方法論記事

生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロ プローブ キャピラリー電気泳動質量分析法

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DOI：

10.3791/56956

⸱

2017年12月22日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, George Washington University, 2Department of Anatomy & Regenerative Biology, George Washington University, 3Department of Chemistry & Biochemistry, University of Maryland, College Park

この記事について

サマリー

高精度、キャピラリーを用いたマイクロ サンプリングを使用して代謝活動のスナップショットの化学的特性を容易に最小の侵入の個々 のセルの小さな部分の高速の場サンプリングを有効にする手順を述べる。特注の単一セルのキャピラリー電気泳動と質量分析プラットフォームを用いた胚を住んでいます。

要約

単一細胞における小分子の定量化は、萌芽期の開発の根底にある基本的なプロセスを理解の新たな可能性を発生させます。異なるセルのサイズは、敏感な選択的、定量的、堅牢で、スケーラブルな特に有効にする単一セル調査で直接ライブ胚、分析の新しいアプローチが必要です。ここでは、自由に南アフリカ爪カエル (アフリカツメガエル)、細胞および進化の生物学の強力なモデルの胚の開発に単一細胞における代謝の場解析を可能にするプロトコルを提案する.このアプローチは、隣接する細胞そのままその後の分析のための胚の単一の識別されたセルからの定義された部分を吸引するキャピラリー マイクロ プローブを使用します。高解像度のタンデム質量分析計を結合マイクロ キャピラリー電気泳動エレクトロ スプレー イオン化 (ESI-CE) インターフェイスによって収集されたセルの内容が分析されます。このアプローチは様々 なセル サイズにスケーラブルな成長の胚の複雑な三次元構造と互換性があります。たとえば、そのマイクロ プローブによる単一細胞 MS-CE により繰り広げられる前駆細胞は胚の開発の間に子孫を生じ、代謝細胞の多様性の解明を紹介します。細胞・発生生物学、以外にもここで説明した単一細胞解析プロトコルは、他のセル サイズ、セル種類、または動物モデルに従う。

概要

萌芽期の開発の包括的な理解には、発展途上の生物のすべてのセルに展開するすべての分子変化の特性評価が必要です。単一細胞トランスクリプトーム1開発システム2,3, かなり少ないの深い測定がより小さい分子のスイートについて知られている分子の増幅による次世代シーケンスが可能タンパク質と、特に、代謝産物などを含む単一の胚細胞で生産される (分子量 < 〜 1,500 Da)。組み込みと外因性のイベントに速い動的応答、メタボロームをセルの分子状態の強力な記述子として提供しています。したがって、単一細胞メタボロームは初期胚における細胞多様性の空間的で、一時的な開発を追跡する、機能研究のための新しい分子を識別する可能性を発生させます。しかし、これらの分子の分子増幅せず、メタボロームの検出要求卓越した感度の代謝物質の分析のための選択技術である質量分析法 (MS) を使用します。

単一セルの MS は (参照してくださいレビュー 4,5,6,7,8,9 単一細胞における代謝物の測定に十分な感度と技術のコレクション ,,1011,12,13,14,15)。細胞の再現性の高いサンプリングと代謝産物の効率的な抽出成功した単一細胞における代謝物の検出に不可欠です。アフリカツメガエル胚から細胞を特定の細胞解離は、低分子化合物やペプチド16の特性を可能にしました。他のアプローチは、エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) MS を用いた検出続く個々 の生きているセルのサンプルをマイクロ ピペットを採用しています。たとえば、代謝物は流体力顕微鏡20、その他技術21、間、単一のプローブ19, 圧力プローブ18単一セル ビデオ MS17によって植物や哺乳類細胞で測定しました。 22,23,24。さらに、単一セルの MS ワークフローにイオン化する前に化学分離の定款は効率的にメタボローム、したがって検出前にイオン生成中に潜在的な干渉を軽減することを簡素化します。重要なは、分離はまた分子の同定を支援する化合物に固有の情報を提供します。キャピラリー電気泳動 (CE) は、単一切り裂かれた25,26または microsampled27ニューロン、ニューロン表現型の小分子の違いをキャプチャの代謝物を検出するために使用されています。我々 は最近、ESI タンデムアフリカツメガエル16,28の初期胚から切除した個々 の細胞における代謝物の何百ものトレース レベルの検出を有効にするには、MS に CE を適応しました。これらの研究は驚くべき代謝開発の初期段階に胚細胞の違いを明らかに、不明な発達影響16以前と代謝産物の発見につながった。

