Method Article

血管の運動論的解析血管発生と血管新生の in Vitroのダイナ ミックスを定量化します。

DOI:

10.3791/57044

⸱

January 31st, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine, 2Herman B Wells Center for Pediatric Research, Indiana University School of Medicine, 3Indiana Center for Biological Microscopy, Indiana University School of Medicine, 4Department of Medicine, Indiana University School of Medicine, 5Department of Pediatrics, Indiana University School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 7Indiana University Simon Cancer Center, Indiana University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、タイムラプス イメージングのためのプロトコルを提案する、血管を使用して生体外の解析位相コントラスト顕微鏡血管運動解析、オープン ソース ソフトウェアとの結合します。このプロトコルは、多数の種類の細胞や血管の模型実験の条件の vasculogenic の可能性を定量的に評価に適用できます。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血管は内皮幹・前駆細胞、 de novo血管の形成を受ける複雑なプロセスです。血管内皮前駆細胞の機能の中央読み出しとなっている血管の定量的評価と両方生体外でそして生体内の血管モデルを改善するため、いくつかの試みをなされました。ただし、標準的な方法はこの非常にダイナミックなプロセスの多くの側面をキャプチャに失敗した静的な測定とスコープで制限されます。したがって、この新しいプロトコルの開発の目的はネットワークの形成と安定化の率を量的に表わすだけでなく、血管の基になる潜在的なメカニズムに洞察力を提供するための in vitro血管の動態を評価するためにだった機能不全。このプロトコルのアプリケーションは、胎児の血管内皮コロニー母体糖尿病細胞 (ECFCs) を形成を使用して示されています。胎児 ECFCs いた生後の臍帯血から派生した、培養、および彼らが受けた血管基底膜マトリックスを含むスライドでメッキします。15 時間以上時間経過の位相差顕微鏡を使用してスライド全体の井戸の画像に買収されました。画像を血管運動解析 (KAV) と呼ばれる解析ソフトウェアを用いた定量的データの導出を行った。KAV のネットワーク構造を含む (9 測定、計算 1) 10 のパラメーターを取得するマルチ時間点位相コントラスト画像のスタックからネットワーク コンポーネントを分析する白骨化に続いて画像セグメンテーションを使用して: ネットワーク、ネットワーク エリアを閉じるノード、枝、総支部長、平均分岐の長さ、トリプル分岐ノード、クワッド分岐ノード、ネットワーク構造、およびノードの比に分岐。このプロトコルを特定のアプリケーションは、糖尿病合併妊娠から得られる ECFCs における血管発生の率を変更しました。ただし、この手法はここで報告範囲を越えて広範な影響を持っています。このアプローチの実装機構評価を強化し、血管と多数の細胞の種類や病気の状態の他の重要な生物学的分岐プロセス リードアウト機能を向上させます。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血管内皮前駆細胞の血管、またはde novoの血管の形成を受ける能力開発1の間に胚の血管系を確立することに重要です。また、さらに血管形成と血管新生として知られている既存の血管の成熟はまた開発と生後血流量と体2全体の恒常性を維持するために重要なプロセスです。体内のすべての臓器、血管系廃棄物3の除去、酸素や栄養素の配達のために依存します。血管の形成と修復が不足または過剰のように血管の恒常性が維持されていない場合、血管疾患は4になります。したがって、血管形成と適応がよく検討と臓器の健康の維持に欠かせない多くの病的状態の開発に関与しています。

血管システム開発だけでなく、病気の症状や進行の関与の高められた理解のための試金は、モデル血管発生と血管新生体外と体内5 に開発されています。 ,6,7。血管の形成のモデリング メッキ血管細胞、内皮細胞、基底膜マトリックス細胞組織と血管ネットワーク8,9,10の形成を促進するなどが含まれます。通常、次は一晩培養、細胞解析11,12,13の画像の小さい数で、その結果、単一の時点でネットワークがキャプチャの画像です。したがって、分析アプローチが主を開発し、単一の時間ポイントの評価10,14用に最適化します。ただし、静的解析は単に血管の形成の動的過程をキャプチャで十分ではない、限られた潜在的なメカニズムの洞察を提供します。イメージング周波数の増加可能性があります形成速度を識別するために必要なデータを提供する、非効率的な労働集約的な14アプローチをイメージング マルチ時間まで開発済みの分析のアプリケーションがあります。さらに、市販の分析法の開発、にもかかわらずイメージ毎の支払料金オプションをレンダリングしますこのコストが数千ものイメージに生成された15の速度論のため。したがって、キャプチャし血管の in vitroなどコマ撮りの生細胞顕微鏡検査によって生成される大きな画像セットを分析する能力を定量化する合理的で効率的なアプローチの分野で必要性があります。

これらの制限を克服するために新しいアプローチは単一の時間ポイント イメージング画像で血管のダイナミック ・ アセスメントを有効に取得すべて 15 分16拡大を目的として開発されました。数時間にわたって複数の時間ポイントをキャプチャ、このアプローチは、形成と血管ネットワークの維持に貢献する潜在的なメカニズムに洞察力と同様、血管、プロセスのより詳細な描写を提供します。周波数と画像の品質を向上、に加えては、このアプローチにはオープン ソースのプラグイン17の形で斬新なソフトウェアが組み込まれています。速度論的解析の血管 (KAV)、呼ばれるソフトウェアは、画像処理と解析用マルチ時間ポイント買収から生成される大きな画像セットが組み込まれた合理化されたアプリケーションです。KAV は、白骨化18続いて領域分割による位相コントラスト画像を分析します。ネットワーク構造の 10 個のパラメーターは、KAV により定量化されていますを含む: 枝、閉域ネットワーク、ノード、ネットワーク エリア、ネットワーク構造、トリプル分岐ノード、ノードのクワッド分岐、総支部長、平均支店長およびノード比 (を参照してくださいに分岐図 1の模式図)16。KAV アプローチの適用には、小説、計算された表現型in vitro血管、ノード比支店と呼ばれるにはが含まれています。私たちの最近の仕事は、この比率はネットワーク接続を示すと運動16などのネットワーク形成に関与する他の細胞プロセスと関連付けられるかもしれないことを示した。

