このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

タッチ捺印細胞診を用いた臨床病理標本から質の高い腫瘍 DNA を取得する簡易法

10.7K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/56943

⸱

2018年3月21日

 ,  ,  , 
1Genome Analysis Center, Yamanashi Central Hospital, 2Pathology Division, Laboratory Department, Yamanashi Central Hospital, 3The University of Tokyo

この記事について

サマリー

腫瘍組織から高品質 DNA を取得は、次世代シーケンシングによる遺伝子の変異を分析するための重要な第一歩です。この記事では腫瘍細胞を豊かにし、押印細胞診標本のタッチから無傷の DNA を取得する簡単かつ迅速な方法を提案する.

要約

管理およびがん患者のための特定の分子標的薬の治療前にがんの突然変異の状態を確認する重要です。臨床設定では、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織は、遺伝学的検査のため活躍しています。ただし、FFPE の DNA は、ホルマリン固定過程における断片化や破損は、一般的に。したがって、FFPE DNA は時々 低品質と量の DNA のための遺伝学的検査の適切ではないです。顕微鏡下で観察することができますタッチ捺印細胞診がん細胞からゲノム DNA を取得する (TIC) の方法をご紹介します。細胞形態と癌細胞数は、チックの標本を使用して評価できます。さらに、2 日以内 TIC サンプルからゲノム DNA の抽出を完了ことができます。合計金額、このメソッドを使用して得られた TIC DNA の品質 FFPE DNA のそれよりも高かった。この迅速かつ簡単な方法では、研究者 (例えば、次世代シーケンス解析、デジタル PCR および量的なリアルタイム PCR) 遺伝学的検査の高品質 DNA を取得し、結果をレポートのターンアラウンド時間を短縮することができます。

概要

次世代シーケンシング技術提供している研究者の遺伝の変化、メンデルの病気、遺伝的素因、がん1,2,3 のゲノム情報を解析の飛躍的な発展.がんゲノム アトラス (TCGA) と国際がんゲノム コンソーシアム (ICGC) は、一般的な癌4のいくつかの種類の遺伝子変異の同定を追求してきた。何百もの重要なドライバー遺伝子は正常に識別されているといくつかこれらの分子の薬物開発1,5,6のターゲットにされています。

臨床場面における FFPE 標本は病理診断とがんを含むさまざまな病気の分子テストのため通常使用されます。ただし、ホルマリンで固定過程では、DNA 蛋白質または DNA のクロスリンクが発生した、DNA 断片化を誘導しました。したがって、FFPE DNA サンプルは常に遺伝学的解析に適した DNA7,8,9の低質と量のため。また、FFPE 標本を準備するまでに数日かかるし、技術的なスキルのセクションを正確に準備する必要があります。したがって、高品質そのままな DNA を求める簡便かつ迅速な手法を開発することをお勧めします。

細胞診、病理組織学的診断のための代替方法です。細胞サンプル準備は簡単、以下の FFPE 準備10と比較して高価で、かつ高速なアプローチです。TIC 手法は、センチネル リンパ節と周辺組織のいくつかの年11,12術中迅速診断乳がん患者に行われています。ただし、チックの標本から高品質の DNA を得ることができるかどうかを検討して、その後の遺伝学的解析のため使用するほとんどの報告がありません。細胞診標本が一般的パパニコロー (Pap) またはギムザ染色、染色し、我々 は以前報告量と TIC 標本 (特にギムザ染色サンプル) から抽出した DNA の品質は FFPE から採取した試料よりも優れて組織13。Pap 染色に比べると、少ない汚損プロシージャを必要とする利点を有するギムザ染色.Pap 染色の後、サンプルを固定されているし、ステンド グラス、彼らマウントしますする必要がある媒体 (例えばMalinol)、腫瘍細胞、正常細胞、炎症細胞を顕微鏡など、サンプルの内容を区別するためのマウント。Pap の標本は、取付手順なし準備だない試料を乾燥するために顕微鏡下で細胞を観察することはほとんど不可能。比較では、乾燥した状態で観察することができますギムザ染色、したがって、取り付け手順は迅速に携帯電話評価する必要ありません。レーザーマイクロダイ セクション、ギムザ染色より適切な乾燥標本が必要なため。