ここでは、直接マイクロ プローブによる単一細胞 CE ESI MS29,30を使用して生きている脊椎動物の胚の単一細胞における代謝物の検出を有効にするプロトコルを提供します。選択モデル有機体はセル 32 にまでの制限 8 X. laevis胚のアプローチが開発、その他各種モデル生物の後の段階に適用されるも。このプロトコルは、識別された細胞その場で形態学的に複雑な胚での ~ 10 nL 部分を吸引するのに高解像度イメージング システムによる多軸並進制御の指導の下でのシャープの毛細血管を使用します。このプローブは、小さいセルまで拡張可能、胚における細胞系譜を追跡するために十分な速さである数秒以内に、動作します。極の抽出や極冠小分子、代謝産物など 4 〜 5 で収集したサンプル由来のペプチドの後ハイフン ESI 質量分析計と特注の CE プラットフォームで得られた抽出液の nL を分析 ~ 10 μ L 抽出ソリューション。CE ESI MS プラットフォームの構築と運用は、他の場所で説明されているプロトコルに基づいています。31,32コーアクシャル CE esi は他の場所で説明されているように構築されます。31 4-5 ログ順ダイナミック レンジ (相対28,29,30 で定量化のための機能を備えたトレース レベルの感度を達成するためにコーン ジェット スプレー政権でこのプラットフォームを維持します。または絶対16)。CE ESI MS プラットフォームが 10 のテスト範囲で定量で 8% 相対標準偏差 (RSD) で検出下限 60 amol を提供しています小さな分子の16 X の内因性代謝物の特性を十分である 1 μ M に nM。学細胞。Microprobed 細胞は胚開発30、細胞代謝の時間的、空間的分解解析を可能にするにつれて分裂し続けます。確かに、単一セル MS-CE は代謝の違いの背腹軸16,29、動物植物16、および左右28発達軸だけでなく、セルを占有するセルを検索する使用ことができます。X. laevis30の共通前駆細胞から神経組織運命背側系統を形成します。ここで説明されているプロトコルは、生体分子の広範な配列に適用されることを期待してX. laevis胚30のさまざまな発達段階で個々 の萌芽期細胞の代謝の違いを照会するほか、単一細胞 microsampled 細胞やモデル生物の他の種類と同様に、萌芽期の開発のさまざまな段階から。さらに、分離や生体分子の特性の非常に小さいサンプルと互換性のある別のプラットフォームを使用できますが、特定のため、プローブが使用できます。

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プロトコル

保守に関連するすべてのプロトコルとアフリカツメガエルの取り扱い機関動物ケアとジョージ ・ ワシントン大学で利用委員会によって承認された (IACUC ないです。A311)。

