インタラクトーム Seq: Domainome ライブラリーの構築、検証およびバクテリオファージの表示と次世代シーケンシングによる選択のプロトコル

Summary

説明されているプロトコルは、建設、特性および DNA の任意のソースから作られた"domainome"ライブラリの (好みのターゲット) に対して選択を許可します。さまざまな技術を組み合わせた研究パイプラインにより、これ: バクテリオファージの表示、折りたたみ記者とシークエンサー データ解析のための web ツールを使用します。

Abstract

折りたたみ記者、不十分な蛋白質またはランダムの開いたリーディング ・ フレームを折りに融合、その折りたたみそして機能が侵害された抗生の抵抗などのわかりやすい表現型を持つ蛋白質であります。、ゲノム スケールの TEM 1 β-ラクタマーゼ (アンピシリン耐性酵素) を使用して、我々 選択することが正しく折られた蛋白質ドメインのコレクションすべて intronless ゲノムの DNA のコーディングの部分から戦略を開発しました。呼ばれる"domainome"は、このアプローチによって得られるタンパク質の断片はよく表現された水溶性、構造・機能の研究に適してになります。

クローニングとファージ ディスプレーに直接"domainome"を表示する、我々 ことを示した (例えば、他の蛋白質に抗体)、目的の結合プロパティを持つ特定のタンパク質ドメインを選択することが可能不可欠提供実験的遺伝子アノテーションまたは抗原同定.について

選択したポリクローナル人口の最も豊かなクローンの識別は、新しい次世代シーケンシング技術 (NGS) を使用して実現できます。これらの理由から、ライブラリ自体の多様性、豊かさと選択したフラグメントのそれぞれの正確なマッピングに関する完全な情報を提供する選択出力のディープ シーケンス解析を紹介する.ここで紹介するプロトコルは、ライブラリーの構築、評価、検証にキーの手順を示します。

Introduction

ここでは、建設と任意の遺伝子/ゲノム開始ソースから折り返しと可溶性タンパク質ドメインの図書館の選択のための高スループット方法をについて説明します。3 種類のテクノロジーを組み合わせて方法: バクテリオファージの表示、データ分析のため折りたたみ記者と次世代シーケンシング (NGS) 特定の web ツールの使用。識別と新しいタンパク質/タンパク質ドメインのアノテーションの定義と同様、知られている蛋白質の構造と機能特性の評価のため蛋白質ベースの研究の多くの異なった文脈でメソッドを使用できます。タンパク質間相互作用ネットワーク。

蛋白質ベースの研究に多くの未解決の問題があるまだ最適なタンパク質生産技術の開発、調査のいくつかのフィールドの重要な必要性。たとえば、原核生物と真核生物のゲノム¹の何千もの可用性、にもかかわらずコード化されたタンパク質・ ペプチドの直接アノテーション付き相対プロテオームの対応するマップはまだ不足している生物の大多数のため。完全なプロテオームのカタログは、時間とリソースの面で多大な努力を必要とする挑戦的な目標として現れています。すべて、開いたリーディング ・ フレーム (ORFs)、ゲノムのと呼ばれる"ORFeome"の構築のクローニング実験的アノテーションのゴールド スタンダードのままです。通常遺伝子の機能は知られている活動の関連遺伝子に相同性に基づいて割り当てられているが、この手法は不十分な参照のデータベース^{2,3,4、多くの不適切な注釈の存在のために正確 5}。また、識別されていると、注釈が付けられた蛋白質のためもさらなる研究が豊富な構造特性と機能を含む別のコンテキストでの発現パターンの観点からの評価を達成するために必要なだけでなく相互作用のネットワーク。

さらに、蛋白質は、それらのそれぞれ異なるドメインから構成研究とこれらのドメインの正確な定義により包括的な画像、シングルで両方をできる特定の機能を示し、異なるタンパク質機能に貢献すること、遺伝子と全ゲノムのレベルで。このすべての必要な情報は、広く、やりがいのあるフィールドを蛋白質ベースの研究になります。

このような観点で蛋白質の生産のための公平かつ高スループット方法から重要な貢献を与えられます。ただし、かなりの投資が必要の横にある、このようなアプローチの成功は、水溶性/安定な蛋白質の構造を生成する能力に依存します。これは主要な制限の要因に蛋白質の約 30% が正常に表現し、実験的役に立つ^6,7、8に十分なレベルで生産、それが推定されているので。この制限を克服するためのアプローチは、個々 の遺伝子の重複フラグメント表現を一緒に提供する別のポリペプチドを生成するランダムに断片化された DNA の使用に基づきます。それらの大多数 (終止コドンをシーケンス内の存在) のための機能性または非天然 (元以外のフレームで ORF) 用にエンコードしながら、ランダムに生成された DNA のフラグメントのわずかな割合、機能 ORFsない生物学的意味を持つポリペプチド。

