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方法論記事

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

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DOI:

10.3791/57009

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2018年4月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Cardiovascular Research Institute Maastricht (CARIM), Maastricht University, 2Department of Vascular Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine

この記事について

サマリー

炎症時に血管壁の損傷後、白血球は血管細胞と血小板との対話熱心。ここでは、白血球や細胞パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを特徴付ける簡単流アッセイについて述べる。

要約

損傷やけがや組織の損傷部位に炎症時の白血球の募集は最近数十年間に調べたし、白血球接着連鎖の概念をもたらしました。ただし、白血球動員に関与する正確な分子メカニズムがまだ特定されていない完全に。接着のメカニズムを研究、解き放つ接着簡単流アッセイを提案する白血球動員に感染、炎症、および (自動-) 免疫研究の分野で重要な課題が残っているので、静脈と動脈の流れの政体の下で白血球の輪廻。生体外の試金を使用して、白血球と血管の炎症のさまざまなモデルの携帯パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを研究できます。このプロトコルは白血球と血管内皮細胞や血小板、可視化と、記録することができますとの相互作用を研究する並列フロー チャンバーとカメラに接続されている倒立位相差顕微鏡を使用して層流ベースの試金を記述します。オフライン分析。白血球や血小板、血管内皮細胞は、阻害剤またはこのプロセス中に特定の分子の役割を決定する抗体で前処理することができます。せん断条件、すなわち動脈または静脈剪断応力は粘性や灌流の流体の流量とチャネルの高さ簡単に合わせることができます。

概要

けが、炎症や感染症、時に白血球迅速に対応に病原体または損傷-関連分子パターン (PAMPs、DAMPs) アクティブ化された状態に変更し、血流から炎症と組織損傷のサイトに移動します。白血球の細胞・分子環境と対話できる能力は白血球接着欠乏1のような遺伝性疾患によって強調されるよう、免疫細胞としての正しい機能に不可欠です。白血球接着過去数十年の間に強烈な調査の対象とされている、初期の 1990 年代2,3における白血球接着カスケードのコンセプトになりました。白血球接着は、血管内皮細胞、血管の表面を転がしてにセルの原因への白血球のセレクチンを介したキャプチャによって開始されます。この圧延により内皮バインド渡り鳥手がかり、例えばケモカイン、インテグリンの活性化を誘導するためにスキャンする白血球です。その後、インテグリンの活性化は、しっかりした白血球逮捕で内皮配位子へのバインドを仲介します。白血球がクロールして広がり、内皮細胞の膜を貫通し、基になる組織に細胞の前に extravasate その後準備をします。正規白血球カスケードの基本概念は導入以来ほとんど変わらず、いくつかの中間の手順4を追加しました。それにもかかわらず、正確な分子メカニズムと白血球動員に関与する多くの選手の役割を持って、これまで解明されていない、白血球動員まま感染症、炎症、(自動) 免疫の分野で重要な課題研究。

たとえば、動脈硬化などの血管の炎症性疾患、血管壁ドライブ プラーク開発に白血球動員増加しました。不安定な動脈硬化性プラークが破裂する、血小板および凝固系の大規模な活性化とその後5容器の閉塞をリードします。心筋梗塞や脳卒中などの重篤な心血管リスクがあります。さらに、白血球と血小板 (例えば、マトリックス成分と滑らかな露出血管壁内部の相互作用の多数をもたらすそれは内皮細胞の侵食が臨床的に発生する例えば冠動脈ステント留置後心筋細胞) と血管傷害をカバーする血小板と白血球の。これらの相互作用が病気の新生内膜形成6、7のドライブ可能性があります単球血小板の相互作用としてのさらなる発展のために重要です。さらに、Mac 1 (αMβ2) 白血球インテグリンを介した血小板白血球の相互作用、血小板 GPIbα 最近マウス8で血栓症の新規ドライバーとして識別されています。