本報告では TIC ギムザ染色標本を準備するための簡易迅速法を導入し、チックが dna の FFPE 標本と比較してより良いソースであることを示す.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. TIC に備えて通常のガラスを使用して迅速に微視的評価スライドします。

  1. 臨床病理組織材料が利用可能は、TIC 準備をできるだけ早くを実行します。TIC 標本を準備すぐにことはできません、滅菌ガーゼに湿らせた生理食塩水で覆われている組織材料を維持し、組織の乾燥を防ぐために冷蔵庫に保管します。
  2. 手術や内視鏡検査によって得られる臨床的に腫瘍 (例えば肝臓、肺、乳房組織) など 5 mm3組織材料を準備します。
    1. 優しく組織の滅菌ガーゼ生理食塩水でコーティングを拭き、組織表面に多くの血液がある場合、血液を取り外します。
    2. 針生検などの顕微鏡標本は、生理食塩水に浸した滅菌ガーゼで湿らせたサンプルをしてください。
  3. カットしトリミング ナイフで正常組織をトリムし、腫瘤が大きく表示されない場合腫瘍病変の表面を公開します。
  4. 手袋をはめた手で数回通常のガラス スライド上に切除標本の腫瘍表面に接する。触れられた区域は通常のガラス スライドの 80% を視覚的に確認します。
  5. 軽く、ポリエチレン ポリエチレンナフタ レート (PEN) 膜スライドに対して通常のガラス スライドを押して、手袋をはめた手で 2-3 回を優しくこする。視覚的にセルは通常のガラス スライドからペン膜スライドに転送されますを確認します。
  6. ガラスと室内の温度で 5 分間ペン膜スライドを風乾します。
  7. 直接細胞診では、通常のガラス スライドを染色します。ディップ、5 s のための固定液をスライド ガラスとし、染色ギムザ染色液 15 s。
  8. 評価し、迅速な評価のため顕微鏡で完全腫瘍内容と通常のガラス スライドのセルを画面します。いくつかの条件に基づいて腫瘍細胞を評価します。原子力の拡大、異常核型、豊富なクロマチン、セルの不平等な配分、細胞極性、細胞サイズ、コンポーネント/細胞質成分の核の比率

2. 遺伝子検査のペン膜スライド フィルムの準備

  1. 腫瘍細胞型を示します迅速な微視的評価 (ステップ 1.8) で 60% 以上は DNA の抽出のペン膜スライドの腫瘍に触れた映画はナイフで切ったし、手の手袋をはめた。カット フィルムをピンセットと手袋をはめた手で滅菌遠心チューブに転送します。
  2. 腫瘍細胞型は、迅速な微視的評価 (ステップ 1.8) によって (腫瘍内容の 60% 未満) 低として決定された、使用レーザーはレーザーキャプチャーマイクロダイ セクションと、腫瘍のサンプルを入手します。
    1. ギムザ染色標準プロトコルを使用して腫瘍細胞を評価するを実行します。
    2. 適切なレーザー キャプチャ マイクロダイ セクションによる PEM 膜のスライドのフィルムをカットします。
    3. カット フィルムをピンセットと手袋をはめた手で滅菌遠心チューブに転送します。
    4. DNA の抽出 (プロトコルがここで停止することができます) まで 4 ° C でフィルムを含む遠心チューブを格納します。