当社グループはこれらの問題に対処するゲノム スケールの^9,10、11,12に使用できるハイスループット蛋白質・表現と相互作用・解析・ プラットフォームを開発しました。このプラットフォームは、次のテクニックを統合: 1); 任意の有機体から DNA のコーディングの部分から正しく折られた蛋白質のドメインのコレクションを選択する方法2) ファージディスプレーの相互のパートナーを選択するため完全に調査の下で全体のインタラクトームを特徴付けるし、関心のクローンを識別する 3) NGS・ 4) ユーザー バイオインフォマティクスやプログラミングのスキルなし簡単で使いやすい方法で Seq インタラクトーム解析を実行するためのデータ解析のための web ツール。

このプラットフォームの利用調査の代替戦略上の重要な利点を提供しています。上記のすべてのメソッドは完全に公平な高スループット、および全ゲノムまで単一の遺伝子に至る研究のモジュール。パイプラインの最初のステップは、深く NGS によって特徴付けられる、調査の下でランダムに断片化された DNA からライブラリの作成です。このライブラリは、ペリプラズム空間 (すなわち、Sec リーダー) 蛋白質の分泌をシグナル配列と TEM1 β-ラクタマーゼ遺伝子間の興味の遺伝子/断片のクローン、組み換えベクターを使用して生成されます。融合タンパク質がアンピシリン抵抗性とクローンの断片がフレームの場合にのみ、アンピシリンの圧力の下で生き残るために能力を与えるこれらの要素とその結果の融合タンパク質が正しく折りたたまれた^{10,13 、14}。すべてのクローンと呼ばれる「フィルターのクローン」抗生物質の選択後に救出 ORFs、それら (80% 以上) の大多数、実際遺伝子⁹から派生しました。さらに、この戦略の力は、すべてのフィルター ORF クローンが正しく折り返されて/水溶性蛋白質/ドメイン¹⁵エンコーディングが所見であります。ライブラリと同じ地域/ドメインのマッピングの存在の多くのクローンがある異なる開始点と終了点は、この水溶性製品で発生する可能性が最小の断片の公平なシングル ・ ステップの識別できます。

技術のそれ以上の改善は、ライブラリを特徴付ける NGS の使用によって与えられます。このプラットフォームとデータ解析のための特定の web ツールの組み合わせを与えるさらに広範な分析を必要とせず研究下参照 DNA に関する重要な公平な情報正確な塩基配列と選択された ORFs の場所または実験的努力。

Domainome ライブラリは、選択のコンテキストに転送し、機能研究を実行する汎用計測器として使用できます。高スループット蛋白質表現と相互作用解析プラットフォーム統合、phagemid ベクトルにフィルターの ORF を転送し、バクテリオファージ ORF の作成によってバクテリオファージの表示技術の活用インタラクトーム Seq と呼ばれるライブラリ。一度再バクテリオファージ ディスプレイ コンテキスト、ドメインが M13 粒子の表面に表示されているタンパク質に複製この方法で、特定の酵素活性を持つドメインをエンコードまたはバインディング プロパティ、プロファイル インタラクトーム ネットワークことができます遺伝子断片の domainome ライブラリを直接選択できます。このアプローチは、Zacchiらによって見出されました。¹⁶後でいくつか他のコンテキスト^13,17,18。

(質量^19、20酵母 2 ハイブリッド系など) 蛋白質蛋白質の相互作用を研究するために使用する他の技術と比較して、1 つの主要な利点はバクテリオファージの中に発生する結合パートナーの増幅選択範囲の複数回が表示されます。したがって低豊富な結合蛋白質のドメイン ライブラリの存在の識別を許可選択感度が向上します。ORF フィルター ライブラリで実行される選択の効率は非機能的なクローンの不在のため増し。最後に、技術は蛋白質および非蛋白質餌^{21,22,23,24,25}に対して実行するを選択できます。

Domainome バクテリオファージのライブラリを使用してファージを選択は、餌として自己免疫疾患¹³がんや感染症など、病理学的条件の異なる患者の血清に由来する抗体を使用して実行できます。このアプローチを使用して、大規模を識別し、特に同時に患者の抗体によって認識される抗原/エピトープを特徴付けるように調査の下で疾患のいわゆる「抗体署名」を取得。他の方法と比較して、使用のバクテリオファージの表示により、線形および立体配座抗原エピトープの同定。特定の署名の識別には、病態理解、新しいワクチン デザイン、新しい治療標的の同定、新しいと特定診断と予後ツールの開発の重要な影響があります。また、感染症に関する研究をフォーカスすると、主要な利点ということです免疫原性タンパク質の検出病原体栽培から独立しました。

我々 のアプローチは、"domainome"を選択するゲノム スケールで折りたたみの記者が使える確認: DNA のコーディングの部分から正しく折られた、よく表現、可溶性タンパク質ドメインやすべての生物からの cDNA のコレクション。一度分離タンパク質断片が遺伝子アノテーションと同様構造の研究、抗体のエピトープ マッピング、抗原の同定などの本質的な実験的情報を提供する多くの目的のため役に立つ。NGS によって提供される高スループット データの完全性は、バクテリオファージの表示ライブラリなどの非常に複雑なサンプルの分析を可能し、伝統的な骨の折れるピッキングと救出された個々 の phage クローンのテストを回避する潜在性を保持します。

