高精度、キャピラリーを用いたマイクロ サンプリングを使用して代謝活動のスナップショットの化学的特性を容易に最小の侵入の個々 のセルの小さな部分の高速の場サンプリングを有効にする手順を述べる。特注の単一セルのキャピラリー電気泳動と質量分析プラットフォームを用いた胚を住んでいます。
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方法論記事
生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロ プローブ キャピラリー電気泳動質量分析法
この記事について
サマリー
要約
単一細胞における小分子の定量化は、萌芽期の開発の根底にある基本的なプロセスを理解の新たな可能性を発生させます。異なるセルのサイズは、敏感な選択的、定量的、堅牢で、スケーラブルな特に有効にする単一セル調査で直接ライブ胚、分析の新しいアプローチが必要です。ここでは、自由に南アフリカ爪カエル (アフリカツメガエル)、細胞および進化の生物学の強力なモデルの胚の開発に単一細胞における代謝の場解析を可能にするプロトコルを提案する.このアプローチは、隣接する細胞そのままその後の分析のための胚の単一の識別されたセルからの定義された部分を吸引するキャピラリー マイクロ プローブを使用します。高解像度のタンデム質量分析計を結合マイクロ キャピラリー電気泳動エレクトロ スプレー イオン化 (ESI-CE) インターフェイスによって収集されたセルの内容が分析されます。このアプローチは様々 なセル サイズにスケーラブルな成長の胚の複雑な三次元構造と互換性があります。たとえば、そのマイクロ プローブによる単一細胞 MS-CE により繰り広げられる前駆細胞は胚の開発の間に子孫を生じ、代謝細胞の多様性の解明を紹介します。細胞・発生生物学、以外にもここで説明した単一細胞解析プロトコルは、他のセル サイズ、セル種類、または動物モデルに従う。
概要
萌芽期の開発の包括的な理解には、発展途上の生物のすべてのセルに展開するすべての分子変化の特性評価が必要です。単一細胞トランスクリプトーム1開発システム2,3, かなり少ないの深い測定がより小さい分子のスイートについて知られている分子の増幅による次世代シーケンスが可能タンパク質と、特に、代謝産物などを含む単一の胚細胞で生産される (分子量 < 〜 1,500 Da)。組み込みと外因性のイベントに速い動的応答、メタボロームをセルの分子状態の強力な記述子として提供しています。したがって、単一細胞メタボロームは初期胚における細胞多様性の空間的で、一時的な開発を追跡する、機能研究のための新しい分子を識別する可能性を発生させます。しかし、これらの分子の分子増幅せず、メタボロームの検出要求卓越した感度の代謝物質の分析のための選択技術である質量分析法 (MS) を使用します。
単一セルの MS は (参照してくださいレビュー 4,5,6,7,
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プロトコル
保守に関連するすべてのプロトコルとアフリカツメガエルの取り扱い機関動物ケアとジョージ ・ ワシントン大学で利用委員会によって承認された (IACUC ないです。A311)。
1. 機器、メディア、溶剤をサンプリングし、料理をサンプリングの準備
- 次の順序で純水 (~18.2 MΩ.cm 25 ° C で) 次の塩を溶解することによりスタインバーグのソリューション (SS) × 1 を準備し、標準に従って指定された濃度でプロトコル33: 塩化ナトリウム (58.2 mM)、塩化カリウム (0.67 mM)、硝酸カルシウム (0.34 mM)、硫酸マグネシウム (0.83 mM)、トリス塩酸 (4.19 mM)、トリス基地 (0.66 mM)。0.5 × 2 倍で SS と 0.1 x 1 の 10 倍の希釈で SS SS 超純水を使用して x。
- SS. オートクレーブ 120 ° C で × 1 で作る最初の 2% の agarose によって溶解するのに 20 分間サンプリング料理を準備します。静止液体中のソリューションと 60 mm ペトリ皿の底をコートします。Agarose のゲルが冷却されて固化後炎 6 インチ パスツール ピペットの最後のボールを形成し、軽く agarose に 5-10 井戸、〜 1 mm の深さをインプリントする温水の端に触れるまで。
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結果
最近マイクロ プローブによる単一細胞を用いて自由にアフリカツメガエル胚29,30の開発に個々 の特定細胞代謝産物を特徴付ける CE ESI MS。マイクロ プローブにより、高速 (~ 5 sec/セル)、~ 10 の場で吸引個々 のセル、同じセルの複数の願望またはライブ胚 (図 1 b) の同じまたはそれ以降の段階でいくつかの異なる細胞から nL。適当な溶媒を使用して吸気の携帯電話コンテンツが抽出され、代謝物はそれから分かれている特注の CE esi を使用してイオン化しアプローチ (削除後 〜 300 非冗長代謝物の信号が得られますさん Typically によって検出されました。同位体ピークをクラスターと) 各セルから。分離は、図 2 aの分子の選択例示です。移行時間に基づく小型の極性代謝産物として.......