3. DNA の抽出

  1. 製造元の指示に従って FFPE DNA 抽出キットを使用して、変更を加えるチックまたは FFPE 組織サンプルからの DNA 抽出を実行します。相当のキットは FFPE DNA 抽出ステップで利用可能です。
  2. 組織換散バッファーの 180 μ L を追加 (pH = 8.3) 手動 200 μ L ピペットでフィルムを含む遠心チューブに。5 の最大速度 (約 2,500 rpm) で渦のミキサーとボルテックスによって手動 20 μ L ピペットとミックス プロティナーゼ K の 20 μ L を追加 s。
  3. 空気インキュベーターで一晩 56 ° C でサンプルをインキュベートします。
  4. それぞれ 90 ° c 1 時間 10 分のヒート ブロックで FFPE とチックのサンプルをインキュベートします。簡単にスピン ・ ダウン 5 1,500 × g で遠心チューブ ミニ遠心室温で s。
  5. 200 μ L ピペットとミックス サンプル徹底的に 5 の最大速度で 200 μ L の換散バッファーに追加 s。
  6. 200 μ L ピペットとエタノール (96 ~ 100%) の 200 μ L を追加し、よく混ぜる 5 の最大速度で s の簡潔に 5 1,500 × g で遠心管でスピンダウン ミニ遠心室温で s。
  7. 慎重に 1,000 μ L ピペットおよび 25 ° C で 1 分間 6,000 × g で遠心分離をしてスピン列に lysate の全体を転送します。
  8. 手袋をはめた手で、きれいな 2 mL 管でスピン列を置き、プラスチック廃棄ボックスにフローを含むコレクションの管を破棄します。
  9. 500 μ L の洗浄バッファーを 1,000 μ L ピペットと 6,000 x g で 25 ° C で 1 分間遠心スピン列に追加します。
  10. 手袋をはめた手で、きれいな 2 mL 管でスピン列を置き、プラスチック廃棄ボックスにフローを含むコレクションの管を破棄します。
  11. 500 μ L の洗浄バッファーを 1,000 μ L ピペットと 6,000 x g で 25 ° C で 1 分間遠心スピン列に追加します。
  12. プラスチックの廃棄ボックスにフローを含むコレクションの管を破棄します。スピン列を手袋をはめた手できれいな 1.5 mL 遠心チューブに置き、膜を乾燥する 25 の ° C で 3 分間 20,000 × g で遠心分離機にします。
  13. 手袋をはめた手で DNA 低バインド チューブにスピン列を配置します。
    1. 100 μ L ピペットと膜の中心に 40-50 μ L の溶出バッファーを追加します。
    2. 5 分の 20,000 × g で遠心する 25 ° C で 1 分間室温でインキュベートします。
    3. (プロトコルがここで停止することができます)、次のステップまでの-20 ° C で DNA サンプルを格納します。

4 量的なリアルタイム PCR による DNA の品質推定

  1. 次のように、ピペット滅菌遠心管のマスター ミックスを調製: リアルタイム PCR マスター ミックス、20 の 1 μ L × 2 の 10 μ L RNase P プライマー プローブ ミックス x (増幅サイズ: 87 bp)、および 8 μ L 滅菌ヌクレアーゼ フリー水の。
  2. 次のように 1 つの滅菌遠心チューブに 2 番目のマスター ミックスを準備: リアルタイム PCR マスター ミックス、20 の 1 μ L × 2 の 10 μ L RNase P プライマー プローブ ミックス x (増幅サイズ: 268 bp)、および 8 μ L 滅菌ヌクレアーゼ フリー水の。
  3. 5 点の標準曲線の人間制御ゲノム DNA (キットに付属) のシリアル希薄を 4 回実行し、絶対 DNA 濃度13を決定します。
  4. 20 μ L ピペット光 96 ウェル反応板の別の井戸に (手順 4.1 と 4.2 で準備) 2 つの準備されたマスター ミックスの 19 μ L を追加します。
  5. 2 μ L ピペットで反応混合物を含んでいる井戸を分離する FFPE DNA または TIC DNA の 1 μ L を追加します。ないのテンプレート コントロールの反応混合物を含む独立した井戸にヌクレアーゼ フリー水 1 μ L を追加します。
  6. 光学用粘着フィルムの非粘着側を押しながら戻って映画の中心からのバックアップ保護の皮をむきます。慎重にフィルム上にアプリケーターをドラッグ、96 ウェル プレートでフィルムをシールします。
  7. 優しくミックス 96 ウェル プレート ミキサーを用いた 10 96 ウェル プレート 2,000 rpm で室温で s。室温で 3 分間 1,000 x g で簡単にプレートを遠心します。
  8. リアルタイム PCR 機器と挿入 96 ウェル プレートの電源を入れます。次のプロトコルを使用して PCR の反作用を実行: 95 ° C、20 s、1 s と 60 ° C、20 s の使用「標準的な曲線」と「高速モード」の 95 ° c 45 サイクルが続く
  9. DNA (相対的な定量化; の比率と DNA の断片化を評価します。長い私アンプリコンの RQ) を取得 (268 bp) 短い増幅する (87 bp)。RQ は、短い私アンプリコン13の長い私アンプリコンの平均値の平均値です。