同時に極端な感度と NGS 解析の力し、フィルター処理したライブラリの機能のおかげで、それはそれぞれの相互作用を作成することがなく、最初の画面に直接責任がある蛋白質のドメインを識別することが可能それぞれの追加のライブラリは、タンパク質をバインドされています。NGS は、任意の遺伝子/ゲノム開始ソースの全体の domainome の包括的な定義を取得することができます、データ分析 web ツールにより、特異性の高い特性両方の定性・定量用のポイントのビューからの入手、インタラクトーム蛋白質のドメイン。

Protocol

1、ORF ライブラリ (図 1) の建設

1. 挿入 DNA の準備
   1. フラグメントの合成またはゲノム DNA からの準備
      1. ^エキス/26標準的な方法を使用して DNA を浄化します。
      2. Sonication によって DNA のフラグメント。電源出力 100% で 30 秒パルスを用いた一般的な提案開始として標準的な超音波発生装置を使用してかどうか。
         注: パイロット実験は DNA の準備のための最適な条件を設定する別の電源と超音波処理時間でされるべきであります。各テスト後 agarose のゲルの電気泳動によって DNA のフラグメントのサイズを決定します。
      3. 一緒に 100 bp の DNA の梯子の 1.5% の agarose のゲルに熱量の DNA をロードします。5 V/cm の 15 分間で実行し、断片化された DNA の塗抹標本を含んでいるゲルの部分をカット、短い電気泳動を行います。
      4. 列ベースのゲルの抽出キットを挿入 DNA を浄化し、紫外線分光光度計を使用して濃度を測定します。
         注: 少なくとも 500 消化ベクトルの 1 μ g と結紮する手順 1.3 で説明したように、この手順の後の精製挿入 ng を取得必要があります。サンプルの低品質はライゲーション効率に影響を与えるので、_{260 nm}/A_{280 nm}と_{260 nm}/A_230nm比を評価することによってフラグメントの準備の質を確認してください。
      5. 製造元の指示に従ってクイック鈍化キット酵素ミックスの 1 μ L と、挿入の最大 5 μ g を扱います。使用するまで-20 ° C で 10 分サンプルを格納できるため、70 ° C で加熱することによって酵素を不活性化します。
   2. CDNA からのフラグメントの準備
      1. 標準的な方法 (例えば、 TRizol または同じような試薬を使用) と RNA を抽出します。
      2. 逆のトランスクリプションを実行する前に加熱による mRNA をフラグメントします。最終的な DNA フラグメントの長さは、mRNA の沸騰時間と任意プライマー濃度によって制御されます。たとえば、95 ° C で 6 分間のサンプルを加熱します。
      3. 製造元のプロトコルを次の使用可能なキットとランダムなプライマーを使用して cDNA を準備します。
      4. 37 ° C で 3 h のビオチン化ポリ dA との交配によるポリ dT ツインテールの cDNA を使い果たすし、Carninci et al.による記述でストレプトアビジン磁気ビードの分離¹³
      5. バインドされていない材料を回復し、製造元の指示に従って列に基づく DNA 精製キットで精製します。紫外線分光光度計を使用して濃度を測定します。1.1.1.4 の手順でメモを参照してください。
2. フィルタ リングのベクトルの準備
   1. 精製クローニング ベクトル pFILTER3¹² 10 U の EcoRV 制限の酵素、次の製造元のプロトコルとのダイジェスト 5 μ g。
   2. ロード 2 μ L (200 ng) 100 と共に、消化のベクトルの未消化のベクトルと 1 k bp 分子マーカーは、適切な消化力をチェックするための 1% アガロースゲル上の ng。熱は、制限酵素を不活性化します。
   3. ホスファターゼ バッファーとホスファターゼ 1 μ L (5 U) x 10 の 1/10 ボリュームを追加し、15 分熱は 65 ° C で 5 分間非アクティブにするために 37 ° C でインキュベート
   4. Agarose のゲルからの抽出によって消化されたプラスミドを浄化し、紫外線分光光度計を使用して濃度を測定します。サンプルは、使用するまで-20 ° C で保存できます。
3. 結紮と変換