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ディスカッション
マイクロ プローブ MS-CE は、ライブ、自由に開発の胚の単一細胞における代謝物の直接評価できます。アプローチの中心に 2 つの技術的なサブコンポーネント、すなわちその場で毛細管特定と高感度 CE ESI さんに比べて細胞解離、毛細管特定高速動作 (5 分対数秒という利点があります。/郭清による細胞)、胚、および開発の後の段階でより小さいセルにスケーラビリティの複雑な三次元形態との互換性。解離とは異なりマイクロ プローブ サンプリングはそのまま胚の他のセル以降の分析のため。興味深いことに, microsampled 細胞が分裂し続ける, 細胞分化.の長期的な研究の可能性を高めるプローブの先端のサイズを制御する機能は、プローブ細胞およびゼブラフィッシュ、マウスなど、他のモデル生物を用いた発達過程における代謝の役割を研究するための汎用性の高いツールとして CE ESI MS もできます。信頼できる結果を保証するために、興味のセルは、正確に、正確に、かつ一貫して識別にし、サンプリングが重要です。吸引 (例えば、毛細管の寸法、圧力、および時間) の実験的パラメーターは、セルの所望の部分をサ.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は (P.N.) に健康補助金 GM114854 の国家機関によってサポートされて、(P.N.) に CA211635、アーノルドとメイベル ベックマン財団ベックマン若い調査官 (P.N.) に付与 (P.N.) にデュポン若い教授賞大量のアメリカの社会分析研究賞 (P.N.) を (R.M.O. および E.P.P.) にコスモス クラブ財団奨学金。意見と結論この書において表明のだけは、著者の資金源の公式見解を必ずしも表さない。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 胚培養用試薬Reagents for Medium | |||
| 塩化カリウム | フィッシャーサイエンティフィック | BP 366-1 | |
| 硫酸マグネシウム | フィッシャーサイエンティフィック | M 65-3 | |
| 硝酸カルシウム | シグマ アルドリッチ | C1396 | |
| システイン | MP バイオメディカル | 101444 | |
| Trizma塩酸塩 | Sigma Aldrich | T3253 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| 塩化ナトリウム | フィッシャーサイエンティフィック | 5641-212 | |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| 代謝物抽出溶媒トニトリル> | |||
| LC-MSグレード) | フィッシャーサイエンティフィック | A955 | |
| メタノール(LC-MSグレード) | フィッシャーサイエンティフィック | A456 | |
| 水(LC-MSグレード) | フィッシャーサイエンティフィック | W6 | |
| 名前 | 会社名 | カタログ番号 | コメント |
| CE-ESI-MSの溶媒と標準 | |||
| ギ酸(LC-MSグレード) | フィッシャーサイエンティフィック | A11710X1-AMP | |
| メタノール(LC-MSグレード) | フィッシャーサイエンティフィック | A456-4 | |
| 水(LC-MSグレード) | フィッシャーサイエンティフィック | W6 | |
| 塩化ナトリウム | ッシャーサイエンティフィック | 5641-212 | |
| アセチルコリン塩化 | アクロス有機159170050 | ||
| 名前 | Company | カタログ番号 | コメント |
| >Microprobe製造セットアップ | |||
| マイクロピペットプーラー | Sutter Instrument Co. | P-1000 | |
| ホウケイ酸毛細血管 | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| 細かい鋭利な鉗子: Dumont #5, Biologie/Dumoxel | Fine Science Tools (USA) Inc | 11252-30 | 耐腐食性およびオートクレーブ可能。 |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| Microprobeサンプリングセットアップ | |||
| Micromanipulator | Eppendorf, Hauppauge, NY | TransferMan 4r | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | 振動的に絶縁されている必要があります。 |
