トコンの節間文化の中に内生オーキシンとサイトカイニンの定量化

サマリー

不定芽は、植物ホルモン治療せずトコンの節間のセグメントに誘導できます。不定芽形成過程における植物ホルモンの動態を評価するには、MS LC/MS による節セグメントにおける内生オーキシンとサイトカイニンを測定しました。

要約

不定芽形成は経済的に重要な作物の普及のため、遺伝子組換え植物の再生に重要な手法です。植物ホルモン処理は、ほとんどの種の不定芽の誘導に必要です。オーキシンとサイトカイニン (CK) 間のバランスによって決定されます不定芽を誘発することができるかどうかのレベル。多くの努力は、最適な濃度と外植片として使用される各組織、各植物は植物ホルモンの組み合わせを決定するのに入ります。ただし、トコンは培植物ホルモン治療なしで節間のセグメントに不定芽を誘導することができます。これは評価する細胞分化のトコンの固有の可塑性をことができます。トコンの不定芽を誘導して、5 週間 0.2% ジェランガムで凝固した植物ホルモン無料 B5 培地で 14 h/10 h の光暗いサイクルで 15 µmol m^{− 2}の^{− 1}光の下の 24 の ° C で節間のセグメントを培養しました。不定芽形成過程における植物ホルモンの動態を調査するには、計測における内生インドール-3 - 酢酸及び CKs セグメント液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法クロマトグラフィー-タンデム質量による。このメソッドは、単純な方法で解析における内生インドール-3 - 酢酸の CKs レベルをできます。それは、他の植物の器官の中に内生オーキシンと CK のダイナミクスを調べるに適用できます。

概要

ゴットリーブ Haberlandt (1854-1945 年) は、「全能性」、ことができます細胞植物によって分割、区別し大株¹で特定の細胞型に分化させ事前後も全植物体を再生の概念を提案しました。組織培養、植物体再生を誘起することまたはないかどうか、組み合わせと成長培地におけるジベレリンの植物ホルモンの濃度によって決まります。培とミラーは、不定根が低比²を含む培地に誘導することが一方 CKs とオーキシンの高い比率を含む培養液中でタバコ由来カルスから不定芽を誘導することが発見しました。その発見以来組織培養行われている遺伝子組換え植物³の再生、経済的に重要な作物の伝播のため。不定芽は、茎頂、葉、根、茎など以外の組織から誘導することができます。植物ホルモン処理は、ほとんどの植物種の不定芽の誘導に必要です。ただし、最適濃度との組み合わせは異なる種と組織外植片として使用中です。したがって、多くの努力は、最適な濃度と植物ホルモンの実験のための組み合わせを決定するのに入ります。

トコン(Brot。)L. アンダーソン (トコン) は、エメチンと根⁴を中心に、セファエリンなどのアルカロイドが含まれている薬用植物です。ルート エキス、amoebicide⁵嘔吐、去痰薬として使用されます。トコンは、ブラジルの熱帯雨林に自生、文化では、種子を設定するには消極的だし、寒い気候⁶を使って、日本の種子貯蔵中に発芽率が低下します。代わりに、組織培養からの伝播が、撮影する不定節の形成は最も効率的な方法^7,8。興味深いことに、植物ホルモン治療⁸なしこの種の不定芽を誘起することができます。

不定芽は、基底部⁹ではなく親、なし節セグメントの根尖部に表皮に形成されます。この違いは、おそらく ∼ 規制下にある節セグメントで組織の極性を示します。トコン文化システムにより、不定芽形成の間に内生植物ホルモン レベルの変化を分析するユニークな機会です。ここで 1 つオーキシン (インドール-3-酢酸酢酸 (IAA)) と 4 つの CKs の内因性レベルの解析の手法を紹介 (イソペンテニル アデニン (iP)、イソペンテニル アデニン ゼアチンリボシド (iPR)、トランス-ゼアチン (tZ) とトランス-ゼアチンリボシド (最も息))LC ・ MS/MS を使用して節間のセグメント。

プロトコル

注: 内因性ホルモンの分析を容易にするため、トコン (C. トコン) はこの研究で使用されました。

1 トコンの不定芽を誘発する成長条件

1. PH 5.7¹⁰、調整無料の植物ホルモンの B5 培地を準備し、0.2% ジェランガムを追加します。オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい。
2. オートクレーブの中の 25 mL を滅菌シャーレ (90 × 20 mm) に注ぐ。
3. 手術のメスを用いた滅菌アクリル板に刃号 22 トコン苗木の 8 mm 節セグメントを切り取り、媒体 (図 1)。
4. 15 µmol m^{− 2}の^{− 1} 5 週間 14 h/10 h の光暗いサイクルの光の下の 24 の ° C で植物ホルモン無料 B5 培地で培養。
5. 地域を識別する私 (根尖部) から IV (基底) の各セグメント (図 1B)。週に一度顕微鏡下で地域ごとに不定芽 > 0.3 mm 長さの数をカウントします。

