このメソッド小角 x 線散乱 (SAXS) x 線結晶構造解析によってクローニング、表現、および構造決定のための組換え Nsa1 の精製をについて説明し、他のタンパク質のハイブリッド構造解析の適用両方を含む注文し、無秩序なドメイン。
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この記事について
サマリー
要約
リボソーム アセンブリ因子 Nsa1酵母 (出芽酵母)からのフルレングスの構造の決定は、乱れたため挑戦とプロテアーゼ活性タンパク質の C 末端。本稿では、x 線回折・小角 x 線散乱による構造解析出芽酵母から遺伝子組換え Nsa1 を浄化する方法について説明します。Nsa1 のよく整理された N 末端 WD40 ドメインの構造を解決するために x 線結晶解析を用いて、小角 x 線散乱ソリューションの Nsa1 の C 末端の構造を解決する使用だった。散乱データのソリューションは、ソリューションでフルレングスの Nsa1 から採取しました。WD40 ドメインの高分解能結晶構造から算出した理論の散乱振幅と剛体と第一原理計算モデリングの組み合わせが Nsa1 の C 末端を明らかにし。このハイブリッド アプローチを通じて、全体蛋白質の第四紀構造が再建されました。紹介した方法は、他の蛋白質の構造化および非構造化ドメインのミックスの作曲のハイブリッド構造決定の一般的に適用される必要があります。
概要
リボソームは、mRNA にすべての生きている細胞の蛋白質翻訳の重要な役割を果す大きいリボ核蛋白質マシンです。リボソームはリボソーム生合成1,2,3,4と呼ばれる複雑なプロセスで作り出される 2 つのサブユニットで構成されます。真核生物のリボソームの組み立ては不可欠なリボソーム アセンブリ要因2,3、5の何百もの援助に依存しています。Nsa1 (Nop7 には 1 が関連付けられている)、リボソーム大サブユニット6, の生産のために特に必要がある真核生物のリボソーム アセンブリ要因であり、WD リピートとして知られているを含む 74 (WDR74) より高い有機体7で。マウス8で胚盤胞の形成のため必要となる WDR74 が示されているし、WDR74 プロモーターよく癌細胞9で変異します。ただし、関数とリボソ....
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プロトコル
1. 組換えタンパク質生産・精製 Nsa 1
- Nsa1 発現プラスミド設計とクローン作成
- 取得または出芽酵母ゲノム DNA を購入します。
- PCR 増幅 Nsa1 のターゲット シーケンス (Nsa1フロリダ、残基 1-463) と C 末端切り捨て Nsa1 (Nsa1ΔC、残基 1-434)酵母および融点の由来ゲノム DNA を使用して適切なプライマーと1-2 分の延長時間を約 60 ° C。次のプライマーを用いて Nsa1 を増幅します。
SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC - N ターミナルを含むエシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌)式ベクトル pHMBP に Nsa1 を subclone 6 X ヒスチジンの札は続いてマルトース結合タンパク質 (MBP) と標準的なクロー....
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結果
Nsa1 は、出芽酵母ゲノム DNA の増幅と subcloned MBP と TEV プロテアーゼ サイト続いて N ターミナル 6 x ヒスチジン親和性タグを含むベクトルに PCR をだった。Nsa1 は大腸菌BL21(DE3) 細胞に変換され、IPTG 誘導および 25 ° c 一晩 (図 1 a) 成長タンパク質発現の高収率が得られました。Nsa1 は、固定化コバルト親和性樹脂、TEV プロテアーゼと MBP の開裂によって続いて、サイズ排除クロマトグラフィー (図 1 b) 最終的に解決のアフィニ ティー精製をだった。Nsa1 を含むサイズ排除クロマトグラフィーから分数をプール、8 mg/mL に濃縮し、結晶化ロボットによる結晶化試験に使用されます。初期のスパース マトリックス液晶画面 (図 2 a) Nsa1、立方晶と斜方晶系の 2 つの異なる結晶.......
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ディスカッション
このプロトコルを使用すると、酵母から組換え Nsa1 は、x 線回折・小角 x 線散乱による構造研究に対して生成されました。Nsa1 は、ソリューションの行儀と複数の結晶形に結晶化されました。これらの結晶の最適化、中に Nsa1 の C 末端がプロテアーゼ分解に敏感であったことが発見されました。高解像度 Nsa1 の柔軟な C 末端が結晶の充填を妨げるために、斜方晶系の結晶形を Nsa1、可能性の C 末端切り捨てのバリエーションに複製のみでした。Nsa1 の構造の高分解能 x 線結晶学によって解決されたが、それが順序付けされていないので、C 末端をいずれかの結晶形の構築できませんでした。しかし結晶学はいくつかの制限を持って任意のメソッドと同様、結晶構造解析、Nsa1 のサイズは約高分子の原子分解能の構造を決定するためプレミア手法です。結晶学の主要な制限の 1 つは蛋白質40,41の無秩序領域を解決することができないことです。
Nsa1 の C 末.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
回折データは、東南地域共同アクセス (SER 猫) チーム 22 ID および 22 BM ビームラインの高度な光子ソース (AP)、アルゴンヌ国立研究所で収集されました。SIBYLS ビームライン事前光ソース (ALS)、ローレンス ・ バークレー国立研究所での小角 x 線散乱データを収集しました。リモート データの収集と処理の SIBYLS ビームラインでのスタッフに感謝したいと思います。タンパク質ドメインの境界を決定する助けのための環境健康科学の国立研究所 (NIEHS) 質量分析法による研究およびサポート グループに感謝しております。この作品によって、米国国立研究所の健康学内研究プログラムをサポートされていました米国立環境健康科学 (NIEHS) 研究所 (r. e. s. に ZIA ES103247) とカナダ保健研究 (機構、M.C.P に 146626) 機構。AP の使用は、米国エネルギー省、科学局、契約番号の下で基本的なエネルギー科学のオフィスによって支えられました。W-31-109-Eng-38。高度な照明のソース (ALS) の使用はディレクター、科学局、事務所のエネルギーの基礎科学、契約番号の下で米国エネルギー省によって支えられました。デ-AC02-05CH11231。追加サポート SIBYLS 小角 x 線散乱ビームラインは、国立衛生研究所からなるプロジェクト ミノス (R01GM105404) とハイエンド計装グラント S10OD018483。我々 もこの原稿の彼らの重要な読書のアンドレア ・月と博士....