   1. 結紮を次のように実行: 1 μ g 消化プラスミドの追加 400 ng のリン酸化挿入 (プラスミッド挿入モル比 1:5) の 10 倍の 10 μ L T4 DNA リガーゼ、100 μ L の最終巻で高濃度 T4 DNA リガーゼの 2 μ L 用のバッファーが 16 ° C overni で反応を孵化させなさい右側。10 分の 65 ° C で熱を不活性化します。
   2. 酢酸ナトリウム溶液 (3 M, pH 5.2) の 1/10 ボリュームを追加することにより結紮製品の沈殿物と 100% のエタノールの 2.5 倍の量。混合し、-80 ° C、20 分でフリーズします。
   3. 4 ° C で 20 分最大速度で遠心します。上清を捨てます。
   4. ペレットと最大速度で 4 ° C で 20 分間遠心する冷たい 70% エタノール 500 μ L を追加します。上清を捨てます。
   5. 空気は乾燥ペレットです。10 μ L の水に沈殿した DNA を再懸濁します。
   6. 細菌の細胞のエレクトロポレーションを実行します。
      注: (上記の DNA の μ g あたり 5 x 10⁹ transformants) 高効率電池の使用が必要です。大腸菌DH5αF の使用をお勧め ' (F'/endA1 hsd17 (rK − mK +) supE44 ティ 1recA1 ジャイラ (メルディ) relA1 (lacZYA 利用できません) U169 deoR (F80dlacD-(lacZ)M15) 生産家のまたはいくつかのメーカーから購入しました。
      1. 氷の上のマイクロ遠心チューブ用と 0.1 cm エレクトロポレーション キュヴェットの適切な数を配置します。細胞の 25 μ L に (純水) で精製した結紮ソリューションの 1 μ L を追加し、数回をはじきます。
      2. 冷たいキュベットに DNA 細胞の混合物を転送、2 x カウンターをタップ、キュベットの外から水を拭く、エレクトロポレーションの押すとモジュールのパルスに配置。
      3. 25 μ F、200 Ω 1.8 を使用して標準的な遺伝子導入装置マシンとエレクトロポレーションを行う kV。時定数 4-5 ミリ秒である必要があります。
   7. すぐに、抗生物質なし液体 2xYT 中の 1 mL を追加、10 mL のチューブに移し、37 ° C、1 時間 220 rpm で揺れで成長できるように。
   8. プレート変換 DH5αF' 15 cm 2xYT 寒天 34 μ G/ml クロラムフェニ コール (pFILTER 抵抗) と 25 μ G/ml アンピシリン (ORFs の選択的マーカー) 補われ、30 ° C で一晩インキュベート
   9. クロラムフェニ コール + アンピシリンとライブラリの滴定を行うにのみ、クロラムフェニ コールを添加した 10 cm 2xYT 寒天培地プレート上のライブラリの希釈液をプレートします。30 ° C で一晩インキュベートします。
4. pFILTER ORF ライブラリ検証
   1. 15-20 挿入サイズ分布推定クロラムフェニ コールとクロラムフェニ コール/アンピシリン プレートからコロニーをテストします。先端のシングル コロニーをピックアップし、抗生物質なし 2xYT 媒体の 100 μ L で個別にそれらを希釈します。製造元のプロトコルに続く任意の標準的な TaqDNA ポリメラーゼと DNA のテンプレートとして PCR の反作用のこのソリューションの 0.5 μ L を使用します。
   2. 25 サイクルの増幅器は 55 ° C、40 の延長時間 T 焼鈍を行う s 72 ° C でプライマー シーケンスは、テーブルの材料で提供されます。
   3. 一緒に 100 bp の DNA の梯子と実行の 1.5% の agarose のゲルの PCR の製品をロードします。
5. pFILTER ORF の図書館のコレクション
   1. 新鮮な 2xYT 培地 3 mL を追加して 150 mm 板から細菌を収集し、ミックス徹底的に滅菌スクレーパーと、それらを収穫して 20% 滅菌グリセリンで補完、小さい因数で-80 ° C で保存します。
   2. (グリセロール添加) の前に、ライブラリの 1 つの因数からプラスミド DNA を浄化の製造元の指示に従って列に基づくプラスミド抽出キットを使用しています。
   3. 紫外線分光光度計で濃度を測定します。-20 ° C まででサンプルを格納できる NGS phagemid ライブラリの作製および評価に使用します。