胎児内皮細胞コロニー形成細胞 (ECFC) 血管は、これらの研究で評価されたが、血管や血管新生を受ける細胞の種類を評価するこの画像集録および解析方法を容易に適用できます。さらに、このアプローチは、これらの研究に示すように、妊娠糖尿病などの病的状態の様々 な起因変更された血管機能を識別するために使用できます。さらに、このメソッドは、他の関連する生物学的プロセスに重要なネットワークの形成と、分岐を評価するために合わせることができます。したがって、ユニークな生物学的システムにこの手法を適用することの潜在的な影響はまだ未定です。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 準備

  1. 培養内皮細胞のコロニー形成細胞 (ECFCs)
    注: これらの実験で使用される胎児 ECFC サンプルされた臍帯血から分離したし、前述6としてインディアナ大学医学部でアンギオ ビアコア (ABC) で培養します。前述の19,20,21として内皮細胞抗原の発現を確認する ABC 内で日常の品質管理の表現型解析を行った。サンプルで実験使用された最小継代 (2-3 回)。ティッシュ文化フードのすべての培養作業を行った。組織培養プレートとソリューションを含むすべての試薬が滅菌されました。
    1. 2 日前の実験では, 100 mm 6 ml 0.05 mg/mL タイプ 1 コラーゲンの組織培養プレート丸棒をコート、37 ° C で一晩インキュベートします。
      注: タイプ 1 コラーゲンは 0.05 mg/mL の作業濃度に 20 nM の酢酸を含む二重蒸留水で希釈しました。
    2. 実験では, 前日の trypsinize し、1.1.1 でタイプ 1 コラーゲンをコーティングしたプレートに ECFCs を replate します。(ご注意下 1.1)。
    3. ECFCs を trypsinize、めっきされたセルからメディアを吸引し、7 mL の PBS で洗浄します。PBS を吸引し、0.5% トリプシンの 2-3 mL を追加し、37 ° C で 2-5 分のための細胞を孵化させなさい
    4. トリプシン、インキュベーションの直後に、EGM2 とピペットを上下すべての付着性細胞を取り除くための 3 mL を追加します。細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送します。
    5. 室温で 5 分間 500 x g ですべてのサンプルを遠心します。
    6. 上清を吸引し、再 EGM2 の 1-2 mL の細胞ペレットを中断します。細胞懸濁液を混和し、カウントのための小さい因数 (20-40 μ L) を削除します。
    7. 因数のセルに等しい部品トリパン ブルーを追加し、診断に 10 μ L をピペットします。検定の主な 4 つの象限内のセルの数をカウントします。
      注: は、精度を高めるためすべてのサンプル数の検定の両側を使用します。
    8. 1.1.1 7 mL の PBS で 2 回のステップで準備されたコラーゲン塗布培養プレートを洗います。内皮細胞成長培地 2 (EGM2) 10 mL を追加、2 番目の PBS 洗浄後培地プレートに 10% 牛胎児血清の文化.
    9. 1.1.7 の手順で、セル数を用いて、プレート 4 x 105セルに必要な細胞懸濁液の量を計算します。プレート 4 x 105 ECFCs 組織培養プレート上 1.1.8 の手順で準備し、37 ° C、5% 二酸化炭素 (CO2) 一晩インキュベートします。
  2. 実験前に保存用品では 4 °C の一夜
    1. 3"× 2" の金属プレート、スライド (フードで開くまでパッケージしてください)、滅菌 20 1 マイクロリットル (μ L) のヒント、および基底膜マトリックス (行列) のボックスを保存します。
      注: マトリックスは長期的なストレージの-80 ° C に保たれて一晩、またはいくつかの時間を使用する前に常に 4 ° C でそれを解凍します。
  3. コンピューターのハード ドライブ上の画像のための十分な容量の可用性を確認します。
    注: は、この議定書に記載されている構成を使用して、約 60 ギガバイト (GB) 容量の実験 (4 GB/ウェル) あたり必要があります。ただし、容量の見積もりはハードウェア構成に基づいています、システムごとに決定する必要があります。

2. プロトコル 1: 実験装置: スライドの準備

  1. 収集し、供給を準備
    1. 実験の日は、氷、ドライアイスの小さい容器、はさみ、20 μ L ピペットのバケットを含むスライドのセルをメッキの消耗品を収集します。すべてのアイテムを 70% エタノール スプレー、ペーパー タオルで拭いて乾かして、滅菌のティッシュ文化フードにアイテムを配置します。
    2. 4 ° C で保存すべての消耗品を収集 (ステップ 1.2 参照) 金属板、ヒント、スライド、およびマトリックスのボックスを含みます。ヒントのボックスを 70% エタノール スプレーし、ドライアイスのコンテナーにボックスを配置します。
      注: 削除行列から 4 ° C の冷蔵庫を使用して氷の行列は常に準備ができている場合にのみ。
    3. 70% エタノールに金属板をスプレー、氷のバケツに氷に埋め込むこと。スライドを含むパッケージを開き、それを冷たい保つために金属板にスライドを配置します。
  2. 負荷行列をスライドに
    1. 10 μ L をピペットを設定し、ピペットとコールド チップ ボックスからヒントを削除します。はさみで先端の端から約 1 cm を切る。
      注: マトリックス中の気泡を抑えるヒントに垂直カット。ピペット設定できますボリュームに先端の内側に付着するマトリックスを考慮する 10 μ L よりも若干大きい。
    2. ゆっくりピペット チップにマトリックスを描画します。井戸の中心にピペット チップをすぐに配置します。井戸の底にピペット チップをそっと触れるし、ゆっくりと行列を押し出します。
      注: はないピペット、以上これ原因になりますフォームに泡。バブル形成された場合はすぐに小ねたを使用してポップします。
    3. スライドには、15 の個々 の井戸が含まれています。各井戸の前の手順を繰り返します。一貫性を維持し、先端内部固化行列を減らす各ウェルの新しいピペット チップを使用します。
    4. マトリックスを含むすべての井戸でスライドが読み込まれると、スライドにふたを押すし、マトリックスが固化するまでに 30-60 分の 37 ° C で孵化させなさい。
      注: 乾くマトリックスをてはいけないです。PBS のマトリックスの乾燥のリスクを軽減するインキュベーターでスライドの近く 50 mL コニカル チューブのキャップに少量 (2-3 mL) を追加します。