2. 抽出と植物ホルモンの精製

1. それぞれ 4 つの 2 mL のサンプル チューブの 5 mm ジルコニア ビーズを入れてください。
2. セグメントを切る地域 IV (各 2 mm 長さ) 滅菌アクリル板に手術のメスを使用します。
3. 別のサンプル チューブ (10-30 mg の新鮮な重量) の各地域の 8 つのセグメントを収集します。
4. 量る、そして液体窒素でサンプルを凍結します。
5. ビーズ ベースのホモジナイザーを用いた凍結試料を粉砕します。
6. オーキシンの各内部標準の 500 pg 及び CKs (d₅独立行政法人、d₅tZ、d₅最も息、₆d iP、d₆知的財産権) を含む 1 mL のアセトニ トリルに押しつぶされたサンプルを中断渦のミキサーを使用しています。
7. 室温で 5 分間 3,500 × gで遠心分離後 1 h、4 ° C で保持します。
8. 1% (v/v) 酢酸を含む 80% (v/v) アセトニ トリルでペレットを洗浄します。3,500 × gで再度遠心して、室温で 5 分間。(手順 2.7 および 2.8) から使い捨てのガラス管の培養上清を組み合わせます。
9. 追加 600 μ L 各複合培養上清に含まれる 1% (v/v) 酢酸を水し、真空濃縮を用いたアセトニ トリルを蒸発させます。
10. アセトニ トリル、メタノール、および 1% (v/v) 酢酸を含む水の各 1 mL を適用することによって、親水性・親油性-バランス (HLB) 列カートリッジを平衡します。
11. 平衡の HLB カートリッジあたり 1 つのサンプル ソリューションを適用します。
12. 1% (v/v) 酢酸を含む水を 1 mL でカートリッジを洗浄します。
13. ガラス管に 1% (v/v) 酢酸を含む 2 mL 80% (v/v) アセトニ トリルのすべてのホルモンを溶出します。
14. 取得真空濃縮を使用して 1% (v/v) 酢酸を含む水で抽出する溶出液にアセトニ トリルを蒸発させます。
    注: は、これを完全に乾燥しないでください。
15. 混合モードでは、強い陽イオン交換 (MCX) 列カートリッジを 0.5 mL、1 mL のメタノール 1 mL のアセトニ トリルを適用することによって平衡 0.1 M HCl と 1% (v/v) 酢酸を含む水を 1 mL。
16. 平衡の MCX カートリッジあたり 1 つのサンプル ソリューションを適用します。
17. 1% (v/v) 酢酸を含む水を 1 mL でカートリッジを洗浄します。
18. IAA をガラス管に 1% (v/v) 酢酸を含む 2 mL 30% (v/v) アセトニ トリルで溶出します。
19. 1% (v/v) 酢酸を含む 2 mL 80% (v/v) アセトニ トリルでカートリッジを洗浄します。
20. 2 mL の水と 5% アンモニア水を含む水を 1 mL のカートリッジを洗ってください。
21. ガラス管にアンモニア水 5% を含む 2 mL 60% (v/v) アセトニ トリル、CKs を溶出します。
22. 真空濃縮を使用して各ホルモンの分画の溶剤を蒸発し、クロマトグラフィー-タンデム質量分析まで +30 ° C で保存します。