2. Phagemid ベクトル (図 2) でフィルター処理された ORFs の subcloning

1. ORF の準備は、DNA のフラグメントをフィルター処理
   1. PFILTER ORF ライブラリ ベクトル BssHII の 10 U を追加して、製造元のプロトコルに従って培養から精製されたベクトルの 5 μ g の制限の酵素の消化力を設定します。酵素と 10 U NheI のダイジェストを不活性化します。
   2. 一緒に 100 bp の DNA の梯子の 1.5% の agarose のゲルに消化された DNA をロードします。電気泳動法の短い 15 分の 5 V/cm またはだけを切除片の塗抹標本を識別し、それらを含んでいるゲルの部分をカットで実行を実行します。
   3. 柱脚ゲル抽出キットを挿入 DNA を浄化し、紫外線分光光度計を使用して濃度を測定します。
2. Phagemid DNA の調製
   1. 挿入に関しては精製 pDAN5²⁷の 5 μ g の制限の酵素の消化力を設定します。
   2. 0.75% の agarose のゲルの実行中の消化の DNA によって消化されたプラスミドを浄化し、列ベース キットにゲルから抽出します。
   3. 紫外線分光光度計を使用して濃度を測定します。サンプルは、使用するまで-20 ° C で保存できます。
3. ライブラリ結紮、変換およびコレクション
   1. 結紮と pFILTER ベクトルの変換を実行します。
   2. プレート変換 DH5αF' 150 mm 2xYT 寒天 100 μ g/mL アンピシリンと補われ、30 ° C で一晩インキュベート
   3. ライブラリのサイズを決定するための 100 μ g/mL アンピシリンを添加した 100 mm 2xYT 寒天培地プレート上のライブラリの希釈液をプレートします。
   4. 1.4 の手順で説明するようにランダムに選択されたクローンの PCR によるライブラリの検証を実行します。
   5. 150 mm 板から細菌を収穫して phagemid ORF ライブラリを収集、混和、20% 滅菌グリセリンや-80 ° c の小さい因数でストアでそれらを補います。
   6. 製造元の指示に従って列に基づくプラスミド抽出キットを使用してライブラリの 1 つの因数からプラスミド DNA を浄化します。
   7. 紫外線分光光度計で濃度を測定します。-20 ° C まででサンプルを格納できる NGS によって評価されます。