1. 機器、メディア、溶剤をサンプリングし、料理をサンプリングの準備

  1. 次の順序で純水 (~18.2 MΩ.cm 25 ° C で) 次の塩を溶解することによりスタインバーグのソリューション (SS) × 1 を準備し、標準に従って指定された濃度でプロトコル33: 塩化ナトリウム (58.2 mM)、塩化カリウム (0.67 mM)、硝酸カルシウム (0.34 mM)、硫酸マグネシウム (0.83 mM)、トリス塩酸 (4.19 mM)、トリス基地 (0.66 mM)。0.5 × 2 倍で SS と 0.1 x 1 の 10 倍の希釈で SS SS 超純水を使用して x。
  2. SS. オートクレーブ 120 ° C で × 1 で作る最初の 2% の agarose によって溶解するのに 20 分間サンプリング料理を準備します。静止液体中のソリューションと 60 mm ペトリ皿の底をコートします。Agarose のゲルが冷却されて固化後炎 6 インチ パスツール ピペットの最後のボールを形成し、軽く agarose に 5-10 井戸、〜 1 mm の深さをインプリントする温水の端に触れるまで。
    注: これらの井戸は、サンプリング中に胚を固定する使用されます。
  3. 代謝物抽出溶媒を準備します。(例えば、極性および pH) 溶媒の物理化学的性質を分子研究に関心のあるクラスに調整します。
    注: たとえば、我々 40% メタノールと使用 LC MS グレード水 40% アセトニ トリル発見アプローチとしてターゲットに主に代謝物といくつかの極冠代謝産物とペプチド28。
  4. きれいな髪とも優しく最小限の摂動をペトリ皿に胚を移動するための33のパスツール ピペットを使用して髪のループを作る。
  5. 図 1 aに示すように、テーパー チップ マイクロ ピペットを作製します。
    1. 最初に、次の設定で燃えるようなブラウン タイプのキャピラリー引き手でホウケイ酸毛細血管 (1,000/500 μ m 外径/内径) を引く: 熱 = 355;プル速度 65 を = = 80。時間 = 150。
    2. 次に、断絶するキャピラリー先端 〜 20 μ m の外径、精度と再現性を支援するために顕微鏡下でこの手順を取得する高級シャープな鉗子のペアを使用して引っ張られた micropipette の先端。
      注: 先端に小さな毛細血管、細胞質の粘性の吸引時に目詰まりを起こし。大きなヒントと毛細血管は確かに目詰まりを避けるために、携帯電話コンテンツの吸引を助ける, 大口径毛細血管がより小さい細胞のサンプリング中に課題を提起、その後サンプリング用のセルを破損する可能性が。慎重に圧力と吸引の時間は部分的にこれらの課題を軽減するかもしれない。我々 はここで示した作業の理想的な 〜 20 μ m 外径用マイクロ ピペットを見つけます。

2. 特定の単一細胞と代謝物抽出

  1. アダルトアフリカツメガエルの性腺刺激ホルモンによる自然交配を通じて胚 (受精卵) を取得または体外受精の説明に従って経由でプロトコルの他の場所で33,34。
    注: 自然交配により、体外受精によって得られた胚は供給でより信頼性の高い、胚の発育段階が時間をずらしています。ただし、体外受精は、大人の男性のカエルを犠牲にする必要があります。
  2. 新鮮なシステインの 4 g を 200 mL の純水に溶解して 2% システイン dejellying ソリューションを準備し、滴下 pH 8 10 N 水酸化ナトリウム溶液を使用するソリューションを調整します。
  3. 2 細胞期に劈開は次のように開始すると胚を囲むゼリー コートを脱ぐ: 胚は 2 分のための dejellying ソリューションの残りの部分し、胚がコレクションの表面に付着するを防ぐためにさらに 2 分のためにそれらを軽く旋回させる料理。