分離マトリックス分子の広いスペクトルと白血球と血管由来の不死化細胞株の研究との白血球と血小板の源として人間や動物の血液の普及を考えると、それは白血球のシミュレーションが可能設定、特別に設計された流灌流チャンバーを使用して実験室の流れの下での相互作用。多くの亜種は、自己粘着性灌流チャンバー真空駆動からまで、過去十年にわたって設計されています。すべての亜種は、不動の部分 (例えば、培養血管細胞または基質タンパク質) が動かない部分に液の灌流を有効にする事前に定義されたチャネルを装備した大きい防漏チャンバーに組み立てられる公有地であります。さらに、成形技術の進歩には、シリカ ポリマー9に基づくカスタム ソリューションの開発が有効になります。粘度と灌流の流体の流量とチャネルの高さ主流灌流装置10のせん断応力特性が決まります。この記事で提案する体外付着のメカニズムを研究、解き放つ接着法と静脈および動脈の流れの政体の下で白血球の輪廻。紹介した方法の利点は彼らが一般的なカメラに接続された蛍光顕微鏡を使用して実行できます、高い技術的な能力を所有する実験者を必要としません。In vitroアッセイ (例えば、阻害剤を追加または遮断抗体によって)、多くの方法で操作することができますつまり、血管の炎症のさまざまなモデルの適用とタンパク質機能接着の調査を可能または特定の化合物の評価。

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プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、医療倫理とマーストリヒト大学動物倫理的な板によって承認されています。