3. バクテリオファージ ライブラリの準備および選択手順

1. バクテリオファージの生産
   1. 外径_{600 ナノメートル}を持つために 100 μ g/mL アンピシリンを添加した 2xYT 液体スープの 10 mL に phagemid ライブラリのストック因数を希釈 = 0.05。
   2. 37 ° C に達する OD_{600 ナノメートル}まで 220 rpm で揺れ = 0.5、生殖不能のフラスコで希薄化後のライブラリを元のボリュームの 5-10 倍成長します。
   3. 助手のバクテリオファージ (例えばM13K07) 感染症 20:1 の多重度で細菌に感染します。時折撹拌 (10 分毎) で 45 分の 37 ° C に置いたまま。
   4. 室温で 10 分間 4000 x g で細菌を遠心します。上澄みを廃棄、100 μ g/mL アンピシリンと 50 μ G/ml カナマイシンを添加した 2xYT 液体スープ 40 ml 細菌ペレットを再停止し、一晩 220 rpm で振とうしながら 28 ° C で成長します。
   5. 4 ° C で 20 分間後、4000 × g で遠心分離細菌の日ファージを含む上清を収集します。
2. ペグ - ファージの沈殿物。
   1. 1/5 量 0.22 μ m フィルター クリア ファージにペグ/食塩 (20 %w/v ペグ 6000、2.5 M の NaCl) を追加し、氷上で 30-60 分間インキュベートします。
      注: ソリューションになった煙数分後成功したファージの沈殿物を示します。ソリューションの曇りがインキュベーション時間の経過と共に増加します。
   2. 4000 x g で 4 ° C で 15 分間遠心ファージの白い小さなペレットを形成します。
   3. それは 1 mL の滅菌 PBS に再懸濁します。1.5 mL のチューブに移し、4 ° c 汚染細菌を除去する最大速度で 10 分間遠心分離します。茶色のペレットになります。
   4. 新しいチューブに上清含むファージを転送します。滴定およびバクテリオファージ淘汰の氷の上に感染するバクテリオファージを維持します。
3. バクテリオファージの滴定
   1. バクテリオファージ ソリューションのシリアル希薄を準備します。990 μ L の 10^-2希釈を取得する PBS のファージ液の 10 μ L を入れてください。再び 10^-4これから 10^-6希釈を取得しこの準備を希釈します。
   2. 成長 DH5αF' 2xYT 外径_{600 ナノメートル}まで揺れで 37 ° C で液体培地に細菌細胞 = 0.5 に達する。1.5 mL チューブに準備された細菌の 1 mL を移すし、10^-4バクテリオファージ希釈の 1 μ L ですぐに感染します。45 分 10^-6希釈と同じ手順の繰り返しの 37 ° C に振ることがなく、インキュベートします。
   3. 感染した菌の希釈液を 100 mm 2xYT プレートにプレート。30 ° C で皿を一晩置きます。
   4. 感染していない DH5αF の 100 μ L をプレート ' 2xYT 寒天培地プレートに準備に汚染の有無を確認する 100 μ g/mL アンピシリンを補完します。
   5. 翌日は、コロニーの数を数えるし、ファージ力価を計算します。価ファージ/mL の数として表現します。予定価は 10^{12 13}ファージ/mL です。
4. ファージの選択
   1. ファージの選択を使用して浄化された抗体を餌として
      1. PBS-4% スキムミルクの等量にファージ調製の 200 μ L に希釈してファージを飽和し、低速回転に室温で 1 時間インキュベートします。この手順は、非特異的結合のファージのブロックできます。蛋白質 G の被覆磁性体ビーズ 30 μ L を 1.5 mL チューブに転送します。
      2. 次のように 2 回を洗う: 500 μ L の PBS を追加、室温で 2 分間低速回転でホイールに孵化させなさい、磁石を使用して管の 1 つの側面にビーズを描画、上澄みを除去。
      3. 低速回転と室温で 30 分間洗浄ビーズ飽和ファージを孵化させなさい。
      4. 磁気フィールドを使用して 1 つの側面にビーズを描画します。選択のステップに使用するファージを含む上清を収集します。
      5. 浄化された抗体の活用で、前の手順を実行しながら磁気ビーズを準備します。上記タンパク質 G コーティングされた磁気ビーズの 30 μ L を洗ってください。500 μ L の PBS で浄化された抗体の 10 μ g を希釈、洗浄のビーズを追加し、45 分 PBS で 2 回洗浄のため室温で低速回転で孵化させなさい。
         注: 磁気ビーズの 2 つの異なる製剤を実行: 1 つの興味の抗体とコントロール抗体、例えば、抗体とは健康なドナーから精製します。制御出力の分析手順の中に抗体を減算した抗原のシーケンス。また、コントロール抗体搭載磁気ビーズは、(非共役のビードと孵化のプロトコルに従う) ファージの前清算のステップを実行する使用できます。
      6. ファージの選択: 磁石を用いた管の 1 つの側面にビーズを描画、最後の洗浄を削除、ファージを追加、90 分 5 回 PBS-0.1% Tween 20 500 μ L と 5 回 PBS で洗浄のため室温で低速回転で孵化させなさい。
      7. 溶出がバインドされたファージ、1 ml DH5αF のビーズを混合することによって、選択範囲の出力を表す ' OD₆₀₀で育った細胞 = 0.5。時折揺れ (10 分毎) で 37 ° C の 45 分のビーズと細菌を孵化させなさい。100 μ g/mL アンピシリンを添加した 150 mm 2xYT 寒天培地プレートに出力をプレートします。
      8. 滴定を実行する原液と出力 (10^-1 10^-5~) の異なる希釈液 100 μ L をプレートします。翌日 150 mm 板から新鮮な 2xYT 培地 3 mL を追加することによって細菌を収集し、ミックス徹底的に滅菌スクレーパーとそれらを収穫して 20% 滅菌グリセリンで補完、小さい因数で-80 ° C で保存します。
      9. 選択のラウンド 2 番目を実行するもう 1 つの因数が成長します。洗浄の条件を除いて上記のようにパンのすべての手順を繰り返します。PBS-1% Tween 20 と 10 回をこの場合洗浄 (管内の溶液を注ぐし、すぐに注ぐ)。500 μ L の PBS を追加し、10 分実行 PBS と他の 10 の洗浄のため室温で回転を孵化させなさい。選択範囲の最初のラウンドは溶出のステップに進みます。
      10. メーカーの指示に従って、列ベースのキットを使用して、出力の 1 つの因数からプラスミド DNA を抽出します。ディープ シーケンスの使用されるまでは、-20 ° C でプラスミドを格納します。
   2. 組換えタンパク質を餌として使用してファージの選択
      1. PBS-4% スキムミルクの等量にファージ調製の 200 μ L に希釈してファージを飽和し、低速回転に室温で 1 時間インキュベートします。
      2. ストレプトアビジン磁気ビーズの 100 μ L を追加します。ストレプトアビジン結合ファージを選択するために室温で 1 時間インキュベートします。ストレプトアビジン バインド ファージを削除するには、磁石を使用して 1 つの側面にビーズを描画します。前の手順から上澄みを取る (濃度 100 550 nM) にビオチン化タンパク質を加えるし、ロータの室温で 1 時間に 30 分の間孵化させなさい。
      3. 磁気ビーズを準備: 前の手順を実行中、100 μ L の PBS のストレプトアビジン磁気ビーズを洗浄、PBS 2% スキムミルクで再懸濁します、ローテーションで 1 時間に 30 分間室温でインキュベートします。
      4. ファージの選択: 磁石を用いた管の 1 つの側面にビーズを描画、PBS-2% の牛乳を削除およびバクテリオファージ タンパク質ミックス ビーズを再懸濁します。90 分間室温で低速回転で孵化させなさい。
      5. 磁石を用いた管の 1 つの側面にビーズを描画、上澄みを廃棄し、それらを注意深く洗浄 500 μ L の PBS を 5 回 0.1% Tween 20。前のセッションで説明したように、溶出を実行します。

4. バクテリオファージ ライブラリ ディープ シーケンス プラットフォーム (図 3)