  4. 優しく料理内容をきれいなビーカーに注ぐし、すぐにビーカーから dejellying のソリューションをデカントします。0.1 x で卵をすぐにカバー残りを洗い流す SS dejellying ソリューション、ゆっくり旋回し、デカントのソリューション。胚を徹底的に洗浄する 4 回のこの手順を繰り返します。
    注: は、胚の生存性を確保するため 4 分 dejellying ソリューションへの露出を制限します。ゼリーのコートを削除する包括的なプロトコルが別の場所で33。
  5. 1 にゼリーの胚を転送ペトリ皿で SS x。プレート内混雑を最小限に抑える、100 mm ディッシュ33あたり 100 〜 胚を配置します。
    注意: 開発を遅くし、同じ両親から千鳥の発達段階で胚を取得 14-18 ° C の間の胚を含んでいる皿を格納できます。成長と発展の温度依存性についてはさらに、Xenbase と別の場所に公開33,35,36,37。
  6. 自信を持っているステレオタイプ的な色素沈着の別皿に 2 細胞期の胚を切断の並べ替えは、背腹軸、細胞運命地図38,39,40を参照してをマークします。
    1. 最初の胸の谷間の溝は、正中矢状面に境界を定めます、二等分する正しく切断胚を識別、暗く (腹側) と軽く動物極ピグメント (背側) 2 つの半分が鏡像41をされるようです。
  7. 多軸マイクロマニピュレーター (手動またはリモートで制御される) で作製したマイクロ ピペットをマウントします。マイクロ ピペットに接続します。
  8. 5 〜 8 細胞期胚を吸引し、0.5 を含むサンプリング皿に転送する転送プラスチック ピペットを使用して x の SS。
毛のループを使用して、個々 の井戸にサンプリングして興味の特定の細胞は ~ 90 ° の角度でプローブを直面していることを確認する胚を位置します。
注: は、色素沈着と細胞運命地図38,39,40を参照しての胚の位置に基づいてセルを識別します。
  • (20-30 倍) に実体顕微鏡下での作業中、図 1 (パネル C の装置とパネル B 細胞上のポイントをサンプリングを参照) に示すように、生きている胚内で識別された単一のセルに、ピペットの先端をガイドします。
  • マイクロインジェクター (塗りつぶしモード) を使用してマイクロキャピ ラリーに負圧パルスを適用することによりセルの内容の所望の部分を撤回します。
    注: たとえば、我々 定期的に吸引 10 〜 15-30 psi の ~ 3 パルスを毛細血管に適用することによりセルから nL ボリューム。この全体のステップの持続 〜 5 吸引30s。
  • 優しくセルからプローブを撤回し、マイクロ サイズの瓶で代謝物抽出溶媒冷蔵 (4 ° C) の 4 μ L に、その先端を転送します。次に、1 の 80 psi の圧力サージを適用溶媒に、吸引を追放するマイクロインジェクター (「はっきりモード」) を使用して毛細血管に s。
    1. 蒸発を防止し、サンプリングが完了するまで 4 ° C の氷のバケツにバイアルを配置するバイアルをしっかりと閉じます。針刺しの危険性を防ぐために鋭利な容器に使用されるマイクロ ピペットを破棄します。
      注: 吸気セルの内容のボリュームを決定するには、鉱物油、球形の形を得るところに、吸引を挿入します。この球の直径は、顕微鏡を使用して測定できます。吸気量を計算: V = 4/3 π r3、 Vはボリュームあり、 rは球の半径です。
  • もう一度同じセルまたは胚の他の細胞をサンプルするには、手順 2.7 2.11 (図 1 c)。連続サンプリングの間に潜在的な実行を避けるため、別の各セルの分析のため新鮮なピペットを使用します。
  • サンプリングが完了すると、渦混合する代謝物の抽出を促進し、細胞残渣および他の微粒子のペレットへの 4 ° C で 5 分間 8,000 × gで遠心分離機に 〜 1 分のサンプルを含む遠心バイアル。
  • 細胞の残骸とともに沈殿材料日-20 ° c または CE ESI 質量測定まで最大 1 ヶ月間-80 ° c 細胞抽出物を保存します。

