遺伝子にコードされた蛍光センサーを用いた毒性酸化ストレスの評価へのアプローチをイメージング

サマリー

本稿では、異物による酸化ストレスの検討のため住セルイメージ投射の遺伝子にコードされた蛍光レポーターの使用について説明します。この実験的アプローチでは、毒性学的酸化ストレス検査に用いられる従来の欠点の多くを回避しながら比類のない時空間分解能、感度、特異性を提供しています。

要約

酸化ストレスは一般に引用された毒性学的メカニズムが、それを研究する従来の方法に苦しむサンプル、潜在的なアイテムの紹介と、反応の特異性の欠如の破壊を含む、欠点の数関与する種。従って、非破壊、敏感なと具体的な方法を観察しより一般的に呼ばれる酸化ストレス、細胞内レドックスの摂動を定量化するための毒物学の分野で現在の必要性があります。RoGFP2 とハイパー、異物による酸化的応答を観察する生細胞イメージング研究で使用する 2 つの遺伝子にコードされた蛍光センサーの使用法を紹介します。roGFP2 は、ハイパー中グルタチオン酸化還元電位 (E_GSH) である過酸化水素 (H₂O₂) を直接検出します。両方のセンサーは、トランスフェクションや伝達、経由でさまざまな種類の細胞に表現できるので、特定の細胞コンパートメントをターゲットすることができます。最も重要なは、これらのセンサーを用いた生細胞顕微鏡は、従来の方法を使用して可能ではない高の空間的で、一時的な解像度を提供しています。510 nm で順番に 404 によって励起され、両方の遺伝子にコードされた蛍光センサーの読み出しとして監視の蛍光強度の変化 nm、488 nm の光。このプロパティは、共通の顕微鏡によるアーチファクトの除去とセンサー式のセルの間の違いを補正する両方のセンサーのレシオ メトリックです。さまざまな共焦点イメージング システム、従来の広視野顕微鏡、プレートでの使用に適しており、所定の波長でエキサイティングで収集排出できる蛍光プラットフォームこの方法論を適用できます。読者。両方の遺伝子にコードされた蛍光センサーは、携帯電話の E_GSHと H₂O₂世代リアルタイムで監視するさまざまなセルタイプおよび毒性学的研究で使用されています。ここで説明は、細胞の種類や酸化ストレスの細胞毒性評価に roGFP2 とハイパー用蛍光プラットフォーム間で広く適応可能である標準化された方法です。

概要

用語「酸化ストレス」は毒性のメカニズムとして頻繁に引用されまだ稀、この用語です具体的に説明されています。酸化ストレスは活性酸素、フリーラジカル、抗酸化剤分子の酸化によって引き起こされる損傷の生成を含むいくつかの細胞内プロセスを参照でき、特定のシグナリングの活性化もカスケードします。^{5 異物化合物自体のいずれかの直接作用によって酸化ストレスを誘導する広範な環境汚染物質1,2と医薬品3,4に記載されています。、6}または細胞応答^7,8,9,10の一部として酸化種の生産によって第二。だからこそ、それを正確に観察し、副作用につながる酸化プロセスを特徴付ける毒物学に大きな関心の。酸化ストレス測定の従来の方法を含む酸化生体^11,12

プロトコル

1. 細胞の調製

注: この手順は、不死化細胞ライン (ベアス 2 b; のレンチ ウイルスの伝達を説明しますATCC、マナッサス、VA) 目的のレポーター (roGFP2 またはハイパー) を表現します。彼らは記者式視野 (通常 5-10 セル) あたりセンサー発現細胞の十分な数を視覚化するのには十分のレベルの結果として、他のセル行/型や遺伝子、トランスフェクションなどのメソッドを利用できます。最終的に分析法を使用する料理の手順が実行される必要がありますトランスフェクション メソッドを使用している場合 (例えば、transfect 顕微鏡が表示されます同じ皿のセル)。以下の手順は、6 も細胞培養プレート内で実行する細胞伝達の準備の詳細を提供します。この形式が目的のアプリケーションの適切なサイズでない場合は、代わりに他の船舶が使用できます。

1. 細胞を正常な成長のメディアで約 40 ~ 60% 合流に成長します。
   注: 本研究は、ケラチノ サイト成長媒体 (KGM) で栽培、ベアス-2B ひと気管支上皮細胞の線を利用しました。
2. 直前の伝達、細胞の成長媒体を 500 μ L の数式で計算されたウイルスの適切な量を含む無血清メディアに置き換えます。
   

結果

E_GSHと細胞内の H₂O₂の変更の検出で roGFP2 とハイパーの使用されている前述の^25,36,42,43ここで。ベースラインと H₂O₂と DTT の情報に加えて、以下の roGFP2 を発現する細胞の共焦点画像を図 2のとおりです。実験を通して収集した画像からデータがエクスポートし、プロトコルのセクション 4 で説明されているように分析します。肯定的な制御として外因性 H₂O₂の追加で再現可能な応答を生成するデータは、それぞれの基準に正規化され、知られている外因性の添加で定義されたダイナミック レン.......

ディスカッション

それぞれ、細胞内_GSH E と H₂O₂の変更の検出で roGFP2 とハイパーの使用は^25,生理学的及び毒性学的研究前^{35,36 によく記載されています。 ,,3940,41,42,43}。ここで説明したプロトコルは細胞内レドックス恒常性の異物による摂動を評価するために設計されている先の尖ったの毒性学的研究でこれらの遺伝子にコードされた酸化還元センサーを実装する効果的な方法をレポートします。最も重要なは、これらのセンサーの適切な使用は、最終的に.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
roGFP2 プラスミド	オレゴン大学	N/A	寛大な贈り物 S.J. レミントン
HyPer プラスミド	エブロゲン	FP941
過酸化水素	Sigma Aldrich	H1009
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	10708984001
9,10-Phenanthrenequinone	Sigma Aldrich	156507
Black壁 ガラス底 皿	テッド ペラ	14029-20
BEAS-2B 細胞株	アメリカ型 培養コレクション	CRL-9609
ケラチノサイト基礎培	ロンザ	192151
ケラチノサイト増殖培地 BulletKit	ロンザ	192060
Excel	マイクロソフト オフィス スイート	N/A
NIS-Elements AR イメージングソフトウェア	ニコン	N/A
ニコン C1si 共焦点イメージングシステム	ニコン	N/A

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