| イルミネーター(例:グースネックス | ニコン、 | C-FLED2 | |
| 、マイクロインジェクター | 、ワーナーインスツルメンツ、ハンデム、CT | PLI-100A | |
| 、トランスファーピペット(プラスチック、使い捨て) | フィッシャー・サイエンティフィック | 13-711-7M | |
| シャーレ 60 mm & 80 mm | フィッシャー・サイエンティフィ | S08184 | |
| ガラス製パスツールピペット(ホウケイ酸、使い捨て) | フィッシャー・サイエンティフィ | 13-678-20A | |
| 遠心分離機 | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R | |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| >CE-ESI-MS Setup | |||
| 高電圧電源 | スペルマン | CZE1000R | HVPSは、パソコンで生成された低電圧プログラムを使用してリモート制御できます。注意: 高電圧は感電の危険をもたらします。すべての接続部品は、ユーザーが誤って露出するのを防ぐために、接地するか慎重にシールドする必要があります。 |
| シリンジポンプ (2) | ハーバード装置 | 704506 | |
| 実体顕微鏡 | Amscope | SM-3BZZ | 4.5倍以上の倍率が可能な実体顕微鏡で、CE-ESIインターフェースの噴霧モードを監視するための照明器を装備しています。 |
| XYZトランスレーションステージ | Thorlabs | PT3 | |
| XYZトランスレーションステージ | カスタムメイド | このプラットフォームは、流体力学的な注入によりナノリットル量のサンプルを分離キャピラリーにロードし、CE用のBGEを供給することができます。この作業で説明した両方のインターフェイスは、6&ndash を注入することができました。1 mの分離キャピラリーに1分以内に10 nL | |
| ステンレス製サンプルバイアル | カスタムメイド | ||
| ステンレス製BGEバイアル | カスタムメイド | ||
| フューズドシリカキャピラリー(40 & micro;M/105 & マイクロ;m ID / OD;100 cm) | ポリミクロテクノロジー | TSP040105 | |
| 溶融シリカキャピラリー(75 &M/360 & マイクロ;m ID / OD;100 cm) | Polymicro technologies | TSP075375 | |
| 鈍い先端を備えたステンレス鋼エミッター (130/260 & マイクロ;m ID/OD) | ハミルトン(株) | 21031A | パフォーマンスを向上させるには、エミッター先端をレーザー切断して微調整します。 |
| シリンジ(気密):500 - 1000 µL | ハミルトン株式会社 | 1750TTL | |
| デジタルマルチメーター | フルーク | 117 | |
| 高分解能質量分析計 | ブルカー・ダルトニクス | Maxis Impact HD | ESI用に構成された大気圧インターフェースを装備した高分解能タンデム質量分析計 |
| 分析計校正用チューニング混合物 | アジレント技術 | ESI-L G1969-85000 | |
| データ分析ver. 4.3 ソフトウェア | Bruker Daltonics | ||
| Name | Company | カタログ番号 | Comments |
| Ancillary Equipment | |||
| Vacuum コンセントレーター 4–10°C;C | Labconco | 7310022 | |
| Analytical microbalance (XSE105DU) | Fisher Scientific | 01911005 | |
| Freezer (-20 >C) | フィッシャーサイエンティフィック | 97-926-1 | |
| 冷凍庫(-80°C;C) | フィッシャーサイエンティフィ | 88300ASP | |
| 冷蔵インキュベーター | フィッシャーサイエンティフィ | 11475126 | |
| ボルテックスミキサー | ベンチマーク | BS-VM-1000 |
参考文献
- Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
- Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assem....
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再版と許可