3. プロトコル 2: めっきマトリックスの ECFCs

  1. 組織培養皿から付着 ECFCs を外し、懸濁液の収集
    1. 組織培養プレート、ECFCs を含むメッキ前の日 (セクション 1.1.9 参照) を取得します。EGM2 メディアを吸引し、付着 ECFCs 7 mL の PBS で 1 回洗浄します。
    2. PBS を吸引、トリプシンの 2-3 mL を追加し、37 ° C で 2-5 分の付着性のセルを孵化させなさい
    3. インキュベーションの直後に、EGM2 とピペットを上下すべての付着性細胞を取り除くための 3 mL を追加します。細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送します。
    4. 懸濁液のすべての 4 つのセルのサンプルが収集されるまで残り 3 つ ECFC サンプルの手順 3.1.1-3.1.3 を繰り返します。
  2. マスター ミックスを準備します。
    1. 室温で 5 分間 500 x g ですべてのサンプルを遠心します。
    2. 上清を吸引し、再 EGM2 の 1-2 mL の細胞ペレットを中断します。
    3. 細胞懸濁液を混和し、カウントのための小さい因数 (20-40 μ L) を削除します。
    4. 因数のセルに等しい部品トリパン ブルーを追加し、診断に 10 μ L をピペットします。検定の主な 4 つの象限内のセルの数をカウントします。
      注: は、精度を高めるためすべてのサンプル数の検定の両側を使用します。
    5. 上から数えるセルを使用して、1.4x104セルが含まれている各セルのサンプル量を計算します。すべての細胞懸濁液を混和、実験条件ごとにマスター ミックスを調製する新鮮なチューブに 10 の4セル分注 1.4。EGM2 メディアを追加すると、各マスター ミックスの最終巻、175 μ L。
    6. スライド上の個々 の井戸にマスター ミックスの軽くピペッティングと分注 50 μ l 各マスター ミックスをミックスします。
      注: すべてのサンプルを 3 井戸の十分な量を確保するため 3.5 井戸の計算マスター ミックスと 3 通、めっき。
  3. スライドを孵化させなさい
    1. イメージングのための顕微鏡室に移動できるまでは、37 ° C でスライドを孵化させなさい。
      注: めっきおよびイメージ投射の間の時間は血管の初期段階中にデータの損失を制限する限り簡単にはずです。

4. プロトコル 3: 顕微鏡のセットアップと画像の取得

注: 我々 の研究プロトコル 2 と 3 によって実施された同時に別々 の個人。プロトコル 2 と 3 は、同じ個人によって完了する必要があります、プロトコル 3 手順 4.1 と 4.2 以下上記プロトコル 2 を開始する前に完了する必要があります。

  1. 顕微鏡とコンピューターをオンに
    1. 実験を開始する前に約 1 〜 2 時間を入れますと 37 ° c ステージ トップ インキュベーターを予熱、CO2を 5% に設定し、湿度を 85% に設定。空の場合は、インキュベーターの湿度貯蔵所を入力します。
    2. 1 つ、2 つのオープン ポジションの空腔症スライドを置き、蒸留水で埋めます。利用可能な場合は、室内温度制御のフィードバックの温度計を保護します。
      注: フィードバックの温度計が利用可能な場合、使用してこの「インキュベーター温度」商工会議所が平衡するいることを確認しますします。
    3. 二次送風機のスライドを下から加熱すると結露を最小限に抑える 39-42 ° C に設定をオンにします。
    4. 実験のスライドを追加することができますまで、空白として 2 番目のスライドを追加します。このスライドは、セットアップ中に個々 の井戸の画像集録設定の構成の場所のプレース ホルダーとして機能します。
    5. イメージングの実験中に条件を模倣する 2 番目のスライドに井戸を囲む貯水池に水を追加します。周辺の井戸水は、顕微鏡のセットアップと予熱の間に湿度の評価できます。
      注: ステージ上のインキュベーターと二次送風機の前の平衡安定した培養環境を維持するために重要です。ほとんど生細胞室内コント ローラーは、2、およびシステムの準備状況を評価するために湿度、温度、CO のリアルタイムのフィードバックを与えます。続行する前にスライドの湿気の蓄積と 4.1.5 満たされて、貯留層の過剰な乾燥をチェックします。湿度は、過剰な乾燥や室内の結露がある場合に調整する必要があります。湿度を上げるには、蒸留水で湿ったワイプを追加します。結露を減らすには、4.1.1 で調整、湿度の設定を減少または凝縮低温の徴候である可能性があります、室内温度設定し、二次送風機の位置決めを確認します。
  2. 平衡の中に基本的な画像の取得設定を構成します。
    注: 画像は、ステージ、シャッター、およびカメラ制御ソフトウェアで構成されます。多次元セットアップ ツールは、ソフトウェアを構成する最も簡単な方法です。さらに、ソフトウェアは、オート フォーカス フォーカス制御実験の期間を確保するためのルーチンを持っている必要があります。
    1. ソフトウェアを使用すると、各ウェルの複数の段階の位置を設定します。このプロトコルでは、井戸のセンターを選択します。
    2. 各ステージ位置でよく全体がイメージは、画像集録を構成します。たとえば、10-20% 画像重複とカメラと最終倍率に応じて、約 5 × 5 のフィールド、tilescan を使用します。
    3. 15 分毎のイメージングのための時間の経過を構成します。
      注: は、この議定書に記載されている構成を使用して、スライドのすべての 15 の井戸は 15 分間隔内で作成されます。
  3. 実験のスライドをロードします。
    1. 次のインキュベーター室の平衡、白紙のスライドを実験のスライドに置き換えます。
      注: 安定した温度、CO2、および少なくとも 20 分湿度釣合いの商工会議所があります。実験的スライド準備ができたら、手順が完了しているすぐに「死んだ時間」を最小限に抑えるためめっきと顕微鏡で撮影した最初の時点が不可欠です。さらに、イメージング実験の比較を容易にするために今回は一貫しているべきです。これらの実験プロトコル 3 セクション 4.3 で概説したすべての手順を完了する約 30 分が必要。
    2. スライド蓋を削除し、スライドに井戸を囲む貯水池に水を追加します。
      注: 蓋を外してイメージング実験の持続期間のため。
  4. 最終的なイメージの取得の設定を構成します。
    1. CFI 計画蛍光 DL 10 × 対物を所定の位置にし、コンデンサーの Ph1 位相リングを選択します。フォーカスの最初の井戸、ケーラー照明用透過光パスの調整し、客観的位相マスクのコンデンサーの位相リングの配置をチェックすることによって位相光学系を構成します。
    2. 露光時間を構成し、位相コントラストは、500 ms 以下は、通常のランプの明るさを調整します。
    3. 4.2.1 で各ステージの位置の設定を循環し、必要に応じて井戸の中心が選択されていると、それを調整することを確認します。
    4. 各ステージ位置で井戸のメッキおよびイメージング ソフトウェアの使用ステージ位置の z 位置を設定のセルに焦点を当てます。
    5. 顕微鏡用オート フォーカス機構をテストします。オート フォーカスがハードウェア ベースの場合にあり、すべての段階の位置の位置が正しくを確認します。
      注: 標本やステージは、実験中に垂直方向にドリフトが、ソフトウェアが各ステージの位置と時間コース中に信頼性の高い画像を確保するためのすべての時点でオート フォーカスをチェックすることが重要です。可能であれば、以前の時点で決定したオート フォーカスの位置は、その後オート フォーカス ルーチンの開始点として使用ください。この方法にドリフトすることができます調整の簡単。
    6. 削減または顕微鏡部屋の照明を消すし、イメージングの実験を開始します。