1 ヒトの細胞とフロー ベースのアッセイ

  1. ヒトの血液から血小板を分離
    1. クエン酸 (3.2%) 抗凝固薬の静脈血を描画します。
    2. 1/15 酸クエン酸ブドウ糖量を追加 (ACD: クエン酸ナトリウム 80 mM、52 mM クエン酸、183 mM グルコース) 血液に。
    3. 多血小板血漿 (PRP) を取得する 15 分のブレーキなし 350 × g で遠心分離機します。
    4. 15 mL コニカル チューブに上清を転送し、ACD の 1/20 ボリュームを追加します。
    5. 遠心分離機で 1,110 g 血小板貧しい血しょう (PPP) を取得する 15 分のブレーキなし。
    6. 上清を捨てます。穴、血小板活性化の防止で支援することが広いピペット先端部 (1000 P) の終わりを切断し、慎重に血小板バッファー ph 6.6 PRP と同じボリュームで血小板ペレットを中断 (PB: 136 mM の NaCl、10 mM Hepes、2.7 mM KCl、2 mM MgCl2, 0.1% ウシ血清アルブミンおよび 0.1% グルコース)。ACD の 1/20 ボリュームを加え、優しく混ぜます。
    7. 1,110 g 15 分ブレーキなしで血小板をペレットします。
    8. 上澄みを廃棄し、慎重に 1 mL 血小板バッファー (pH 7.5) で上記として血小板を中断します。
    9. 多項目自動血球分析装置による 1/10 希釈で血小板濃度を測定します。
    10. 2 x 107/mL の数を達成するために血小板バッファー (pH 7.5) を使用してボリュームを調整します。
  2. (ブリンクマンらから適応したヒトの血液から白血球の分離11 )
    1. 抗凝固剤としてヘパリン (10 U/mL) に 24 ミリリットルの血液を描画します。
    2. 1.077 グラム/mL の密度 polysucrose ナトリウム diatrizoate 媒体の 6 mL を追加 (材料表参照) 15 mL コニカル チューブと慎重に上の層 5-6 mL 全血に。
    3. ブレーキなし 800 x g で 20 分間遠心します。
    4. 吸引し透明な黄色の最上位のレイヤーを破棄し、新鮮な 15 mL の円錐管に顆粒球を含む下の赤みを帯びた相を転送します。14 mL とブレーキなし 300 x g で 10 分間遠心する最終巻に 2 ミリメートルの EDTA を含む PBS を追加することによって細胞を洗浄します。
    5. 一方で、密度勾配媒体の準備 (例えばパーコール、材料表を参照) 2 ml 10 x PBS 貯蔵液 18 mL 密度勾配媒体を混合することによって実用的なソリューション。PBS のこの実用的なソリューションを希釈 (1 x) 4.25 mL の 85%、80%、75%、70%、65% のグラデーション ミディアム ソリューションを取得します。
    6. 密度勾配を有する円錐管の 2 を準備するには、互いの上にすべての媒体の割合の 2 mL を階層化します。最高濃度で開始し、降順で続行します。防水マーカー チューブ上にあるレイヤーをマークします。
    7. 慎重に各 2 つの準備されたグラデーションに細胞懸濁液 2 mL をレイヤーします。
    8. 慎重にバランスの取れた遠心でブレーキなし 800 x g で 20 分間遠心します。
    9. 遠心分離の後トップ層と 65% のほとんど削除 PBMCs と (最初のリング) をレイヤーし、収集新しい管に 85% 層まで表面を残りホワイト (2 番目のリング、PMN)。
    10. PBS 2 ミリメートルの EDTA、チューブ、ブレーキなし 300 x g で 10 分間遠心を埋めることで細胞を洗浄します。
    11. 上澄みを除去し、1 mL のハンクのバッファー (pH 7.45) 含む 10 mM Hepes と 0.2% アルブミン (アッセイバッファー) の堆積セル (通常 ≥95% が PMN) を停止します。
    12. 診断を使用してセルをカウントし、1 x 106/mL でセルを中断します。
    13. 蛍光標識と白血球 (ステップ 3.3) の灌流を続けます。
  3. 付着性血小板および血管細胞膜の作製
    1. 細胞培養皿準備 (培養細胞)
      1. 1 ml の希釈ラット尾コラーゲン (30 の μ g/mL は 0.2 μ m のフィルターでフィルター処理された PBS で希釈した) の 35 mm 細胞培養皿のコート済み。
      2. 37 ° C で 30 分間インキュベート、コラーゲン液を捨て、PBS で一度お皿を洗ってください。
    2. 培養皿で血管細胞の培養
      1. デタッチ (例えば、血管内皮、HAoEC、HAoSMC) のプライマリまたは不死化血管細胞 (例えばEA。Hy926、SVEC) 1.5 mL 細胞剥離ソリューション (例えばaccutase) と T75 フラスコで合流に成長します。細胞剥離液を中和し、商工会議所を数えるセルとセルの濃度を決定する適切な成長媒体の 4.5 mL を追加します。(例えば、完全な内皮細胞成長培地) 適切な培地に 10 の5セル/mL × 0.5 でセルを中断します。
      2. 細胞懸濁液 2 mL をそれぞれ 35 mm ディッシュに追加します。(24-48 h、細胞の種類に応じて撮影) 合流点まで 5% CO2と 37 ° C で加湿のインキュベーターで培養します。
    3. ガラスの coverslip の準備 (付着血小板)
      1. 塩酸エタノールで一度ガラス基板を浸す (1.2 M/50 %v/v)。
      2. 純水で 2 回 coverslip をすすいでください。
      3. N2下 coverslip を乾燥させます。
      4. プレコート希薄化後のラット尾コラーゲンの灌流チェンバのチャンネルの位置に従って、100 μ L でガラス基板タイプ I (30 の μ g/mL は 0.2 μ m のフィルターでフィルター処理された PBS で希釈) です。
      5. 室温で 30 分間インキュベート、コラーゲン液を捨て、洗浄 3 coverslip PBS で x。
      6. 室温 0.5 h と HEPES 1 %bsa コラーゲンをコーティングした coverslip をブロックします。
      7. 洗って乾燥、coverslip と灌流チェンバにマウントします。人間から血小板またはそれぞれ手順 1.1 または 2.1 に示したマウスの血を分離します。
    4. 血小板の固定化
      1. チャンネルあたり 2 × 107/mL 血小板懸濁液 70 μ L を追加し、37 ° C、5% CO2で 1.5 時間孵化させなさい。
      2. ブロッキング液 (HEPES で 5 %bsa) と蛍光標識白血球 (ステップ 3.3) の血流と RT。 続行で少なくとも 30 分の非付着血小板を慎重に取り付けます。
    5. 血管内皮細胞単層の刺激
      1. 37 ° C、5% CO2で 4 時間、10 ng/mL 腫瘍壊死因子 α (tnf α) が含まれている新鮮なメディアとメディアを置き換えることによって血管の細胞を刺激します。