    • 3. CE ESI MS 測定

    1. MS-CE の標準とソリューションの準備
      1. LC MS グレード水の 1% ギ酸から成る背景電解質 (BGE) を準備します。
      2. LC MS グレード水と 0.1% ギ酸で 50% メタノールを格納する鞘ソリューションを準備します。
      3. 毎日 CE ESI MS システムの性能評価のためシース液 50 nM アセチルコリン ソリューションを準備します。
      4. ポジティブ イオン モードで低m/z範囲の質量校正用標準として 150 mM 塩化ナトリウム溶液を準備します。質量 (m/z) 精度 < 10 ppm をお勧めします。この手順を実行する質量分析計のベンダーの指示に従います。
        注: また、知られているm/zの値とその他の標準使用できます質量 - 質量分析計を校正します。
    2. CE ESI プラットフォームの構築
      1. BGE バイアルと microvial を読み込むサンプルを保持してステージの急速な並進できる CE 射出プラットフォームを構築します。建設とプラットフォームの操作で、参照31の詳細を参照してください。
      2. CE ESI インターフェイス (図 1 c) をアセンブルするには、次。3 ポートの T 組合にエレクトロ金属エミッタ (130/260 μ m 内側/外側の直径と 〜 35 mm 長さ) をマウントします。40 ~ 100 を突出することができますエレクトロ スプレー エミッタを分離 CE キャピラリー (40/105 μ m 内側/外側の直径と 〜 100 cm 長さ) を送り、エミッタの先端を越えて μ m。精度を支援するために顕微鏡の下で働きます。
        1. シース ソリューション毛細血管 (75/360 μ m 内側/外側の直径と 〜 100 cm 長さ) をエレクトロ スプレー ソリューションを供給する残りのポートに接続します。適切なスリーブを使用して、CE の esi の漏れのない操作の接続を指締めます。以前プロトコル31,32アセンブリとこのインターフェイスのトラブルシューティングの詳細についてを参照してください。
          注: 毛細管の寸法に影響を与える信号対雑音比 (S/N) と分離の期間。たとえば、管狭穴、短いは高い分離電圧42,43を使用して高速分離を促進します。さらに、研究で興味の分子の種類に応じて分離毛細血管は不要な分子毛細血管壁相互作用44の最小化/回避にコーティングする可能性があります。
      3. プレート ホルダーを使用すると、3 軸翻訳舞台に esi CE をマウントし、エレクトロ スプレー エミッタ先端から質量分析計のオリフィス (図 1 c) 〜 2 mm を配置します。
      4. インターフェイスのきれいなコンポーネントに 1 μ L/分でエレクトロ スプレー エミッタを静電シース ソリューションとキャピラリーの CE 分離による BGE を指定してすすいでください。シリンジ ポンプを使用して、一定の速度で溶剤をフィードします。
      5. キャピラリーの入口側に注射器を接続して各測定前に CE 分離キャピラリをフラッシュします。補充と溶媒供給ラインのプライミングを最小限に十分に大きな注射器を使用します。
        注: 実験通常エレクトロ スプレー鞘溶媒と分離キャピラリをフラッシュするのに 500 μ L のシリンジを供給するのに 1 mL ガスタイトな注射器を使用します。
    3. CE ESI MS プラットフォームおよび代謝物の測定の検証
      注: この手順の目標は、単一セルの抽出物を分析する前に毎日 CE ESI 質量計測器の感度を確認します。
    ここで説明されている CE ESI プラットフォームを使用して、四重極直交加速飛行時間質量分析計16を使用して 60 の amol の検出下限を実現できます。
    1. 〜 5 分間分離キャピラリを洗浄した後ステンレス製バイアルにある BGE ソリューションにその入口を転送します。
    2. エレクトロ スプレー エミッタ先端質量分析計のオリフィスから ~ 2 mm 位置し、顕微鏡を使用してスプレーを監視しながら安定したコーン ジェット政権でエレクトロ スプレーを生成する翻訳段階を使用してこの距離を微調整 (参照31,45)。30 〜 45 の総イオン電流 (TIC) の安定性を監視分安定動作を確保します。
    3. 〜 20 の適用可能性以上 〜 15 徐々 に増強により BGE バイアルに kV s、通常、BGE として 1% ギ酸を用いた分離毛細血管全体 ~7.5 μ A の電流を生成します。各測定の前に、5 〜 10 分間チック プロファイルを監視することによってシステムの安定性を確保して step-wise (グラウンド) を 0 V (CE) の分離可能性を下ろしてください。
      注: 半自動化するのにこのプロセスは、我々 ソフトウェアを使用カスタム書かれた CE 高電圧電源供給31をリモートで制御します。CE ESI MS プラットフォームが安定していない場合慎重に ESI 専用モードで CE ESI MS プラットフォームを最初にテストすることによって不安定性のソースを評価し、として CE ESI 運用モードをお勧めします他31。簡単に、ESI 専用モードでは、プラットフォームをテスト、CE の高電圧をオフにし、コーン ジェット スプレー政権で 30 分程度のチックを監視します。必要に応じて、手順に従ってアドレス エラー: 接続リークを検査 (i)(ii) 水、イソプロパノール、水、メタノール; とエレクトロ スプレー エミッタをきれい(iii) 解消ガス溶剤;(iv) 〜 25 分のエミッタを再びテストする前にフラッシュします。CE ESI プラットフォーム ESI 専用モードで安定しているがある CE 分離中が不安定になる場合は、ジュール熱や電気分解システムを検査: (i) BGE 〜 25 分の分離・毛管をフラッシュし、; 実験を繰り返す(ii) 線形オーミック応答 (すなわち、線形 CE 分離電圧曲線対現在); を維持するためにより低い分離電位を使用します。(iii) CE キャピラリを用いた亀裂などの潜在的な損傷を点検し、必要に応じて、毛細血管を交換しています。