5. プロトコル 4: 画像の血管 (KAV) の処理・動力学的解析

  1. 各ウェルの画像のスタックとして個々 の時点から画像を保存します。
    注:イメージをキャプチャするほとんどのソフトウェアは、時系列のマルチページ tiff (スタック) をエクスポートできます。KAV は、複数時間ポイントを含むデータセット上で動作する設計されています。したがって、分析は、与えられたステージ位置の全体画像のスタックで発生します。必要な場合、画像処理ソフトウェアは、画像のスタックを再構築するには、各時間ポイントから単一イメージをインポートできます。
  2. 画像処理、コンピューター上のソフトウェアを開く
  3. 画像処理ソフトに KAV を追加します。
    1. KAV ファイルをフォルダーからソフトウェアのウィンドウの下部に灰色のバーにドラッグします。一覧にソフトウェアを追加して「保存」をクリックします。
  4. 分析対象とする画像のスタックを開く
    1. クリックして 'ファイル'、'' 画像処理ソフトウェア、またはステップ 5.3.1 のように灰色のバーにドラッグ イメージ ファイルのドロップダウン メニューを開きます。
    2. '画像'、'Type'、'8 bit' をクリックして、画像を 8 ビットに変換します。
  5. 利益 (率 ROI) の領域を作成します。
    1. [分析] をクリックしてツール バーで ROI マネージャーを開きます。'ツール' 'ROI マネージャー' によってを選択します。
    2. 新しい投資収益率を作成するには、ツールバーの円または四角形の選択ツールをクリックし、画像を選択領域の描画します。その図形を保存する ROI マネージャー] ウィンドウで「追加」をクリックします。
      注: 以前に作成した投資収益率は、保存・ ロワ (圧縮フォルダー) をドラッグしてマネージャーで開く 'ドラッグ アンド ドロップ' バーに開くことができます。
    3. 画像での表示に ROI マネージャーに表示される ROI のラベルをクリックします。
      注: 投資収益率は、画像に表示されません、2 番目の ROI (任意のサイズ/形状) を作成し、マネージャーに追加します。両方を前後 2 つのクリックして・ ロワは、リストに表示され、目的の投資収益率は、画像に表示されます。
    4. 必要な場合は、投資収益率を合わせます。投資収益率は、目的の場所にイメージ上には、一度メニューに移動し、'編集'、' 明確な外 ' をクリックします。これは、スタック内の各イメージの投資収益率 (非長方形の図形に便利) 外部画像データが削除されます。
      注: 矩形形状の投資収益率を使用している場合、'画像'、'収穫' をクリックしてまた。
  6. KAV ソフトウェアを実行します。
    1. メニュー バーの 'プラグイン' をクリックします。
    2. 分析ネットワーク選択プラグイン。プラグインの設定を変更するオプションを含むウィンドウが表示されます。
    3. ドロップダウン矢印を使用してしきい値選定法を変更します。
    4. すべての適切な設定を選択すると、ソフトウェアの処理を開始する [OK] をクリックします。
      注: 適切な設定は、識別し、細胞および位相コントラストの背景からネットワークを識別するソフトウェアの精度の指標である KAV、によって生成されたスケルトンとマスク レンディションの可視化によって決定されます。
  7. KAV で生成されたデータを保存します。
    1. プラグインは、解析が完了すると 2 つのウィンドウが数値とスケルトンとマスクのレンディションを描いた融合画像のスタックのデータ テーブルを含む画面にポップアップされます。
    2. データ テーブルの左上隅に移動して数値を保存し、クリックすると '編集'、'コピー' または 'カット' excel スプレッドシートに値を貼り付けます。
    3. 融合スケルトンとマスク画像をクリックします。ファイルをクリックして '、' ' Save As' 'TIFF' タグ付きイメージ ファイルの形式 (TIFF) ファイルとして融合スケルトン/マスク画像のスタックを保存します。
    4. トリミングの位相を保存 'ファイル' ' Save As' 'TIFF' をクリックして画像のスタック (ROI を使って作成)
    5. ROI マネージャー ウィンドウをクリックし、画像をトリミングに使用される投資収益率を選択します。将来の使用のための ROI を保存する '保存' に続いて 'より' をクリックします。
      注: は同じ ROI を使用して解析一貫性を保つ役立ちます。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KAV は、ネットワーク構造の視覚的な表現を生成します。
KAV セル固有の構造を識別するために、ECFCs と位相コントラスト画像のマトリックスの背景のコントラストができます。KAV で識別される ECFC ネットワークは定量化 (図 2A) のソフトウェアによって使用される構造を説明するために絵の骨格とマスクのレンディションとして表されます。重要なは、スケルトンとマスクのレンディションの定性的な評価は KAV 感度と最適閾値設定を決定および解析結果の解釈に便利することができます精度の迅速同定できます。KAV は正確に位相差画像と KAV で生成されたスケルトンとマスク レンディション (図 2の類似性によって示されるように ECFC ネットワークを識別する位相コントラスト画像の質が高いと、十分なコントラストを実現Aとビデオ 1)。