5. 次世代シーケンシング ライブラリの準備

  1. 製造元の指示に従って次世代シーケンシングのシーケンシング ライブラリを準備します。
  2. 次のようにサンプルごと滅菌遠心チューブにマルチプレックス PCR マスター ミックスを準備: マルチプレックス PCR 反応液、4 μ ≤6 μ L チックまたは FFPE DNA (1 100 ng)、プライマー プール x 5 x 5 の 4 μ L 20 μ L までヌクレアーゼ フリー水を加える。
    1. チューブをタップして優しく PCR チューブとミックスにマルチプレックス PCR マスター ミックスを追加します。
    2. 簡単にスピン ・ ダウン 5 1,500 × g で遠心チューブ ミニ遠心室温で s。
  3. 次のプロトコルを使用して PCR の反作用を実行: 2 分、99 ° C に続いて 99 ° C の 20 サイクル 15 s と 60 ° C、4 分および保持のステップ 10 ° C簡単にスピン ダウン PCR チューブ 5 1,500 × g で遠心するミニ室温で s。
    注: は、プライマーのペアの数に基づいてサイクルの数を決定します。
  4. PCR チューブのふたを開けるし、2 μ L ピペットと制限酵素の 2 μ L を追加します。PCR チューブをタップして優しく PCR チューブとミックスのふたを閉じます。簡単にスピン ダウン PCR チューブ 5 1,500 × g で遠心するミニ室温で s。
  5. 次のプロトコルを使用して PCR の反作用を実行: 10 分、10 分、20 分の 60 ° C の 55 ° C に 50 ° C、ホールディング ステップ 10 ° C簡単にスピン ダウン PCR チューブ 5 1,500 × g で遠心するミニ室温で s。
  6. それぞれよく含んでいるピペットと消化液の PCR 産物通りにアダプター結紮マスター ミックスを追加: アダプター結紮ソリューションの 4 μ L、バーコードの 0.5 μ L、アダプターの 0.5 μ L、ヌクレアーゼ フリー水 2 μ L、2 μ L の DNA のリガーゼ。そっと軽くたたくことによって PCR チューブとミックスの蓋を閉じます。簡単にスピン ダウン PCR チューブ 5 1,500 × g で遠心するミニ室温で s。
  7. 次のプロトコルを使用して PCR の反作用を実行: 22 ° C、30 分、5 分、5 分のための 72 ° C のための 68 の ° C、ホールディング ステップ 10 ° C
  8. 製造元の指示に従って磁気ビーズの配列ライブラリを浄化します。
  9. 1.5 mL DNA 低バインド チューブにアダプター結紮ライブラリ ソリューションを転送します。1st精製 DNA 低バインド チューブに磁気ビーズの 45 μ L を追加します。チューブを叩くことによって穏やかに混合し、室温で 5 分間インキュベートします。
  10. 磁気ラックで DNA 低結合管を配置し、ソリューションが明確になるまで室温で 2 分間インキュベートします。慎重に磁気ビーズを乱すことがなく 200 μ L ピペットで上澄みを廃棄します。
  11. 200 μ L ピペットと作りたての 70% のエタノールの 150 μ L を追加し、チューブ--側にビーズを洗浄する磁石を移動します。磁気ビーズを乱すことがなく上澄みを慎重に廃棄します。
  12. 第 2 洗浄の 5.11 のステップを繰り返します。
  13. 5 1,500 × g で遠心するミニと簡単にスピン ・ ダウン チューブ室温で s。磁気ラックで DNA 低バインド チューブを置き、慎重に 10 μ L ピペットとエタノール液滴を破棄します。
  14. ビーズを分散させるために磁気ビーズの餌を含んでいる DNA の低結合管に低 TE の 50 μ L を追加します。常温で 2 分間インキュベートします。
  15. 磁気ラックで DNA 低バインド チューブを置き、ソリューションがクリアされるまで、2 分間室温でインキュベートします。
  16. 新しい DNA 低バインド チューブに上清の 50 μ L を転送し、磁性体ビーズ 2nd浄化のため 100 μ L ピペットを 75 μ L を追加します。チューブを叩くことによって穏やかに混合し、室温で 5 分間インキュベートします。
  17. 磁気ラックで DNA 低結合管を配置し、ソリューションが明確になるまで室温で 2 分間インキュベートします。慎重に磁気ビーズを乱すことがなく 200 μ L ピペットで上澄みを廃棄します。
  18. 200 μ L ピペットと作りたての 70% のエタノールの 150 μ L を追加し、チューブ--側にビーズを洗浄する磁石を移動します。磁気ビーズを乱すことがなく上澄みを慎重に廃棄します。
  19. 第 2 洗浄手順 5.18.
  20. 5 1,500 × g で遠心するミニと簡単にスピン ・ ダウン チューブ室温で s。磁気ラックで DNA 低バインド チューブを置き、慎重に 10 μ L ピペットとエタノール液滴を破棄します。
  21. ビーズを分散させるために磁気ビーズの餌を含んでいる DNA の低結合管に低 TE の 50 μ L を追加します。常温で 2 分間インキュベートします。
  22. 磁気ラックで DNA 低バインド チューブを置き、ソリューションがクリアされるまで、2 分間室温でインキュベートします。
  23. 100 μ L ピペットで新しい DNA 低結合管に精製されたライブラリを含む上清の 45 μ L を転送します。