1. DNA は、pFILTER ORF ライブラリ、pDAN5-ORF-ライブラリまたは選択したファージライブラリから回復を挿入します。
   1. ライブラリの 1 つの因数を解凍、分光光度計を用いた定量化、特異的プライマー増幅作用による DNA チップを回復します。
      注: 挿入を救出するために使用するプライマーは、得た私アンプリコン プールの連続インデックスと DNA チップのダイレクト シーケンスをシーケンサーを使用して回復できるようにアダプター シーケンスに 5' 端にリンクされています。シーケンスは、テーブルの材料です。アダプターは、太字で表示されます、特異的プライマーはイタリック体で示されます。
   2. PCR の反作用のための DNA のテンプレートとして (pFILTER/phagemid/選択-ファージ) ライブラリの 2.5 μ L を使用します。
   3. 次のプログラムを使用して: 95 ° C、3 分。25 サイクル 95 ° C の 30 s、55 ° C、30 s、30 のための 72 ° C s;4 ° C で 5 分保持のための 72 ° C
      注: この時点でそれをバイオアナライザーまたは TapeStation、産物のサイズを確認し、適切な範囲であることを確認で 1 μ L の PCR の製品を実行するお勧め。
2. PCR のクリーンアップ
   1. (例えばAMPure) の磁気ビーズを室温に戻します。1.5 mL チューブ、PCR チューブから全体の PCR の製品を転送します。渦 30 用磁気ビーズのビーズに均等に分散していることを確認します。PCR の製品は、軽くピペッティングしてミックスを含む各チューブに磁気ビーズの 20 μ L を追加します。5 分間振盪せず室温で孵化させなさい。
   2. マグネット スタンドを 2 分間または上澄みがクリアまでにプレートを配置します。マグネット スタンドに PCR の製品を削除し、上澄みを廃棄します。
   3. マグネット スタンドで PCR の製品と、作りたての 80% エタノールでビーズを通り洗う: もに各サンプルに作りたての 80% エタノール 200 μ L を追加3、マグネット スタンドに板を孵化させなさい s;慎重に削除し、上澄みを廃棄します。
   4. マグネット スタンド; の PCR の製品の第 2 エタノール洗浄を実行します。第 2 洗浄の最後に慎重にすべてのエタノールを削除し、10 分の風乾にビーズを許可します。
   5. マグネット スタンドからの PCR の製品を削除、各チューブに 10 mM Tris pH 8.5 の 17.5 μ L を追加、優しくをピペット、ダウン 10 回はビードが完全に再停止されることを確認してください。2 分間室温でインキュベートします。
   6. 2 分のマグネット スタンドにチューブを配置または 15 μ L を新しい 1.5 mL チューブ精製 PCR 産物を含む上清を慎重に転送上澄みがクリアまで。すぐにインデックス PCR を続行しないでください場合は-15 ° C-25 ° C、1 週までに精製 PCR の製品を格納します。
3. PCR のインデックス
   注: PCR は、クリーンアップするインデックス PCR を実行します。Nextera XT インデックス キット;したがってそれは多重イルミナ内結果ダブル インデックス ライブラリをシーケンスすることが可能になります。
   1. 各製品を含む 15 μ L 新しい PCR チューブに浄化され、次の反応を含むセットアップすべて転送: 精製私アンプリコン製品、インデックス プライマー 1 の 5 μ L、5 μ L インデックス プライマー 2、2 ・ x PCR ミックスの 25 μ L の 15 μ L50 μ L の最終巻。
   2. 次のプログラムを使用してサーマルサイクラー PCR を実行: 95 ° C、3 分、30 の 95 ° C の 8 サイクル s、55 ° C、30 s、30 のための 72 ° C s;4 ° C で 5 分間、72 ° C が押し
4. PCR クリーンアップ 2
   1. 次の変更をクリーンアップを PCR のセクション 4.2 で説明同じプロトコルに従う: 磁気ビーズの 56 μ L を各 50 μ L の PCR の製品の最初のステップで追加します。
   2. 精製の最後のステップで 10 mM Tris ph 8.5 27.5 μ L でビーズを再懸濁し、25 μ L を新しいチューブ (これは、定量化し、シーケンスの準備ができて精製最終ライブラリ) に転送します。
   3. ライブラリの定量化に進んでいない場合は-15 ° C-25 ° C、1 週までにプレートを格納します。
5. 配列ライブラリの定性的、定量的評価
   1. 浄化後実行 1 μ L、1:10 の希釈のサイズを確認し、最終的なライブラリ トレースの領域を選択するそれを定量化にバイオアナライザー上最後のライブラリ。
   2. 同時に製造元のプロトコルごとのライブラリ定量キットを使用してリアルタイム PCR によるライブラリの定量化を実行します。
6. シーケンス処理ライブラリ
   1. 他のデュアル インデックス付き配列ライブラリとともに生産デュアル インデックス ライブラリをプールします。シーケンスのこの種の生成することによってライブラリが読み取り時間が長い、最初のケース 250bp PE 読み取り、2 番目のケース 300 bp PE を取得する、Hiseq2500 または MiSeq 楽器の両方を使用して、少なくとも 250 bp ペア最後を読み取ります。

5. バイオインフォマティクス データ解析インタラクトーム Seq Web ツールを使用して

1. インタラクトーム seq データ解析パイプラインを持つ pFILTER/phagemid/選択-ファージ ライブラリ シーケンスから読み取りを分析します。Web ツールは、自由に利用できる次のアドレス: http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