2 マウス細胞とフロー ベースのアッセイ

  1. マウスの血液から血小板を分離
    1. 心臓穿刺から 21 G 針 (〜 1 mL) を使用して描画血液麻酔 (ケタミン 80 mg/kg およびメデトミジン 0.3 mg/kg) 6-8 週-古いマウス (C57Bl/6) 抗凝固剤としてクエン酸 (3.2%)。
    2. ACD の 1/6 量を追加します。
    3. 220 × g で遠心分離、多血小板血漿 (PRP) を取得する 5 分間の中のブレーキ。
    4. 新しい管にプラス 1/3 赤の血液細胞の上清 (~ 600 μ L) を転送します。
    5. 6 分のブレーキなし 95 × g で遠心分離機します。
    6. 上清 (PRP) を転送し、タイロード バッファーの 1/10 倍希釈液で血小板濃度を測定 (TH バッファー: 136 mM の NaCl、5 mM Hepes、2.7 mM KCl、0.42 mM NaH2PO4* H2O、2 mM MgCl20.1% ウシ血清アルブミンおよび 0.1%ブドウ糖) 自動血球計数装置を持つ。
    7. 1/25 ACD + 0.1 U/mL エンドウアピラーゼのボリュームを追加することによって血小板を洗って 2,870 g、中ブレーキを 2 分間の遠心分離機します。
    8. 上澄みを廃棄し、0.1 U/mL エンドウアピラーゼや、ACD の 1/10 量 600 μ L TH バッファーを追加します。ピペット先端部 (1000 P) を切断ことが広い穴、血小板活性化の予防にも役立ちますし、そっと餌を中断します。
    9. 2,870 g で遠心分離機、2 分間中ブレーキ
    10. 上澄みを廃棄し、優しく回バッファー内の血小板を中断します。
    11. 第 2 x 107/mL の数を達成するためにバッファーを使用してボリュームを調整します。
  2. 血小板の付着性単分子膜の作製
    1. 1.3.3 に従ってガラス基板 (付着血小板) を準備します。
  3. 血小板の固定化
    1. チャンネルあたり 2 × 107/mL 血小板懸濁液 100 μ L を追加し、37 ° C、5% CO2で 1.5 時間孵化させなさい。
    2. ブロッキング液 (HEPES で 5 %bsa) と蛍光標識白血球 (ステップ 3.3) の血流と RT。 続行で少なくとも 30 分の非付着血小板を慎重に取り付けます
  4. マウス血小板膜の刺激
    1. 白血球 (ステップ 3.3) の灌流は、の前にトロンビンの灌流、血小板を刺激する (0.5 nM) で 37 ° C で 3 分間 HHHSA バッファー