または、高コントラストおよび/またはイメージング グリッド化が発生するなどの工芸品、位相コントラスト画像はありません、ネットワーク検出精度は低下し、成果になるあいまいな (図 2B)。さらに、携帯メディア内の空気の泡の形成も検出精度 (図 2) を隠すことが。ただし、画質に問題は、KAV のソフトウェアに含まれている異なるしきい値選定法の選択によって多くの場合克服できます。たとえば、図 2Bの位相コントラスト画像をしきい値選定法を除いて同一の画像処理設定を使用して行った。スケルトンとマスクのレンディションから大津閾値が位相コントラスト (図 2B) に示す ECFC ネットワークのより正確な検出で起因した明白であります。したがって、画質は、このアッセイで正確で意味のある結果を達成するために重要です。ただし、KAV ユーザー インターフェイスに含まれる異なるしきい値選定法は、入力画像の品質に基づく画像解析の調整を許可します。

微速度顕微鏡観察が子宮内妊娠糖尿病曝露 ECFC 血管の定性的および定量的な違いを識別します。
最近、KAV 分析手法は、胎児 ECFC 関数16子宮内で母体タイプ 2 糖尿病 (2 型糖尿病) に曝露を評価するために適用しました。KAV を使用して、血管の変化の速度は 2 型糖尿病にさらされている胎児の ECFCs で識別されました。しかし、2 型糖尿病だけでなく全体の妊娠、妊娠糖尿病 (GDM)、または妊娠の第 3 学期の一般的耐糖能異常の開発時に発生する、露出も ECFC 関数13を損ないます。したがって、KAV は、GDM 公開 ECFCs ECFC ネットワーク形成の変化速度も表示するかどうか決定に適用されました。フェーズ 1 (0-5 h) とフェーズ 2 (の 5 + h) は時間を使用して評価された経過顕微鏡と相まって KAV 分析 (図 3)。代表的な位相コントラスト画像画像集録 (0.50 h) の開始で取得し、時間コース (5.00 と 10.00 h) を通して描く ECFC ネットワーク形成実験一日 (図 3およびビデオ 1 からテスト 4 つのサンプル).対応するセル読み込み、0.50 時間位相コントラスト画像にみられるように、にもかかわらずネットワーク構造の質的な違いと 5.00 10.00 時間時点で明白であります。合併症を伴わない妊娠 (UC) から ECFCs は、5 時間後メッキ、私たち以前に公開されたデータの16のように複雑で入り組んだネットワークを形成します。逆に、GDM から ECFCs サンプル 1 の (GDM1) フォームが非常に少数のネットワーク相互接続されていない構造です。ただし、このパターンは、GDM の妊娠、サンプル間の不均一性を示すすべて ECFC 試料では反映されません。サンプル GDM2 と GDM3 接続のパターンが UC のサンプルと比較してに変更されて表示されるが、GDM1 と比較して大きいネットワーク形成を表示します。重要なは、KAV ECFC ネットワーク明白な微妙な表現型を識別するためにいくつかの部品を測定します。

ネットワーク構造の骨格とマスクのレンディションを生成に加えて KAV quantitates 個々 のネットワーク構造のノード、トリプル分岐ノード、四分岐ノード、枝、合計数を含む、ネットワーク構造の 10 の指標支店長、平均分岐の長さ、終了ノードの比率、総支店網、ネットワーク エリア16。KAV は、時間のコースのすべてのイメージの値の単一のテーブルに各サンプルのデータをコンパイルします。表 1には、ECFC サンプルで 1 つ 1 つのイメージング研究から代表の生データが含まれています。KAV を用いてネットワーク構造のパラメーターは列にまとめられて、時間をかけて得た時系列画像のデータが行に整理されます。30 分後めっきされて収集によって生成されたすべての 15 分の Raw 値以降の画像が得られた例では、私たちの研究では、画像 1 の KAV をグラフに表示することができます、または16に近づく複雑な統計を使用して更に分析。

1 つの単純なサンプル (UC) と 3 つの GDM のサンプル (図 4) の 3 つの独立した実験からネットワーク構造の平均値を描いた 5 つのグラフが表示されます。これらの実験は、以前と同様に実行で UC サンプル分析 UC サンプル16です。以前は、ECFC 血管体外bi 一過性のフェーズ 1 (0 - 5 h) から成るが、フェーズ 2 (5-10 h)16ことが分かった。このパターンは、閉じられたネットワーク データ (図 4) を描いたグラフで明らかなように現在の研究で一貫してです。UC のサンプルは、GDM のサンプルのすべての 3 つを比較しての閉域ネットワークの大きい数を形成しました。興味深いことに、4 つのサンプルの 3 つは 2.5 と 3 時間の間に発生する閉域ネットワークの最大数に類似した時間が表示されます。ただし、GDM2 サンプル発生 5 時間後めっき最大の閉域ネットワークに到達するために遅かった。そして、UC のサンプルと比較して少ない最大ネットワークを形成 GDM2 サンプル、にもかかわらずネットワークを形成維持された同様に UC のサンプルに時間をかけて。逆に、GDM1 と UC のサンプルと比較して少ないネットワークを形作った GDM3 も時間の経過とともにネットワーク番号の全体的な減少を展示しました。全体的にみて、閉じられたネットワーク番号を描いたグラフから明らかだネットワーク形成の bi, パターンをすべて ECFC サンプルに表示形成率および達成のネットワークの最大の数のサンプルの間で異なるしかし。