Results

フィルタ リングのアプローチは、図 1で図式です。Intronless DNA の各種類を使用できます。図 1Aでフィルタ リングのアプローチの最初の部分は表されます: agarose のゲルまたは、バイオアナライザーに読み込み、興味の DNA の良い断片化 150 750 bp の目的のサイズの長さ分布とフラグメントの塗抹標本として表示されます。得られた断片化された DNA の代表的な仮想ゲル画像が与えられます。フラグメントは agarose のゲルにロードが、リカバリ、最後修理しリン酸化、およびランダムな DNA 断片のライブラリ作成する以前鈍化 pFILTER ベクターにクローンを作成します。最適な条件の下で複製の手順の各ステップを実行することが調査の下で DNA の全範囲で質の良いライブラリを取得する必要です。

Discussion

高品質非常に多様な Orf フィルター ライブラリの作成以来、それはパイプラインのすべての後続の手順に影響を与える全体の手順の最初の重要なステップであります。

本手法の有利な特徴は (intronless) DNA (cDNA、ゲノム DNA、派生した PCR または合成 DNA) の任意の元は図書館の建設に適しています。考慮するべきである最初のパラメーターは、pFILTER ベクターにクローニング DNA 断片の長さがゲノム ・ トランスクリプトーム、いわゆる"domainome"ドメインの全体のコレクションの表現を提供する必要があります。これはラインの報告は、タンパク質ドメイン正常に複製することができます、選択および、長さ分布 150 からにまたがる 750 bp^33,34, DNA のフラグメントから始まって最後に識別できたほとんどのタンパク質ドメイン 100 aa の長さのことを示す文献 (50 から 200 までの範囲で aa)

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sonopuls 超音波ホモジナイザー	Bandelin	HD2070	または同等の
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0321	または同等の
GeneRuler 1 kb DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM0311	または同等の
Molecular Biology	Agarose BioRad	161-3102	または同等の
Green Gel Plus	Fisher Molecular Biology	FS-GEL01	または同等の
6x DNA ローディング色素	Thermo Fisher Scientific	R0611	または同等の
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	または同等の
Quick Blunting Kit	New England Biolabs	E1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis 分光光度計	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
大容量cDNA逆転写キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4368813
ストレプトアビジン磁気ビーズ	New England Biolabs	S1420S	または同等の
QIAquick PCR精製キット	Qiagen	28104	または同等の
EcoRV	New England Biolabs	R0195L
Antarctic Phosphatase	New England Biolabs	M0289S
T4 DNAリガーゼ	ニューイングランドバイオラボ	M0202T
酢酸ナトリウム3M pH5.2	一般的なラボサプライヤー
分子生物学用エタノール	Sigma-Aldrich	E7023	または同等の
DH5aF 'バクテリア細胞	サーモフィッシャーサイエンティフィック
0,2mlチューブ	一般的なラボサプライヤー
1,5 mlチューブ	一般的なラボサプライヤー
0,1 cm エレクトロポレーションキュベット	Biosigma	4905020
Electroporator 2510	Eppendorf
2x YT medium	Sigma-Aldrich	Y1003
Ampicillin ナトリウム塩	Sigma-Aldrich	A9518
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
DreamTaq DNAポリメラーゼ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	EP0702
デオキシヌクレオチド(dNTP)溶液ミックス	New England Biolabs	N0447S
96ウェルサーマルサイクラー(加熱蓋付き)	一般ラボサプライヤー
150 mmプレート	一般ラボサプライヤー
100 mmプレート	一般ラボサプライヤー
グリセロール	Sigma-Aldrich	G5516
BssHII	New England Biolabs	R0199L
NheI	New England Biolabs	R0131L
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	または同等の
M13KO7 ヘルパーファージ	GE Healthcare Life Sciences	27-1524-01
ストレプトマイセス・カナマイセチカス由来の硫酸カナマイシン	Sigma-Aldrich	K1377
ポリエチレングリコール(PEG)	Sigma-Aldrich	P5413
クロライドナトリウム(NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014
PBS	ジェネラルラボサプライヤー
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10003D	または同等の
MagnaRack Magnetic Separation Rack	Thermo Fisher Scientific	CS15000	または同等の
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Nonfat Dried milk powder	EuroClone	EMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems、Fisher Scientific	7958935001
AMPure XP ビーズ	Agencourt、Beckman Coulter	A63881
Nextera XT デュアルインデックスプライマー	Illumina	FC-131-2001 または FC-131-2002 または FC-131-2003 または FC-131-2004
MiSeq または HiSeq2500	Illumina
分光光度器	Nanodrop
AgilentバイオアナライザーまたはTapeStation	Agilent
Forward PCRプライマー	一般ラボサプライヤー		5'TACCTATTGCCTACGGCA GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3'
リバースPCRプライマー一般	ラボサプライヤー5		'TGGTGATGGTGAGTACTA TCCAGGCCCAGCAGTGGTTG 3'
一般ラボサプライヤー		用フォワードプライマー	5'TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGGCA GCAAGCGGCGCGCATGC 3';
一般ラボサプライヤー		用リバースプライマー	5'GTCTCGTGGGCTCGGAGA TGTGTATAAGAGACAGGGG ATTGGTTTGCCGCTAGC 3';