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Molecular Cloning of Nsa1 | |||
| pMBP2 parallel vector | Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | 我々は、N末端Hisタグ(pHMBP) | |
| S. cerevisiaeゲノムDNA | ATCC | 204508D-5 | |
| プライマー | |||
| SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG | |
| SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC | |
| SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGTGG | |
| SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC | |
| Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1 | |||
| Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells | Invitrogen | C601003 | |
| pMBP- NSA1 and various truncations | Lo et al., 2017 | ||
| Selenomethionine | Molecular Dimensions | MD12-503B | |
| IPTG、ジオキサンフリー | プロメガ | V3953 | |
| EDTA フリー プロテアーゼ阻害剤 カクテル | シグマ・アルドリッチ | 4693159001 | |
| 塩化ナトリウム | カレドン ラボラトリー・ケミカルズ | 7560-1-80 | |
| 塩化マグネシウム六水和物 | シグマ・アルドリッチ | M2670 | |
| トリス緩衝液、1 M pH7.5 | KD メディカル | RGF-3340 | |
| グリセロール | Invitrogen | 15514-029 | |
| β-メルカプトエタノール | Sigma | M6250 | |
| 1M イミダゾール、pH 8.0 | テクノバ | I6980-06 | |
| タロン アフィニティー樹脂 | Clonetech | 635503 | |
| Amicon Ultra 15 mL 遠心フィルター (MWCO 10K) | ミリポア | UFC901024 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 プレップグレードゲルろ過カラム | GE-Healthcare 28989335 | ||
| NIEHS Protein Expression | NCIが提供するコア発現プラスミド (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009) | ||
| 4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRad | 456-8056 | |
| Crystallization, Proteolytic Screening | |||
| クリスタルスクリーン | ハンプトンリサーチ | HR2-110 | |
| クリスタルスクリーン2 | ハンプトンリサーチ | HR2-112 | |
| ソルトRxハ | ンプトンリサーチ | HR2-136 | |
| インデックススクリーン | ハンプトンリサーチ | HR2-144 | |
| PEG/イオンスクリーン | ハンプトンリサーチ | HR2-139 | |
| JCSG+ | 分子寸法 | MD1-37 | |
| ウィザード 沈殿物 相乗効果 | 分子寸法 | MD15-PS-T | |
| Swissci 96 ウェル 3 ドロップ UVP シッティング ドロップ プレート | TTP Labtech | 4150-05823 | |
| 3 インチ ワイド クリスタル クリア シーリング テープ | ハンプトン リサーチ | HR4-506 | |
| プロティエース キット | ハンプトン リサーチ | HR2-429 | |
| PEG 1500 | 分子寸法 | MD2-100-6 | |
| PEG 400 | 分子寸法 | MD2-100-3 | |
| HEPES/水酸化ナトリウム pH 7.5 | 分子寸法 | MD2-011- | |
| クエン酸ナトリウム 三塩基性 | 分子寸法 | MD2-100-127 | |
| mm シリコン処理カバースライド | ハンプトンリサーチ | HR3-231 | |
| シーラント付き 24 ウェルプレート (VDX プレートシーラント) | ハンプトンリサーチ | HR3-172 | |
| 18 mMマウントナイロンループ(0.05 mm〜0.5 mM) | ハンプトンリサーチ | HR4-945、HR4-947、HR4-970、HR4-971 | |
| ビーズキット | ハンプトンリサーチ | HR2-320 | |
| 磁気結晶キャップハ | ンプトンリサーチ | HR4-779 | |
| クライオワンド | ハンプトンリサーチ | HR4-729 | |
| 極低温フォームデュワー | ハンプトンリサーチ | HR4-673 | |
| クリスタルパックシステム | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
| フルスカート96ウェルクリアプレート | VWR | 10011-228 | |
| AxyMatシーリングマット | VWR10011-130 | ||
| Equipment | |||
| UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
| Nanodrop Lite 分光光度計 | Thermo-Fisher | ||
| Mosquito Robot | TTP Labtech | ||
| Software/WebsitesHKL2000 | |||
| Otwinoski and Minor, 1997 | |||
| Phenix | Adams et al., 2010 | ||
| Coot | Emsley et al., 2010 | ||
| ATSAS | Petoukhov et al., 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
| Scatter | Rambo and Tainer, 2013 | ||
| Pymol | The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schröディンガー、LLC。 | ||
| BUNCH | Petoukhov and Svergun, 2005 | ||
| CRYSOL | Svergun et al, 1995 | ||
| PRIMUS | Konarev et al, 2003 | ||
| EOM | Tria et al, 2015 |
参考文献
- Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
- Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Kressler, D., Hurt, E., Bas....
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再版と許可