    4. 〜 6 の分析通りサンプルの nL:
      1. 注射バイアルにアセチルコリン標準液 1 μ L をピペットします。
      2. BGE バイアルから注射バイアルに分離キャピラリを転送します。
      3. 1 秒で CE 射出ステージ 15 cm を持ち上げます。
      4. 60 のための上昇ステージを保持 s 〜 6 流体を注入するキャピラリー分離にサンプルの nL。
      5. その後、翻訳 (キャピラリー出口) に合わせてレベルを開始するバック ステージ。
      6. 優しく、BGE キャピラリー入口側に移動します。
      7. すぐ後に電気泳動分離を開始する CE 電圧を立ち上げます。
      8. 開始 MS データ集録。
        注: システムの性能は、任意の化学の標準を使用して特徴付けることができます。単一セルの CE ESI MS 提供 ~ 10 で検出限界を下げるアセチルコリン、メチオニン、ヒスチジン、16nM (~ 60 amol)。注入量 (Vinj) nL、毛細血管に異なります (H、cm) の高さの違い注入、密度 (ρ、g cm-3) と粘度 (η、kg m-1の-1) の間に BGE、長さ (L, m) と CE の半径 (r, μ m) のキャピラリーと噴射時間 (tinjs)。この関係は、ここでg (m s-2) は重力加速度、次の数式で表されます。
        figure-protocol-1
    5. 標準が検出されると、データ集録を停止低い分離電圧 0 V を段階的 (グラウンド)、口から 2 cm にエミッタを取得します。細胞抽出液を分析する前に 5 分間分離キャピラリをフラッシュします。
    6. 単一セルのメジャー 10 nL 抽出手順 3.3.1-3.3.5 を繰り返すことによって 90 を使用して流体サンプルを注入する s。
  • データ処理
    注: データ処理の目的は、単一の細胞間の物質を定量化することです。単一セル--MS ESI プロトコルは、数秒の典型的な基本幅の狭い electropherographic のピークを生成します。それは分子機能 (固有の移行時間とユニークなm/z値) を見つけることは半手動でデータ分析を実行する次の手順を使用して。図 2 a選択識別された代謝産物の代表的な分離を示します。
    1. データ集録後の生データ ファイルの質量校正します。
      注: 我々 はナトリウム ギ酸クラスターからサンプルから豊富なナトリウム イオンの分離中に生成されるネイティブで、細胞内に存在または胚の培養液から抽出された信号を使用します。このステップの目標できれば高質量 (m/z) 精度を確保することによって後の手順で代謝物同定を強化することです < 5 mDa または < m/z 50-1 000 の間の 10 ppm。ここでは、ポスト データ集録校正により日常的に質量精度を得ることが可能 < 1 mDa または < 2 m/z 50-500 ppm。
    2. 検出質量範囲にわたって分子機能を検索処理のスクリプトを使用します。正確な質量を決定する、対応する移行の時間を注意してくださいに各ピークの質量スペクトルの平均値します。M/z 50-500 の範囲で低質量代謝物の同定、「500 mDa 手順ウィンドウを使用して S/n の分子機能を監視 > 3。
    3. 手動でまたは自動的にピーク領域-下-の - の曲線各分子の機能を統合します。結果の領域の値は、代謝物の豊かさの指標として使用されます。
    4. (図を参照してください次のように精度の高い、興味の分子の機能を識別します。
    • 2 b)。
    1. まず、10 ppm 精度の推定質量試合の一覧を取得する (例えば、Metlin46 、47検体) 代謝産物データベースに対して分子の機能の正確な質量を比較します。
    2. 次に、セルから得られるそのタンデム質量スペクトルを比較することによりこれらの大量の一致を評価標準対応する化学測定代謝産物データベースまたはタンデム質量スペクトルで利用可能なデータを抽出します。
    3. 最後に、同じ楽器の CE ESI MS で分析化学の関連の規格と細胞抽出物に記録された分子の機能の移行時間を比較することによってこれらの割り当てを検証します。
      注: 実験的スループットを高めるためには、我々 通常識別実験条件や細胞の種類の間に有意差がある分子機能だけ。代表的な識別は、図 2のとおりです。質量精度の高い代謝物を識別するためをお勧めします毎日、質量分析計のキャリブレーションを行う外部内部標準を使用しておよび/または外部質量校正各測定毎に、測定中にリアルタイムの再キャリブレーションを実行します。ファイル ポスト データ集録 (例えば、ナトリウム ギ酸クラスターここ) をお勧めします。
  • 単一細胞間小分子の生産を比較するには、化合物の豊かさの相対的な措置として (ステップ 3.4.3) から選択したイオン エレクトロフェロでピーク面積-下-の-曲線を使用します。
    注: 実験では、以降のデータ解析、次の手順のすべての手順を実行に使用されたオンライン ソフトウェア プラットフォーム47 : 私) 分子機能のフィルター処理 (例えばセル各サンプル セットの少なくとも 50% の発生と型)ii) データの正規化iii) 統計 (例えば, t-テスト)、主成分分析 (PCA) など階層的クラスター分析 (HCA) の多変量データ解析。Pを使用して、我々 < 0.05 (Student のt-テスト) 統計的有意性をマークし、フォールドの変更 ≥ 1.5 生物学的意義を注意してください。
  • 単一のセルに小さな分子の絶対濃度を測定、キャリブレーション (例えば、外部キャリブレーションまたは標準添加) の古典的な方法を実装ピーク面積-下-の-曲線興味16の化合物を使用しています。

