化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

Summary

我々 は、theranostic ナノ粒子 (HEVNP) として肝炎 E のウイルスのカプシド蛋白を設計しました。HEVNP 自己粘膜配信で安定した正二十面体のケージにアセンブルします。ここでは、表面に露出したシステインは、とりわけ腫瘍細胞を結合する配位子の合成を共役残基の変異を対象とした腫瘍に対する HEVNPs の変更について述べる。

Abstract

ウイルス様粒子 (群集) は、外国のエピトープを表示および/または小さな分子の検出と様々 な病気の治療を提供するナノキャリアとして使用されています。遺伝子組み換えは、自己組織化でこのアプリケーションが依存しているし、組換え群集の腫瘍を対象としたアプリケーションを満たすためにシステイン抱合に比べ遺伝的群集に外国のペプチッドの変更だけでも、化学の活用を提供しています、重要な利点の合成ペプチドやオリゴ糖、VLP アセンブリの変更することがなく、変調かつ柔軟に群集の表面に共役するためなどのエンティティの様々 なをことができますので。

ここでは、多機能配信キャリアとして肝炎 E ウイルス粒子 (HEVNP)、モジュール化された theranostic カプセルを使用する方法を示します。HEVNPs の機能には、組織を対象とした、イメージング、および治療薬デリバリーが含まれます。HEVNP の確立の構造調査に基づき、構造的に独立して表面に露出した残基は、チオール選択的リンケージを介してマレイミド リンク化学グループの活用サイトとしてシステイン置換に選ばれました。1 つの特定のシステイン変更 HEVNP (573 アスパラギン システイン交換 aa (HEVNP-573 C)) は乳房がん細胞特異リガンド、LXY30 共役し、近赤外線 (NIR) 蛍光色素 (Cy5.5) 腫瘍ターゲットのレンダリングにラベル付け効果的な診断カプセル (LXY30-HEVNP-Cy5.5) として HEVNPs。Theranostic 配信への応用可能性を探索するよく知られている原子の構造を持つ他の高分子複合体と同様のエンジニア リング戦略を採用できます。

Introduction

治療および診断の配信、nanotheranostics、として知られているナノサイズのベクターの開発は、ターゲットを絞った配信¹に向かって一般的な治療から生物医学分野の多くをシフトしています。Theranostic 分子安定的に特定の病気にかかったティッシュまたは生化学的経路^{2,3,4 theranostic 分子を直接にターゲットを絞った nanotheranostic 配信統合ナノサイズ ベクトル (ナノ粒子)}.ナノメディシンは、最適なサイズのナノ粒子 theranostic 分子の循環を安定し、病気にかかったティッシュの提示細胞表面分子を選択的にターゲットする能力を持っているので、ターゲットを絞った配信の最前線に来ています。まだ多くの nanotheranostic プラットフォーム パッシブ セル吸収, 事前に成熟し劣化、毒性、および theranostic 分子と不十分な協会に苦しみます。群集は、ターゲットを絞った配信でこれらの障害の多くを克服します。彼らは外国のエピトープを表示および/または小さい分子を提供するナノキャリアとして使用されている: 療法は多くの病気¹を戦うために使用することができます。このアプリケーションのプロパティに主に依存....

Protocol

1 昆虫細胞で HEVNP 生産

注: すべての次の手順は、セル文化フードで行わなければなりません。詳細な HEVNP 生産手順¹¹当社前の文書を参照してください。

1. Sf9 昆虫細胞のセル 6 ウェル プレートでの 50-75% 合流するメディア (材料表を参照してください)。
2. 組換えバキュロ ウイルスを生成する Sf99 セルに HEVNP-573 C ORF2 を含む Bacmids を transfect 製造元のプロトコルによると昆虫の細胞のトランスフェクション試薬を使用する。27 ° c transfected セルをセルの実行可能性によって、3-6 日にインキュベートします。
3. (後に transfected セルは、バキュロ ウイルス感染による分離) P0 バキュロ ウイルス ストックとして感染後 3 〜 6 日で上清を収集します。
4. P0 株式の 200 μ L を 25 cm²分子フラスコの 50-75% コンフルエント Sf9 細胞に適用する前に培地を削除します。接種の完全なカバレッジを確保するためには、フラスコ 15 分毎をロックします。60 分の合計 4 回を繰り返します。
5. 昆虫の細胞培養培地 2 mL をフラスコに追加および 27 ° C で 3-6 日....

Results

HEV-群集に似ているすべて形成 HEVNPs 可溶性正二十面体のカプシドを変更し、したソリューションの製造及び精製中に集計はありません。シングル ステップ マレイミド ビオチン活用、Cys の各変更の前後に HEVNPs は否定的な汚れの EM (図 2) で HEV 群集から区別されました。マレイミド ビオチン活用効率 Cys 修正 HEVNPs 最初化学発光ストレプトアビジン結合を介してウェスタンブロットでテストされました。次のマレイミド ビオチン共役, システイン表示 HEVNPs ストレプトアビジン結合信号 (図 2) に変更。

効果的な二段システイン抱合を活用を行った順序によって影響を受けていた。Α3β1 インテグリンは乳癌腫瘍細胞、合成リガンド LXY30、発現されるため α3β1 に特定の親和性では、

Discussion

週間かかる、時間がかかる遺伝子工学プロシージャと対照をなしてここに示す簡単な 2 ステップとリガンドをターゲット癌を追加する、3 日間内に完了できるワンステップ化学の活用手順や蛍光検出色素 HEVNPs のシステイン/リスのサイトへ。テクニックを使用することができます候補者のプール、したがって合理的なコストと配信時に利用可能なペプチド/小分子合成サービスの活用から最高の配位子ターゲットの画面に。

興味の蛋白質にはポリペプチドにのみ挿入できます、従来の遺伝子工学とは異なり化学の活用は、ポリペプチド、小分子化合物の表面にナノ粒子など様々 な材料を接続できる、反応サイトとして使用するシステインまたは Lys 残基がある限り、興味の蛋白質。化学活用サイトでこのような残留が、単純なシステイン/リス交換は以前の研究⁴で示されるように化学的にアクティブにできるように興味の蛋白質の遺伝子変更ことができます。

それを制御するには、化学の活用は共役分子と分子内反応を避けるために徹底的に勉強する必要は.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MINI透析ユニット、10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	mini透析ユニット
High Five細胞	Thermo Fisher Scientific	B85502	Tn5細胞
SF9細胞	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11496015	Sf9細胞
Bac-to-Bac バキュロウイルス発現システム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A11101, A11100	バキュロウイルス発現システム
Bac-to-Bac バキュロウイルス発現システム	Life Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Insect Cell Media	Expression Systems LLC	96-001-01	昆虫細胞培地
Cy5.5 NHS エステル、5mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS エステル
Zeba スピン脱塩カラム、40K MWCO、0.5 mL	Thermo Scientific	87766	スピン脱塩カラム
MES ハイドレート	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
超透明遠心分離機 薄壁超遠心チューブ	ベックマン・コールター Inc	による	超遠心チューブ
NuPage 4-12% Bis-Tris タンパク質ゲル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NPO321BOX	SDS タンパク質ゲル
セルフェクチンII 試薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10362100	トランスフェクション試薬
EMS グローディスチャージャー	電子顕微鏡 科学		グローディスチャージャー