キイロショウジョウバエにおけるプリオン様蛋白質集合体の細胞間伝達を監視

サマリー

病原性タンパク質凝集体がプリオンのようなプロパティを持つセルの間に広がって神経変性疾患に関連する考えを支持する証拠を蓄積します。ここでは、モデル生物、ショウジョウバエのプリオンのような骨材の細胞-細胞拡散の可視化を可能にする手法について述べる。

要約

ほとんどの神経変性疾患、アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD)、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) などの中枢機能が蛋白質の集計です。異常な蛋白質の集合、通常生体のホメオスタシスを混乱させる正確なメカニズムは知られていないが、タンパク質凝集体が密接に関連付けられてこれらの疾患の神経病理学。データを新たな広告、PD、HD でその病原性骨材仮説のための強力なサポートを提供し、ALS プリオンは、タンパク質だけ感染性病原体伝染性海綿状脳症の責任は、多くの類似点があります。プリオンは自己テンプレートによって集約表現の広がりを引き起こす同じ蛋白質のネイティブに折り返されているバージョンの変換を複製します。どのようにプリオンとプリオン様タンパク質の広告、PD、HD、および ALS 1 つのセルから別への移行が強烈な調査の領域では現在。ここでは、HD に関連する変異ハンチンチン (Htt) 集計のプリオンのような細胞間伝達の監視を許可するショウジョウバエモデルを説明します。このモデルは多くの異なるショウジョウバエのティッシュの遺伝子発現を操作するための強力なツールを活用して、直接変異 Htt 骨材のプリオンのような転送を報告する蛍光タグ細胞質蛋白質を利用しています。重要なは、我々 はここで説明するアプローチは、新規遺伝子および蛋白質集積体はさまざまな細胞のタイプの生体間の広がりを仲介する経路を識別するために使用できます。これらの研究から得られる情報は、神経変性疾患の根底にある、治療的介入のための新しい機会を明らかにする病原性のメカニズムの限られた理解を拡大します。

概要

プリオン仮説では、感染性病原体 (例えばヒトのクロイツ フェルト ・ ヤコブ病、スクレイピー羊、鹿、ヘラジカ、慢性消耗性疾患や牛の「狂牛病」の伝達性海綿状脳症を担当) 蛋白質と核酸¹を欠いているだけで構成されています。プリオン病の細胞プリオンタンパク質 (PrP^C) ではネイティブではない、安定した倍 (PrP^Sc) 高ベータ版シートが豊富な自己に変換し、安定したアミロイドに単量体の PrP^C分子を募集を反映することを前提としています集計します。PrP^Sc集合体は、生物に異なる細胞の間とも個々 の生物²を広げるためこの自己複製機構を使用します。

タンパクはまたほとんどの神経変性疾患 (アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、(HD)、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)) の中央特徴³。これらの疾患の内、または極細胞集計タンパク質複合体の形成は時間^5,細胞毒性⁴と脳を高い再現性で疾患固有のパスに沿って進行と密接に関連⁶。 普及のこれらのパターン....

プロトコル

1. カップリングショウジョウバエの Htt 遺伝子発現により媒介 Gal4 と QF

1. 収集および/または組換えショウジョウバエを生成組織固有 Gal4 または QF「ドライバー」を含む行として野生型や突然変異体 Htt 遺伝子下流 Gal4 UAS³⁸の QF 擬³⁹を含む行。確実にこれらの遺伝子から発現するタンパク質蛍光タンパク質融合またはエピトープ タグ同じフライの突然変異体と野生型の Htt 遺伝子製品の差別化を可能にします。図 1を参照してください。
   注: 我々 は通常人間の Htt 遺伝子²⁷のエクソン 1 フラグメントを使用します。ただし、遺伝子組換えハエは、必要な場合に長い Htt フラグメントまたは他の遺伝子を表現する代わりに生成できます。
2. Htt 遺伝子の突然変異体と野生型は別個の重複の細胞集団で表現されますような遺伝的戦略を計画してください。
   1. 式重複が発生した場合、同じ細胞の突然変異体と野生型の Htt 蛋白質は共同集計して、プリオンのようなイベントの検出を防ぐため。この問題を回避を使用 Gal4 と QF 特定リプレッサー、Gal80 と QS⁴⁰、それぞれ (<....