6. 量的なリアルタイム PCR によるライブラリの濃度を定量化します。

  1. 製造元の手順13によると各ライブラリの濃度を決定します。
    1. 次のように 20 の希釈液を準備: ミックス 2 μ L の精製されたライブラリと 38 μ L の DNA 低結合管のヌクレアーゼ フリー水 2 μ L、100 μ L ピペット。
    2. 7.3 のステップまで-20 ° C で原液のライブラリを保存します。
  2. 200-fold 希釈液を次のように準備: 20 の希釈精製のライブラリの (6.1 の手順で準備) の 5 μ L を混ぜると DNA 低結合管のヌクレアーゼ フリー水の 45 μ L。
  3. 2,000-fold 希釈液を次のように準備: 200-fold 希釈精製ライブラリの (6.2 の手順で準備) の 5 μ L を混ぜると DNA 低結合管のヌクレアーゼ フリー水の 45 μ L。
  4. 次のように反応のマスター ミックスを調製: ミックス マスター ミックス ソリューション × 2 の 10 μ L と滅菌遠心チューブにプライマー プローブ分析ソリューション x 20 の 1 μ L ピペット、し、チューブをタップしてミックスします。光の 96 ウェル反応の井戸に反応マスター ミックスの 11 μ L を追加します。
  5. 10 μ L ピペットの各ウェルに 2,000-fold 希釈ライブラリの 9 μ L、各標準のコントロールの 9 μ L またはヌクレアーゼ フリー水の 9 μ L を追加します。
  6. 光学用粘着フィルムの非粘着側を押しながら戻って映画の中心からのバックアップ保護の皮をむきます。
    1. 慎重にフィルム上にアプリケーターをドラッグ、96 ウェル プレートでフィルムをシールします。
    2. 96 ウェル プレート ミキサーを用いた 10 96 ウェル プレートを軽くミックス室温で s。
    3. 室温で 3 分間 1,000 x g で簡単にプレートを遠心します。
  7. リアルタイム PCR 機器と挿入 96 ウェル プレートの電源を入れます。次のプロトコルを使用して PCR の反作用を実行: 2 分、95 ° C、20 ° C、50 s、1 s と 60 ° C、20 s の使用「標準的な曲線」と「高速モード」の 95 ° C の 40 のサイクルが続く
  8. 2,000 qPCR で定める濃度を乗じて原液ライブラリ濃度を計算します。