ネットワーク地域は、ECFCs によって形成される閉じたネットワーク内で平均領域を表します。したがってより閉じたネットワーク番号、小さいネットワーク エリア。このパターンは、多数の閉域ネットワークの形成、UC のサンプルが 3 つの GDM のサンプル (図 4) と比較して時間をかけて小さいネットワーク領域を持っていたネットワーク領域グラフに反映されます。最大の閉域ネットワークをもっとゆっくりに達した GDM2 展示当初高ネットワーク エリア、15 時間で UC サンプルに最も類似していたしかし地域は時間とこれ以上安定します。時間をかけて、すべてのサンプルの平均ネットワーク エリアはネットワーク解消安定化により増加しました。ただし、GDM1 と GDM3 のようないくつかのサンプル展示はより漸進的な増加を示すその他のサンプルと比較して減少安定性の可能性を示すネットワーク領域のより急速な増加です。

GDM 公開 ECFCs 展示削減ネットワークの安定性
ノードに分岐の比率は KAV によって計算され、我々 の以前の研究で識別される新しい表現型、ネットワーク接続16を示す。現在の研究では、UC サンプルは、時間 (図 4) が維持されたネットワーク接続の高レベルを代表する低比を持っていた。逆に、3 つの GDM サンプル ネットワーク形成のフェーズ 2 で特にノードに分岐の比率が高かったがあった。この観測は、減の接続とネットワーク構造の解消安定化を示しています。

全体的にみて、少数のノードと分岐の実験の経過を維持削減とその他のサンプルと比較して GDM1 が形成されます。GDM2 と GDM3 形成され 5-15 h、特に間、UC の例と比べると枝の大きい数を維持しました。GDM2 GDM3 ネットワークで検出されたノードの数 10-15 h、特に間、UC サンプル内のノードの数に類似していた。枝の大きい数が、ノード数が類似を説明できるノード比増加支店 GDM のサンプルの後の時点で明らか。重要なは、分岐とノード番号の同時変更は別のグラフの解釈が困難にすることができます。ただし、ノード比新規ブランチは、変更された、ネットワーク接続にどのように個々 のグラフの分枝・節数に見つけにくいわずかな変更を含む変更の結果を評価する方法を提供しています。

figure-results-1
図 1: 回路図 10 パラメーターの定量化による速度論的解析の血管 (KAV) をアウトライン表示します。KAV は、ネットワーク構造の 10 個のパラメーターを quantitates します。すべてのパラメーターは、色分けし、回路図に記載されている数値 (1-10)。枝 (緑、1)、閉じたネットワーク (青、2) の数やノード (赤、3) のネットワーク領域 (オレンジ、4)、ネットワーク構造 (黒、5)、トリプル分岐ノード (黄色、6)、およびクワッド分岐ノード (紫、7) の数の平均、パラメーターだけでなく(9) の合計と平均 (10) 支店長とノード (10) の数と枝数の比率。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-2
図 2: 血管運動解析 (KAV) quantitates ネットワーク構造。位相コントラストの画像を提供を識別して定量化 KAV によってネットワーク構造の視覚的表現を用いた KAV で識別されるネットワーク構造の骨格とマスクのレンディションを (A)。スケール バー = 500 μ m。 (B) 個々 の画像を一緒にステッチから、低コントラストとグリッド ECFC ネットワークの 10 h 後めっきの代表的な位相差画像をマーク。意味や大津市などの異なるしきい値選定法は、位相コントラスト画像が低コントラストを持っている場合、またはデータが発生した場合、定量精度を向上させるプラグインの KAV で選択できます。平均と大津のしきい値選定法の位相コントラストのスケルトンとマスクのレンディションが表示されます。位相コントラスト画像は、対物レンズ 10 倍を使用してキャプチャされました。スケール バー = 500 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 3: 子宮内 GDM 露出変更 ECFC ネットワーク形成します。ECFC ネットワーク形成のイメージは、位相差顕微鏡による 15 時間 15 分間隔でキャプチャされました。UC と GDM の 3 つのサンプルのため (0.5 h) をめっきの時刻に開始 5 時間ずつ代表的な位相コントラスト画像のとおりです。位相コントラスト画像は、対物レンズ 10 倍を使用してキャプチャされました。スケール バー = 500 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-4
図 4: 子宮内 GDM 展示変更ネットワーク形成過程にさらされて ECFCs です。ECFCs は、合併症を伴わない妊娠 (UC、黒) と 3 回の妊娠が妊娠糖尿病 (GDM 1-3、赤) が複雑にから得られました。位相コントラスト画像は 15 分間隔 15 h 量的に表わされる血管運動解析 (KAV) ソフトウェアを閉じたネットワーク、ネットワーク領域、枝、ノード、およびノードに分岐の比率で捕獲されました。示されているデータは、各サンプルの 3 つの独立した実験の平均 (SEM) の平均 ± 標準誤差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-5
ビデオ 1:子宮内 GDM 露出変更 ECFC ネットワーク形成のカイネティクス。ECFC ネットワーク形成のイメージは、位相差顕微鏡による 15 時間 15 分間隔でキャプチャされました。UC と 3 つの GDM サンプル 0.5 h から 15 h 以上の位相コントラスト画像のとおりです。スケール バーを表します 500 μ m.してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)

イメージ総支部ネットワークノードトリプル4 倍に増加枝総支部長 *Avg 支店長 *ノード比支店閉域ネットワークネットワーク地域 * *
138229027811943472101243.259480214
22843453378940506991792.7216264469
32053763669910557282722.4227150621
416242240715947596923682.244098713
513245444112967619234692.135372951
612243541914907625875132.096856948
78842941117852639837271.997451429
86845143713874639609411.947451780
99343741718905609016552.074982919
10126511487241075619814922.137116857
1149397384127376182312621.867948805
1281376364107515681770126364431
1398509482261028607996202.024498056
149344941631909582826272.024594081
* 最も近いミクロンに丸められます * * 最も近いミクロンに丸められます ^2