結果

ここで説明する方法は、そのままフライ中枢神経系内の別の 1 つのセルの人口から Htt タンパク質凝集体のプリオンのような転送を示す堅牢なデータを生成します。点状に拡散反射光から野生型 Htt の変換は、この YFP 融合タンパク質の直接蛍光 HttQ91 mCherry ドナー ORNs (A ~ Cの図 2と図 4A, B) に式の結果として受信者のグリア細胞で観察されます。これら 2 つの細胞集団間のプリオンのような転送イベントの正確な報告トランスジェニック ハエや間に重なることがなく突然変異体と野生型の Htt 遺伝子の強い表現レベルを生成する Gal4/QF ドライバーの慎重な選択が必要です。開発または成人期に。さらに、蛍光タンパク質 Htt 融合遺伝子の考え抜かれた設計は、強力なダウン ストリーム解析を有効にできます。変異体と野生型 Htt 集計をすることができますたとえば、.......

ディスカッション

神経変性疾患の患者数は増加し続けているより良い治療法を開発することができますので、これらの疾患の病態の理解を高めるための緊急の必要性があります。ここでは、監視モデル生物、ショウジョウバエの異なる細胞型の間の病原性タンパク質凝集体のプリオンのような通信を可能にする方法をについて説明します。最近、突然変異体 Htt 集計生体内でのプリオンのような伝送を実証してグリア²⁷にニューロンからこれらの凝集体の普及を仲介する貪食受容体を識別するためにこの方法を利用させていただきました。我々 のアプローチは、ショウジョウバエを使用して人間の遺伝病を研究するいくつかの利点を悪用: そのライフ サイクルは短いと広大な遺伝的ツールセットにより、治療に関連する基本的な生物学的情報の発見を加速することができます。

ここで述べる方法他の既存の動物 2 つの主要な利点を提供して培養細胞モデル プリオンのような伝送のため: (1) 集計する病原体 (例えば、突然変異体 Htt) はそのままの組織.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、10X、pH 7.4	ThermoFisher Scientific	AM9625	希釈して 1X
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-1L
Kimwipes	Thomas Scientific	2904F24
20% パラホルムアルデヒド (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15713-S
Normal Goat Serum (NGS), filtered	LampireBiological Laboratories	7332500	Aliquot and freeze upon receipt チキン
抗GFP	Aves Labs	GFP-1020	1:500希釈で使用
ウサギ抗DsRed	Clontech	632496	1:2000希釈で使用; DsRedベースの蛍光タンパク質(例:mCherry、mStrawberry、tdTomatoなど)を認識できます。
マウス抗Bruchpilot	開発研究ハイハイドーマバンク	nc82	1:100希釈で使用;ハエの脳FITC
抗チキン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SA1-7200	1:250希釈で使用
アレクサフロー568アンチウサギ	ライフ	テクノロジーA11011	1:250希釈で使用
アレクサフロー647抗マウス抗体	ライフ技術	A21235	1:250 希釈で使用
Slowfade Gold 退色防止試薬	Life Technologies	S36936
顕微鏡スライド (25 x 75 x 1.0 mm)	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-143
カバーガラス (22 x 22 mm)	グローブサイエンティフィック	1404-15
デュモン生物学グレード鉗子、スタイル 3	テッドペラ	503	非利き手で使用
デュモン生物学グレードの鉗子、スタイル5	ペラ	505	利き手LAS
X画像解析ソフトウェア	ライカ
イマリス画像解析ソフトウェア	Bitplane

テッドで使用