7. 次世代シーケンシング

  1. 実行条件を計画し、ソフトウェアの実行パラメーターを設定します。
    1. [計画] タブ] をクリックし、[テンプレート]、適切な実行方法を選択しています。
    2. アプリケーションおよび技術の種類を選択し、[次へ] をクリックします。
    3. 楽器、サンプル調製キット (オプション)、ライブラリ キット タイプ、テンプレート キット、シーケンス キットを選択、校正モードを基本、チップの種類、コントロール シーケンス (オプション) とバーコードのセット、[次へ] をクリックします。
    4. プラグインを選択し、[次へ] をクリックします。
    5. プロジェクトを選択し、[次へ] をクリックします。
    6. 既定の参照および対象地域のベッド ファイルを選択します。
    7. サンプル名を入力、バーコードを選択し、[実行計画] をクリックします。
  2. テンプレートの準備を行い、チップの製造元の指示に従って自動計測器で読み込み。使用する前に 45 分間室温で試薬カートリッジを解凍します。
  3. 手順 6.8 で計算ライブラリ濃度に応じてヌクレアーゼ フリー水で希釈していないライブラリを希釈し、20 pM ライブラリを作る。
    1. シーケンスと氷上店のプールされたライブラリを準備します。
    2. サンプル チューブの下部に 100 μ L ピペットでプールされたライブラリの 25 μ L を追加します。48 時間以内のプールされたライブラリを使用します。
  4. 電源を入れ、自動化装置のカバーを開けます。
    1. シーケンス処理チップ、チップのアダプター、濃縮カートリッジ、先端カートリッジ、PCR プレート、PCR フレーム シール、回復チューブ、ソリューション カートリッジおよび試薬カートリッジを自動計測器の適切な位置に配置します。
    2. [実行設定] をタッチし、[手順] 画面に。
    3. カバーを閉じ、画面上の [チェック開始] をタッチします。
    4. デッキ後スキャン プロセス、画面で [次へ] をタッチします。
    5. (キット型、チップ型、チップ サンプル ID 計画) 表示内容を調べ、時間を設定画面で [OK] をタッチします。
  5. チップの読み込みを終えて。
    1. 画面の [次へ] をタッチし、カバーを開きます。
    2. 手袋をはめた手でチップ アダプターからシーケンス チップをアンロードします。
    3. チップの容器にチップを置くパラフィルムとストア シーケンス反応まで 4 ° c のラップ。
    4. 手袋をはめた手で自動計測器の適切な位置から濃縮カートリッジ、PCR プレート、PCR フレーム シール、回復チューブ、ソリューション カートリッジおよび試薬カートリッジを削除します。
    5. ヒント空カートリッジを手袋をはめた手で自動計測器の廃棄物の先端の位置に転送します。
    6. [次へ] をタッチし、カバーを閉じます。
    7. [スタート] をタップし、4 分間の紫外線照射による自動計測器をきれいします。
  6. 1,000 mL の超純水、0.22 μ m フィルター フロー フィルター ユニット フィルター ソリューションでナトリウムの緑泥石のタブレットを溶解します。
    1. シーケンス計測器の電源を入れます。
    2. [クリーン] のタッチと配列計測器の画面で [次へ]。
    3. 250 mL フィルター滅菌ナトリウムの緑泥石溶液とその後 250 mL の純水でシーケンス楽器をきれいに。
  7. [初期化] をタッチし、画面上の適切なシーケンス キットを選択します。
    1. 手袋をはめた手で適切な位置に灰色の荷送人をインストールします。
    2. (キットに付属) 洗浄液、(水酸化ナトリウム 100 mM の 350 μ L を含む) pH 調整液、pH 標準液 (キットに付属) とシーケンス計測器を初期化します。
  8. 100 μ L ピペット dATP、dGTP、dCTP、dTTP のヌクレオチド (キットに付属) (キットに付属) 50 mL チューブの 20 μ L を追加します。
    1. 手袋をはめた手で適切な位置に灰色の荷送人をインストールします。
    2. 50 mL チューブとシーケンス処理機器にネジをロードします。
    3. 約 25 分かかる初期化の手順を開始する画面で [次へ] をタップします。
  9. 初期化手順を完了するには。
    1. 画面上の [実行] をタップし、適切なライブラリの準備計測器を選択します。
    2. チップの二次元バーコードをスキャンします。
    3. 適切な位置にシーケンス処理チップを挿入します。
    4. チップのクランプと器のドアを閉じます。
    5. タッチ [チップ チェック]、[次へ]、およびシーケンスの実行を開始する画面で [OK]。
  10. シーケンス反応後データを転送し、シーケンス サーバー13,17にパイプラインのデータ分析を実行します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

