するため博士愚考 Pappu PMTV RNA を提供するため、ワシントン州立大学 (WSU) と博士デブラ イングリス wsu R. solani AG3 を提供するため。Wsu 博士ジェレミー ジュエル ビデオ撮影の原稿と WSU CAHNRS 通信に関するコメントを提供するために感謝します。この研究は北西ジャガイモ研究コンソーシアムとワシントン州農務省 - 専門分野作物ブロックグラント プログラムによって支持された (許可なし。K1764)。PPNS 号 0741、植物病理学、農業大学、人間と自然資源科学、農業研究センター、ハッチ プロジェクト号WNP00833、ワシントン州立大学、プルマン、ワシントン州、米国。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ホワイトシェルPCRプレートBio-RadHSP9601
CFX ManagerBio-Rad1845000
SsoAdvanced Universal Probes Supermix バイオ・ラッド1725280
CFX96 タッチ qPCR 装置Bio-Rad 
エチルアルコール、純粋な 200 プルーフデコン研究所04-355-222
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)フィッシャー バイオ試薬BP118-500
フェノール、飽和 Fisher BioReagentsBP1750I-400
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)Fisher BioReagentsBP152-5
q16 リアルタイムPCR装置genesigMBS486001
超高純度ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)Invitrogen15525-017
2-Propanol (Isopropanol)JT Baker67-63-0
ChloroformJTベイカー9180-03
塩酸、36.5-38.0%(HCl)JTベイカー9535-03
イソアミルアルコールJTベイカー9038-01FastDNA
スピンキット MP Biomedicals6560-200シリカベースの DNA 抽出キット #1
Luna Universal One-Step RT-qPCR KitNew England BiolabsE3005S
0.1ml ロープロファイル 個別 PCR チューブPhenix ResearchMPC-100LP
Easy DNA/RNA Extraction Kit PrimerdesigngenesigEASY-EK
genesig Easy 1.5 mL tubesPrimerdesigngenesigEASY-1.5
磁気チューブラックPrimerdesigngenesigEASY-MR
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy KitPrimerdesignPath-S.subterranea-EASY
臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム (CTAB)Sigma-AldrichH6269-100G
ペレット乳棒サーモフィッシャーサイエンティフィック12-141-364
塩化ナトリウム (NaCl)サーモフィッシャーサイエンティフィック7647-14-5
DNA Miniprep キット ZymoBIOMICSD4300シリカベース DNA 抽出キット #2
1855195

参考文献

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DNA Spongospora subterranea PCR

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