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    結果

    最近マイクロ プローブによる単一細胞を用いて自由にアフリカツメガエル胚29,30の開発に個々 の特定細胞代謝産物を特徴付ける CE ESI MS。マイクロ プローブにより、高速 (~ 5 sec/セル)、~ 10 の場で吸引個々 のセル、同じセルの複数の願望またはライブ胚 (図 1 b) の同じまたはそれ以降の段階でいくつかの異なる細胞から nL。適当な溶媒を使用して吸気の携帯電話コンテンツが抽出され、代謝物はそれから分かれている特注の CE esi を使用してイオン化しアプローチ (削除後 〜 300 非冗長代謝物の信号が得られますさん Typically によって検出されました。同位体ピークをクラスターと) 各セルから。分離は、図 2 aの分子の選択例示です。移行時間に基づく小型の極性代謝産物として...

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    ディスカッション

    マイクロ プローブ MS-CE は、ライブ、自由に開発の胚の単一細胞における代謝物の直接評価できます。アプローチの中心に 2 つの技術的なサブコンポーネント、すなわちその場で毛細管特定と高感度 CE ESI さんに比べて細胞解離、毛細管特定高速動作 (5 分対数秒という利点があります。/郭清による細胞)、胚、および開発の後の段階でより小さいセルにスケーラビリティの複雑な三次元形態との互換性。解離とは異なりマイクロ プローブ サンプリングはそのまま胚の他のセル以降の分析のため。興味深いことに, microsampled 細胞が分裂し続ける, 細胞分化.の長期的な研究の可能性を高めるプローブの先端のサイズを制御する機能は、プローブ細胞およびゼブラフィッシュ、マウスなど、他のモデル生物を用いた発達過程における代謝の役割を研究するための汎用性の高いツールとして CE ESI MS もできます。信頼できる結果を保証するために、興味のセルは、正確に、正確に、かつ一貫して識別にし、サンプリングが重要です。吸引 (例えば、毛細管の寸法、圧力、および時間) の実験的パラメーターは、セルの所望の部分をサ...

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    開示事項

    著者が明らかに何もありません。

    謝辞

    この作品は (P.N.) に健康補助金 GM114854 の国家機関によってサポートされて、(P.N.) に CA211635、アーノルドとメイベル ベックマン財団ベックマン若い調査官 (P.N.) に付与 (P.N.) にデュポン若い教授賞大量のアメリカの社会分析研究賞 (P.N.) を (R.M.O. および E.P.P.) にコスモス クラブ財団奨学金。意見と結論この書において表明のだけは、著者の資金源の公式見解を必ずしも表さない。