3 独立行政法人及び CKs の LC ・ MS/MS 分析

1. メタノールの 600 μ L で管内各ホルモン エキスを溶解し、ソリューションをねじ首総復旧時バイアルに転送します。真空濃縮を使用して溶媒を蒸発させます。
2. 20 μ L 30% (v/v) アセトニ トリル中で IAA 分数と CK 分数スクリューバイアル首総復旧時の 1% (v/v) 酢酸を含む 20 μ L の水に溶解します。
3. 高速液体クロマトグラフィー システムを搭載したトリプル四重極 MS システムで肯定的なイオン モードでサンプルを分析します。
   注: 我々 は、表 1に記載されている HPLC 条件を設定します。
   1. IAA 溶出の 5%-50% 溶剤 B 7 分以上のバイナリのグラデーションを使用し、98% 溶剤 B 増し、1 分間保持巣注入による 5% 溶剤 B で 2 分間、平衡します。
   2. CK 溶出 2-40% 溶剤 B 5 分以上 7 分で 40-70% 溶剤 B のバイナリのグラデーションを使用し、95% 溶剤 B 増し、1 分間保持によって 2% 溶剤 B で 2 分間、平衡注入を入れ子にします。
   3. エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) を設定-MSの表 2に掲げるイオン源のパラメーター。
4. 複数の反応 (MRM) 遷移表3 各試料の定量化のための監視を使用します。
5. 重水素標識基準にラベルの比の標準曲線に対して内因性 IAA と CK のレベルを定量化します。

結果

1^st週不定芽が形成ないです。2^nd週間で小さな芽が登場しました。3^rdと 4^th週間、数シュート頂端領域 (I および II) を中心に増加 (図 2A)。5 週^目で番号シュートの地域であった約 7 で私と 5 地域 II (図 2B)。対照的に、いくつかの撮影だけは III と IV の地域で形作られました。

文化の前に IAA レベルだった地域でわずかに高い私 (4.1 pg ユニット/mg, 生体重 (FW)) より地域 II 〜 IV (〜 2.5 pg/mg FW;図 3)。1^s...

ディスカッション

植物ホルモンの分布を識別するために器官形成に関与することが重要です植物ホルモンを誘導するための植に外に適用されるため、器官形成植物ホルモン フリー培地で観察できる植物材料を使用枝や根、細胞分化と器官形成における植物の固有の可塑性を評価するが難しく、全体外植体に影響します。カーネーション・ l ・¹¹、エグレ marmelos (l.) Corrêa¹²、オトメアゼナ(l.) 事業¹³、など他の植物種の植物ホルモン自由な文化媒体の不定芽を誘起することツルウメモドキ paniculatusアマランサス。¹⁴、およびKalanchoë 対新。¹⁵. これらの植物種のプロトコルに適用することが可能でしょう。

独立行政法人、tZ、最も息、iP、およびアセトニ トリル中...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
[2H5]インドール-3-酢酸	Olchemlm Ltd	031 1531	LC-MS/MSの内部標準
2H5]トランス-ゼアチン	Olchemlm Ltd	030 0301	LC-MS/MSの内部標準
[2H5]トランス-ゼアチンリボシド	Olchemlm Ltd	030 0311	LC-MS/MSの内部標準
2H6]N6-イソペンテニルアデニン	Olchemlm Ltd	030 0161	標準LC-MS/MS
[2H6]N6-イソペンテニル アデノシン	オルケムLM Ltd	030 0171	LC-MS/MS
インドール-3-酢酸	和光	098 00181	LC-MS/MS
のトランスゼアチン	SIGMA-ALDRICH	Z0876 5MG	LC-MS/MS
標準 リボシド	和光	262 01081	LC-MS/MSの標準
N6-イソペンテニルアデニン	SIGMA-ALDRICH	D7674	1G 標準液 LC-MS/MS
N6-イソペンテニル アデノシン	ACROS ORGANICS	22648 1000	標準液 LC-MS/MS
用 アセトニトリル ハイパーグレード LC-MS 用 LiChrosolv	MERCK	1.00029.1000	溶媒 LC-MS/MS 用
水 LiChrosolv	MERCK	1.15333.1000	液滴 LC-MS/MS
HPLC	用島津	プロミネンス
MS	Sciex	3200QTRAP
オアシス HLB 30 mg/1 cc	ウォーターズ	WAT094225	カートリッジカラム
オアシス MCX 30 mg/1 cc	ウォーターズ	186000252	カートリッジカラム
スクリューネック トータルリカバリーバイアル	ウォーターズ	186002805
ブルー、12 x 32mm スクリューネックキャップ、PTFE/シリコンセプタム	ウォーターズ
Acquity UPLC BEH C18、2.1x100 mm	Waters	186002350	UPLC カラム
Proshell 120、EC-C18、2.1x50 mm	Agilent	699775-902	UPLC カラム
デジタル顕微鏡	Leica	DHS1000
TissueLyser II	QIAGEN	85300
サージカルブレード	フェザー	No. 22
メスの柄	フェザー	No.4
サバント SpeedVac/冷蔵ベイパートラップ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SPD111/RVT4104	真空濃縮器
使い捨てガラストーブ (13x100 mm)	岩城	9832-1310
滅菌ペトリ皿	INA OPTICA	I-90-20