図 1は、DNA の抽出に TIC 標本作製から全体のプロセスを示しています。特に、TIC サンプルからゲノム DNA を取得するのみ 2 日間を要します。スライド処理の前に腫瘍ストレージの効果を評価しました。組織検体はすぐにスライドに触れられたとき、および組織は、生理食塩水湿らせた滅菌・ ガーゼ 1 h (図 2) のために保たれた腫瘍細胞がスライド ガラス上に接続されていたことがわかった。しかし、組織は、室温で保たれた、時腫瘍細胞添付されませんでしたよくスライドに。準備されたスライドは、3 カ月、4 ° C で格納できます。したがって、乾燥のための標本を許可しないことが重要です。

我々 は本手法の有用性を検討したし、FFPE を用いて標本と比較します。14 の腫瘍の標本、TIC と FFPE サンプルの調製し、腫瘍内容と純度が T...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

本研究ではチックを使用して臨床病理標本から腫瘍 DNA を取得するための代替方法を提案します。TIC 準備非常にシンプルかつ FFPE のメソッドは、特別な楽器10の要件なしと比較してより少ない時間を必要があります。(図 1) 2 日以内は、DNA の抽出に TIC 準備からすべての手順を完了できます。このメソッド従って遺伝学的検査を行うため所要時間が短くなります。特に、これは分子の解析に必要な日数の短縮に重要な利点を提供します。この短い所要時間では、すぐに分子標的薬を必要とする進行がん患者に適切な治療を提供することが出来ます。このメソッドは、したがって腫瘍における遺伝子変化の解析およびがん治療の分子標的薬の管理のための利点を提供します。

TIC DNA を用いた遺伝学的解析の成功のいくつかの重要なポイントがあります。腫瘍組織は化学療法などの治療や他の治療のため壊死かもしれません。したがって、注意は、可能な限りの腫瘍内の壊死のセクションからのサンプリングを避けるために TIC...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