3. 蛍光標識と白血球 (PMN または人間の RAW264.7 THP 1 またはマウス フロー ベースの試金のためのプライマリ マウス単球) の血流

  1. 蛍光標識
    1. セル側の透過物緑蛍光核酸染色 (1 μ M) と白血球 (1 x 106/mL) ラベルを付けます。37 ° C で 30 分間細胞をインキュベートします。
    2. 5 分間 300 × g で遠心分離によって PBS のセルを洗浄し、0.5 106セル/mL (1 つのテスト条件、流量に応じて 5 mL) アッセイバッファーで倍の濃度に細胞を中断します。
  2. 流れの商工会議所の分析の準備
    1. 細胞膜上に白血球の付着のため、お皿から細胞培養液を破棄し、流れ区域にそれを組み立てます。注射器にチューブを接続します。固定化血小板に白血球の付着のためマイクロ スライドを注射器に接続します。37 ° c の水浴をあらかじめ暖かく
    2. 灌流シリンジ (50 mL)、インストール注射器シリンジ ホルダーとセットでポンプを撤回のモードを取る。0 mL ポンプ ボリュームを設定し、50 mL シリンジの 26.70 mm 直径を設定します。
    3. チューブの一方の端に、肘のルアーロック コネクタを接続します。ルアーロック注射器ロック カプラーを置き、ルアーロック ロック カプラーに肘ルアーロック コネクタとチューブを接続します。無料チューブ端を流れ区域に接続します。
  3. 白血球の血流と接着
    1. 細胞膜上に白血球の付着のため、お皿から細胞培養液を破棄し、流れ区域にそれを組み立てます。注射器にチューブを接続します。固定化血小板に白血球の付着のためマイクロ スライドを注射器に接続します。
    2. 白血球の血流と、血管に付着のため- または血小板膜、アッセイバッファーと塗りつぶし 1 mL ピペットでチューブを含む 50 mL の円錐管に 2 番目の管を配置し、チューブを絞るし、流れ区域にそれを接続します。
    3. 白血球灌流前に細胞懸濁液に 3 mM CaCl2と 2 mM MgCl2を追加し、37 ° C で 5 分間インキュベート
    4. 商工会議所とチューブから可能な空気を除去する細胞の灌流前にアッセイバッファーを灌流します。
    5. タイトな圧迫して管端を閉じ、細胞懸濁液、空気の泡が閉じ込められているを防ぐアッセイバッファーからチューブを切り替えます。最初の細胞が到着するまで適切な流動率/せん断応力を持つセルを灌流します。
    6. 適切な流動率/せん断応力を 2 分間細胞灌流し、逆位相差/蛍光顕微鏡 (例えば、EVOS フロリダ) でローリングと付着性のセルの 2-6 分間に少なくとも 6 の画像をキャプチャ 100 倍の倍率を使用して接続されています。CCD や CMOS のデジタル カメラ。
      メモ: フロー レート/せん断応力は、フロー槽寸法と液の粘度に依存します。ここで使用される灌流チェンバの (材料の表を参照してください)。
      Τ =η* 97.1*Φ
      Τ: せん断応力 (1 dyn/cm2)
      Η: 粘度 (0.015 dyn * s/cm2)
      Φ: 流量 (0.67 mL/分)
  4. 白血球解消接着
    1. De-adhesion、トラップになってから空気の泡を防止するチューブを押し込んでアッセイバッファーに細胞懸濁液からチューブを切り替えます。
    2. 適切な流動率/せん断応力 (注を参照してください 3.3.7) アッセイバッファーによる血液灌流による細胞をデタッチします。
  5. 白血球輪廻
    1. 白血球輪廻の白血球 (ステップ 3) を灌流まで適量の白血球の付着 (~ 50 セル/ビュー] フィールド)。
    2. アッセイバッファーで白血球のサスペンションを交換してください。
    3. 37 ° C で 30-60 分毎 10-15 秒の時間経過によって細胞細胞を記録します。

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結果

内皮白血球接着を研究に蛍光に分類された thp-1 細胞灌流 tnf α または非-刺激血管内皮膜 3 ダイン/cm2で 2 分間以上。付着性単球細胞の合計数は、2-6 分の期間にわたって六つの独立したフィールドをキャプチャすることにより血流の 2 分後定められました。付着性のセル (例えば、EVOS フロリダ) 倒立位相差/蛍光顕微鏡で撮影した少なくとも 6 で定量化されたデジタル CCD または CMOS カメラに接続されている 10 倍の倍率を使用して、付着性のセルとして表現された平均/mm2。Tnf α の刺激による内皮、THP 1 逮捕は大幅些細内皮細胞と比較して増加しました。代表的な顕微鏡との定量化しっかりと非または tnf α 刺激血管内皮細胞に付着 THP 1 は図 1に提示されます。血小板白血球接着は、1 ダイン/cm2で 2 分間トラップ 6 または非-刺激血小板膜上蛍光に分類された好中球の灌流評価されました。...