表 1:ECFC サンプルで 1 つ 1 つの画像から代表的な raw データ研究します。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KAV を有効に複数の時間ポイントを持つ大規模なデータセットの評価
従来、体外血管の定量が単一、または少数の時間ポイント測定から成っていた。この静的なアプローチは単に十分なをキャプチャし、動的で複雑なプロセスを定量化です。したがって、この手法は、血管の動的なプロセスに関与する潜在的な分子メカニズムに洞察力を得るためにネットワーク形成の速度論解析の効率を有効に開発されました。効率化と自動化は、生成し、大量の画像データを分析する手法の開発に重要なコンポーネントです。KAV は、時間と時間経過のデータ セットからの生物学的意味のある結論を得るために必要な労働力を削減する画像の数百から成る大規模な画像のスタックを分析に特に開発されました。重要なは、KAV 画像処理を行い小 (100 より小さい画像) の秒の問題でデータ生成画像のスタックとの分より大きい (100 枚以上) 画像のスタックは、その結果、比類のない効率。また、時間と測定パラメーターによってスプレッドシートにデータ組織はグラフィカル表示と統計分析の急速な生成できます。

このアプローチの成功のアプリケーションにおける課題
このアッセイには、画像の取得と解析の両方に改善が含まれますが、いくつかの課題は、実装を成功を妨げる可能性があります。4 主な障害、湿度安定性、めっきから画像取得、ソフトウェアとハードウェアの信頼性、および各実験用に生成された大量のデータの管理のタイミング精度があります。数時間にわたって安定した生きているセルイメージ投射は挑戦することができます。具体的には、適切かつ一貫性のある加湿は、イメージングの部屋に必要です。血管新生のスライドは、行列に基づく血管新生アッセイを並列化に設計したこの試金で使用されます。少量、約 50 μ L に蒸発・凝縮拡張培養条件の重要な考慮事項。この実験の問題に対処するため、湿度を調節するインキュベーターを使用する必要は。ただし、イメージングの商工会議所の過剰な乾燥時間をかけて発生した場合、この規制を強化する必要があります。湿度を増加する最も簡単な方法は商工会議所の水面の面積を増加することがわかった。この目標を達成するために我々 のプロトコルは、次の 3 つの水の源を示唆している: 2 番目の腔症スライドはあふれた水には保育器の温度を測定、周辺井戸のスライドと接液フィルター紙の上に水またはワイプします。逆に、部屋の空気冷却は、スライドの下部スライドと井戸に凝縮してチャンバー内湿度と結露が発生します。この合併症は、セルのメディアや位相コントラストが低下するレンズ効果の希薄化につながります。これらの研究で結露は、スライドの下部に熱風 (39-42 ° C) のアプリケーションを介して最小化されました。

任意のコマ撮りに関する重要な考慮事項は、実験開始とイメージングとの整合性です。イメージングの開始時のタイミングは、ダウン ストリーム イベントの解釈にとって重要です。この試金のタイミング精度を確保するため、初期のめっきと最初の画像の時点の間の時間を厳密に管理する必要があります。実習では、この「死んだ時間」を最小限に抑えることができますしかし、もっと重大それは比較する別日に実験できるように一貫したする必要があります。例えば、このプロトコルでは、約 30 分のデッドタイムを期待します。実験準備、画像検査施設の近さによって、これを促進することができます。

世俗的な詳細のような一見ソフトウェア、ハードウェアの安定性、およびデータ管理の重要なものに思えるかもしれない。ソフトウェアや関連するハードウェア ドライバー、ネットワーク環境と自動化されたソフトウェアは、ソフトウェアの安定性に影響を与えるすべてを更新します。それは価値がある「ドライラン」ボトルネックと画像の取得に問題の潜在的なソースを識別するためにこのプロトコルをテストはたとえば、信頼性の低い生きているセルのセットアップ、ステージ、シャッター、およびカメラの信頼性、および自動化されたオペレーティング システムとソフトウェアの更新に、制度上の情報テクノロジー ・ ポリシーを確認します。

データ管理は、画像の数千に数百を生成する任意のイメージング実験の継続的な問題です。幸いなことに、商用ソフトウェアは、しばしばイメージング実験を開始する前に使用可能な領域をチェックします。しかし、このアッセイには後のキャプチャ画像処理と解析のハード ドライブ スペースの負担を追加でき、干渉イメージング実験、使用可能なスペースが限られている場合も含まれます。さらに、セキュリティと、コンピューターの安定性は保証できません、同じディスクの冗長アレイなどのハードウェア ソリューションとも。したがって、継続的な実験と、堅牢なリモート アーカイブ、例えば機関アーカイブ リソース、コンピューターのハード ドライブ上の領域を確保するためのデータ管理戦略が必要です。

画像の品質を最大化する戦略
KAV のマトリックスの背景から ECFCs を正確に見分ける能力は堅牢なのですが、アッセイの感度、画像の品質に依存します。たとえば、低コントラストの画像には、ソフトウェアが以下の精度 (図 2B) 細胞ネットワークを検出するように設定されます。位相コントラストの品質は、顕微鏡の画像を取得するために使用の設定を含むいくつかの要因によって影響を受ける分析の準備と、ウエル内でメディアのレベルのメンテナンス中のマトリックスとの細胞懸濁液媒体の読み込み全体画像。これらの試金のための位相コントラストを最適化するため、顕微鏡の位相リング アライメントの微調整はコントラストを改善するために行われました。さらに、試料は厳密に等しいと一貫性のあるメディアの読み込みを確認するテスト。マトリックスおよび/または井戸に読み込まれたメディアの量が最適な範囲の上または下の場合、メニスカスは変更された位相コントラストにつながるを形成できます。最後に、井戸の中の液体の少量のため、上述の蒸発・凝縮を最小化によるメディアのレベルを維持するために重要です。全体的にみて、アッセイ条件の最適化は、分析のための高品質コントラストの画像を生成する重要です。