参加に同意すること、病院と患者のすべての医療および補助的なスタッフに感謝しますガブリエル白狼、エダンズ ・ グループ (www.edanzediting.com/ac) このレポートの下書きを編集してから、博士に感謝いたします。本研究は、ゲノム研究プロジェクト (容湖とミズーリ州) は、山梨県からの助成金から、安田医療財団 (容湖) 補助金によって支えられました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
FINE FROST white20 マイクロスライドガラス松波硝子工業株式会社SFF-011
Arcturus PEN メンブレンガラススライドサーモフィッシャーサイエンティフィックLCM0522
Cyto Quick A solution武藤純薬品20571
Cyto Quick B solution武藤純薬品20581
May-Grunwald Solution武藤純薬品15053
Giemsa solutionMuto Pure Chemicals15002
QIAamp DNA FFPE tissue kitQiagen56404
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents KitThermo Fisher Scientific4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2Thermo Fisher Scientific4324034
MicroAmp Fast Optical 96ウェル反応プレート サーモフィッシャーサイエンティフィック4346907
MicroAmp 光学接着フィルムサーモフィッシャーサイエンティフィック4311971
MicroMixer E36TITEC0027765-000
ViiA 7 リアルタイムPCRシステムサーモフィッシャーサイエンティフィックVIIA7-03
Himac CF16RXII日立工機CF16RII
イオンライブラリー TaqMan 定量キットサーモフィッシャーサイエンティフィック4468802
Ion AmpliSeq がんホットスポットパネル v2サーモフィッシャーサイエンティフィック4475346
イオン AmpliSeq ライブラリーキット 2.0サーモフィッシャーサイエンティフィック4480442
Ion Xpress バーコードアダプター 1-16 キットサーモフィッシャーサイエンティフィック4471250
イオン PGM Hi-Q ビューシーケンシングキット (200 塩基)サーモフィッシャーサイエンティフィックA30044
イオンシェフシステムサーモフィッシャーサイエンティフィック4484177
Veriti 96ウェルサーマルサイクラーサーモフィッシャーサイエンティフィックVeriti200
Ion 318 チップキット v2 BCサーモフィッシャーサイエンティフィック4488150
イオン PGM システムサーモフィッシャーサイエンティフィックPGM11-001
イオン PGM ウォッシュ 2 ボトルキットサーモフィッシャーサイエンティフィックA25591
Agencourt™アンプリュー&トレード;XP KitBeckman CoulterA63881
16ポジションマグネットスタンドThermo Fisher Scientific4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube)Thermo Fisher ScientificAM12450
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificAM9938
MicroAmp™光学式96ウェル反応プレートThermo Fisher Scientific4306737
MicroAmp™透明粘着フィルムサーモフィッシャーサイエンティフィック4306311
Agencourt>アンプリュー&トレード;XP キットベックマン・コールターA63881
エタノール(99.5)ナカライ テスク08948-25
水酸化ナトリウム (10M)シグマ72068
DTU-NeoTAITEC0063286-000
E-36TAITEC0027765-000
ECLIPSE CI-Lニコン704354
Pipet-Lite LTS ピペットL-2XLS+メトラー・トレド17014393
Pipet-Lite LTS ピペット L-10XLS+メトラー・トレド17014388
Pipet-Lite LTS ピペット L-20XLS+メトラー・トレド17014392
Pipet-Lite LTS ピペット L-100XLS+メトラー・トレド17014384
Pipet-Lite LTS ピペット L-200XLS+メトラー・トレド17014391
Pipet-Lite LTS ピペット L-1000XLS+メトラー・トレド17014382
プチチェンジワケンMODEL8864ミニ遠心分離機
プチインキュベーターワケンWKN-2290エアインキュベーター
センシケア パウダーフリーニトリル検査用手袋メドラインSEM486802
滅菌ガーゼ大崎11138
冷蔵庫メディクール山陽MPR-312DCN-PJ
フェザートリミング ブラッドフェザーNo.130
フェザートリミング ブラッドフェザーNo.260
フェザー SフェザーFA-10
ボルテックス ジーニアス3IKA41-0458ボルテックスミキサー
ピンセットナツメA-5
1.5mL マイクロチューブバイオビックRC-0150

参考文献

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
  2. Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
  3. Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
  4. Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
  5. Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
  6. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
  7. Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
  8. Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
  9. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  10. Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
  11. Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
  12. Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
  13. Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
  14. Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
  15. Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
  16. Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
  17. Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833(2016).
  18. Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3(2017).
  19. Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
  20. Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
  21. Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
  22. Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
  23. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493(2013).
  24. Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23(2014).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

腫瘍DNA抽出FFPE DNA比較PEN膜スライドDNA品質評価次世代シーケンシングデジタルPCR定量リアルタイムPCR体細胞変異検出自動シーケンシング
タッチ捺印細胞診を用いた臨床病理標本から質の高い腫瘍 DNA を取得する簡易法
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。