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ディスカッション

この生体外の試金は血管の炎症の中に白血球動員の基になるメカニズムを調査する簡単な方法が、注意すべきいくつかの重要なポイントがあります。このアッセイを正常に実行するための最初の要件は、白血球と合流、そのまま血管や血小板膜の血流です。これは、コラーゲン タイプ表面の事前コーティング私によって達成できます。一般に、第一次血管細胞を操作するときは優しく推奨コラゲナーゼを含む剥離ソリューションを使用してセルをデタッチすることが重要 (参照材料表) より少なく厳密である、しかしトリプシンとして有効であります。血小板膜の血小板活性化と集約を防ぐために分離中に血小板を優しく洗うことが重要です。

もう一つの重要な考察はポンプの継続性を維持する不連続につながるので、灌流に使用する撤退モード邪魔流率と剪断状態。したがって、実際の剪断応力のと、その後生理学的せん断依存プロセスが誤って解釈不正確でこの結果します。これは、ポンプの定期的なメンテナンスにより防ぐことができます。また、灌継続性にとって重要なすべての実験のための新鮮な注射器の使用であります。使用し...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

ドクター マーティン ・ m ・ シュミットとラインの Fraemohs に感謝しますこの作品は、研 (ZonMW ビディ 016.126.358 輸血研究 (LSBR Nr。 1638) ランドスタイナー財団、ドイツ研究振興協会 (SFB1123/A2) R.R.K. に授与オランダ財団によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
倒立型蛍光顕微鏡(例:EVOS-FLLife Technologies Europe bv
Pump 例: モデル:210-CE ワールド精密機器78-9210W
ファルコン 35 mm TC 処理 イージーグリップ スタイル 細胞培養ディッシュコーニング353001
50 mL シリンジベクトン ディキンソン300137
シリコンチューブ VWR228-0700
エルボー ルアー コネクター オスIbidi10802
メス ルアー ロック カプラーIbidi10823
フローチャンバー大学病院 RWTH アーヘン特許 DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflä陳。2005年 
Ibidi スティッキースライド VI 0.4Ibidi80608
スティッキースライド用カバースリップ 同上10812
コラーゲンI型、ラットテールライフテクノロジーズヨーロッパbvA1048301
組換えヒトTNF-αPeprotech300-01A
ペプチド 6 (TRAP - 6) 用トロンビン受容体活性化剤Anaspec / Eurogentec24191
SYTO 13 緑色蛍光核酸染色Life Technologies Europe bvS7575
Hanks'平衡塩溶液 10xSigma-Aldrich ChemieH4641
HEPES 緩衝液 1M、液体Life Technologies Europe bv15630049
BUMINATE アルブミン、25% バクスター60010
注射用水.ブラウン3624315
塩化カルシウム二水和物ク102382 
塩化マグネシウム六水和物 Sigma-Aldrich ChemieM2670
ApyraseSigma-Aldrich ChemieA6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)Promocell GmbHC-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use)Promocell GmbHC-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)ATCC PCS-100-011
血管細胞基礎培地 ATCCPCS-100-030
内皮細胞増殖キット-BBEATCCPCS-100-040
初代ヒト大動脈平滑筋細胞(HAoSMC)ATCCPCS-100-012
血管平滑筋細胞成長キットATCCPCS-100-042
ヒト内皮細胞株、EA.hy926ATCCCRL-2922
ダルベッコModified Eagle's Medium (DMEM)ATCC30-2002
マウス内皮細胞株、SV 40 形質転換 (SVEC4-10)ATCCCRL-2181
ヒト単球細胞株、THP-1DSMZACC-16
RPMI 1640 with Ultra-GlutamineLonzaBE12-702F/U1
マウス単球/マクロファージ RAW264.7ATCCTIB-71
ダルベッコ修正イーグルスミディアム(DMEM)、高グルコースGibco11965092
AccutasePromocell GmbHC-41310
PercollSigma-Aldrich ChemieP1644
Histopaque 1119Sigma-Aldrich Chemie11191
10x PBSLife Technologies Europe bv14200075
BD ヘパリンナトリウムベクトンディキンソン367876
バキュエットチューブ9 ml 9NC凝固クエン酸ナトリウム3.2% 
HCl/EtOH混合物(1.2 mol/L HClおよび50%エタノール) ヒュームフード内で0.3L HCl(4 mol/L)と0.7Lの70% v/vエタノールを混合して調製
Bメル Sigma-Aldrich Chemieの水中455322

参考文献

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