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    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    胚培養用試薬Reagents for Medium
    塩化カリウムフィッシャーサイエンティフィックBP 366-1
    硫酸マグネシウムフィッシャーサイエンティフィックM 65-3
    硝酸カルシウムシグマ アルドリッチC1396
    システインMP バイオメディカル101444
    Trizma塩酸塩Sigma AldrichT3253
    Trizma baseSigma AldrichT1503
    塩化ナトリウムフィッシャーサイエンティフィック5641-212
    名前会社カタログ番号コメント
    代謝物抽出溶媒トニトリル>
    LC-MSグレード)フィッシャーサイエンティフィックA955
    メタノール(LC-MSグレード)フィッシャーサイエンティフィックA456
    水(LC-MSグレード)フィッシャーサイエンティフィックW6
    名前会社名カタログ番号コメント
    CE-ESI-MSの溶媒と標準
    ギ酸(LC-MSグレード)フィッシャーサイエンティフィックA11710X1-AMP
    メタノール(LC-MSグレード)フィッシャーサイエンティフィックA456-4
    水(LC-MSグレード)フィッシャーサイエンティフィックW6
    塩化ナトリウムッシャーサイエンティフィック5641-212
    アセチルコリン塩化アクロス有機159170050
    名前Companyカタログ番号コメント
    >Microprobe製造セットアップ
    マイクロピペットプーラーSutter Instrument Co.P-1000
    ホウケイ酸毛細血管Sutter Instrument Co.B100-50-10
    細かい鋭利な鉗子: Dumont #5, Biologie/DumoxelFine Science Tools (USA) Inc11252-30耐腐食性およびオートクレーブ可能。
    名前会社カタログ番号コメント
    Microprobeサンプリングセットアップ
    MicromanipulatorEppendorf, Hauppauge, NYTransferMan 4r
    StereomicroscopeNikonSMZ18振動的に絶縁されている必要があります。
    イルミネーター(例:グースネックスニコン、C-FLED2
    、マイクロインジェクター、ワーナーインスツルメンツ、ハンデム、CTPLI-100A
    、トランスファーピペット(プラスチック、使い捨て)フィッシャー・サイエンティフィック13-711-7M
    シャーレ 60 mm & 80 mmフィッシャー・サイエンティフィS08184
    ガラス製パスツールピペット(ホウケイ酸、使い捨て)フィッシャー・サイエンティフィ13-678-20A
    遠心分離機Thermo ScientificSorvall Legend X1R
    名前会社カタログ番号コメント
    >CE-ESI-MS Setup
    高電圧電源スペルマンCZE1000RHVPSは、パソコンで生成された低電圧プログラムを使用してリモート制御できます。注意: 高電圧は感電の危険をもたらします。すべての接続部品は、ユーザーが誤って露出するのを防ぐために、接地するか慎重にシールドする必要があります。
    シリンジポンプ (2)ハーバード装置704506
    実体顕微鏡AmscopeSM-3BZZ4.5倍以上の倍率が可能な実体顕微鏡で、CE-ESIインターフェースの噴霧モードを監視するための照明器を装備しています。
    XYZトランスレーションステージThorlabsPT3
    XYZトランスレーションステージカスタムメイドこのプラットフォームは、流体力学的な注入によりナノリットル量のサンプルを分離キャピラリーにロードし、CE用のBGEを供給することができます。この作業で説明した両方のインターフェイスは、6&ndash を注入することができました。1 mの分離キャピラリーに1分以内に10 nL
    ステンレス製サンプルバイアルカスタムメイド
    ステンレス製BGEバイアルカスタムメイド
    フューズドシリカキャピラリー(40 & micro;M/105 & マイクロ;m ID / OD;100 cm)ポリミクロテクノロジーTSP040105
    溶融シリカキャピラリー(75 &M/360 & マイクロ;m ID / OD;100 cm)Polymicro technologiesTSP075375
    鈍い先端を備えたステンレス鋼エミッター (130/260 & マイクロ;m ID/OD)ハミルトン(株)21031Aパフォーマンスを向上させるには、エミッター先端をレーザー切断して微調整します。
    シリンジ(気密):500 - 1000 µLハミルトン株式会社1750TTL
    デジタルマルチメーターフルーク117
    高分解能質量分析計ブルカー・ダルトニクスMaxis Impact HDESI用に構成された大気圧インターフェースを装備した高分解能タンデム質量分析計
    分析計校正用チューニング混合物アジレント技術ESI-L G1969-85000
    データ分析ver. 4.3 ソフトウェアBruker Daltonics
    NameCompanyカタログ番号Comments
    Ancillary Equipment
    Vacuum コンセントレーター 4–10°C;CLabconco7310022
    Analytical microbalance (XSE105DU)Fisher Scientific01911005
    Freezer (-20 >C)フィッシャーサイエンティフィック97-926-1
    冷凍庫(-80°C;C)フィッシャーサイエンティフィ88300ASP
    冷蔵インキュベーターフィッシャーサイエンティフィ11475126
    ボルテックスミキサーベンチマークBS-VM-1000
    フィ物、、ック ックのサンプル のの 質量ックック

    参考文献

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