位相コントラストの品質だけでなく他の要因はまたアッセイ結果メディア汚染を含むマトリックス、および粒子の不完全性またはマトリックスまたはメディアの破片を影響します。顕微鏡室で数時間にわたってライブセル イメージングを行うので、汚染はこの試金の危険です。汚染の危険性を減らすためには、マトリックス、細胞懸濁液は無菌フードのスライド上に読み込まれます。また、各サンプルは重複または不測の破片や粒子解析を交絡などによるデータ損失のリスクを最小限に抑えるために実験のため 3 通メッキ通常。

サンプルの不均一性ドライブは、増加のアッセイの感度の必要があります。
不均一性は、観察し、GDM13に公開されている ECFCs の前の研究で報告されています。これらのサンプルの観察細胞機能における多様性の高レベルは、母体の疾患の重症度、病気の期間、血糖値の抑制に使用管理スタイルを含むいくつかの要因に起因すると推測されます。重要なは、この分析方法は、GDM の妊娠からサンプルの機能的多様性による表現の違いを識別可能となった ECFC 動的範囲血管をキャプチャします。全体的にみて、これらの研究で使われるものなど、主な患者のサンプルの使用は、細胞株と比較して大きな変動を導入できます。トランスレーショナル研究機能の変動と複数のプライマリの動物や人間のサンプルを含むより大きい重点を置くとアッセイ感度検出および生物学的意味のある測定および結論の導出のために不可欠です。したがって、KAV はデータの質と量を向上させるようなアプローチの開発より堅牢な観察と結論するアッセイの体外血管発生と血管新生によって生成されます。さらに、これらのデータは次の GDM の胎児被曝を変更された ECFC 血管に貢献する分子メカニズムの将来の調査を促進します。

このアプローチの将来のアプリケーション
このメソッドは胎児 ECFC 血管評価の in vitro 、これらの研究に適用されますが、このアプローチの潜在的なアプリケーションはたくさんあります。この手法は、研究血管や血管新生のプロセスに参加する任意のセル人口を容易に実装できます。具体的には、本研究で示した個々 の細胞を研究に使用できますが、また、共培養システムに適用することができます。将来は、三次元 (3 D) モデルを評価するために二次元の in vitroアッセイを超えてこのアプローチの展開に有益ででしょう。3 D または体内モデル用同様に設計されたコマ撮り、マルチパラ メトリック分析アプローチ 2 次元で観測した場合通知 KAV の現在のバージョンは、3 D 画像データを量的に表わすために十分だろうが、体外より生物学的関連の設定での細胞機能はします。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者認めるルーシー ミラー、リアン ・ ヘルナンデス、博士デビッド ・ ハース、ブルターニュ Yeley (インディアナ大学医学部)、博士カレン ポロック、ジュリー mund-、マシューがリパス、エミリー シムズ (インディアナ大学サイモンがんセンター循環器ビアコア)ECFC サンプルを派生することで優秀なテクニカル サポート。著者はまたジャニス壁 (インディアナ大学医学部) と同様に、学術的な議論のため夫妻 Maureen A. ハリントン、エドワード ・ f ・ Srour、リチャード n. 日、メルヴィン ・ c. ユッダー マティアス A. クラウズ (インディアナ大学医学部) を認める管理をサポートします。すべての画像は、生物顕微鏡、インディアナ大学医学部のインディアナ ・ センターで行われました。この作品は、国立衛生研究所 (R01 HL094725、P30 CA82709 U10 HD063094) とライリー子供財団によって支えられました。さらに、この出版物できた部分的なサポートと国立心臓、肺、血液研究所の国立衛生研究所から賞 # T32 HL007910 の下で。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm組織培養プレートフィッシャー353003
15 mL円錐管フィッシャー1495949B
血管新生 15ウェルマイクロスライド同上81506
マトリゲルフィッシャー(コーニング)354234
EGM2 ミディアムロンザCC3162
ウシ胎児血清アトランタバイオロジカルズS11550
PSA 抗筋細胞、抗生物質フィッシャーMT30004C1EGM2培地500 mLボトルあたり5 mLを添加します。
Fisher (Corning)MT25052CIの 0.5% トリプシン/0.53 nM EDTA
。20 nM 酢酸 ddH2O で希釈し、最終濃度 0.05 mg/mL で使用します。
氷酢酸フィッシャーA38-212最終濃度20nMの1型コラーゲン溶液に使用されます。
Kim WipesFisher06-666
チャンバースライドIbidi80296このスライドは、イメージングチャンバー内の湿度を維持するために蒸留水で満たすことができます。
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)フィッシャー(Gibco)200120271倍溶液、pH 7.2
顕微鏡ニコンインスツルメンツMEA53100およびMEF55030対物レンズステージとの位相コントラストのためのPh1フェーズリングを含む電動TiE
Prior InstrumentsProScan IIその他のOKOlabおよびNikon Elements AR互換ステージは使用できます
対物ニコンインスツルメンツ93178CFI Plan Fluor DL 10X
カメラ浜松C11440-42UORCA フラッシュ 4.0LT
ステージブロワー精密制御N/Aこの商品は販売を終了しました。World Precision Instruments Stage-top Incubatorの Smart Air-Therm Heater (AIRTHERM-SMT-1W)
。OKOLabsH301BoldLine(2ポジションスライドホルダー、
ComputerHewlett-PackardZ620または同等の4コアIntel Xeonプロセッサ、>32 GB RAM、>2 TB RAID 10、nVidia Quadroグラフィックカードを含む 
Nikon ElementsソフトウェアNikon InstrumentsAR v 4.20ND Acquisitionは、Elementsソフトウェアの設定に使用する多次元セットアップツールです。
FIJI(ImageJ)ソフトウェアN / AN / Aフリー、オープンソースソフトウェア次のURLでオンラインにダウンロード:
https://imagej.net/Fiji/Downloads KAVプラグインN / AN / Aフリー、オープンソースソフトウェア次のURLでオンラインでダウンロード:https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis
HBSS Type 1 Collagen Fisher (Corning)354226 100 mg の液体、濃度範囲 3-4 mg/mL は、レンズ が含まれます

References

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